Введение к работе
Актуальность темы. Этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Вирус широко распространен в человеческой популяции. СПИД относится к особо опасным, медленно прогрессирующим болезням иммунной и центральной нервной системы (Tibayrenc M., 2010). К настоящему времени СПИД явился причиной смерти более 20 млн. человек (Gallo R.C., 2003). Сейчас в мире насчитывается не менее 34 млн. ВИЧ-инфицированных людей, что ставит ВИЧ-инфекцию в один ряд с самыми значительными пандемиями в человеческой истории (UNAIDS, 2011). Несмотря на усилия ВОЗ и правительств многих стран по профилактике и лечению СПИД, во многих регионах, в том числе и в России, наблюдается неуклонный рост заболеваемости.
ВИЧ инфицирует, прежде всего, клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки) и некоторые другие типы клеток, содержащие рецептор CD4. Инфицированные ВИЧ CD4+ Т-лимфоциты постепенно гибнут (Wainberg M.A.,2008; Etienne L., 2011). В результате этого субпопуляция CD4+ Т-лимфоцитов медленно сокращается и, вследствие этого, клеточный иммунитет снижается. По достижении критического уровня количества CD4+ Т-лимфоцитов организм становится восприимчивым к оппортунистическим инфекциям. В отсутствии высокоэффективной комплексной антиретро-вирусной терапии летальный исход наступает в течение 7-10 лет после инфицирования (Jaffar S., 2004).
Следует особо отметить тот факт, что цитомеголовирусная инфекция (ЦМВ-инфекция) является одной из основных причин заболеваемости и смертности у пациентов с нарушениями функций иммунной системой (Lin D.Y., 2002). Известно, что цитомегаловирусом (ЦМВ) инфицировано до 90% взрослого городского населения, однако у здоровых людей эта инфекция обычно протекает бессимптомно. При ослабленном иммунитете этот вирус представляет серьезную угрозу для жизни пациентов, особенно у больных СПИДом, реципиентов трансплантации органов, а также у новорожденных с врожденной ЦМВ инфекцией. ЦМВ способен проникать через плаценту и инфицировать плод, что ведет к мертворождению и врожденным уродствам (Pereira, L., 2011).
Анти-ЦМВ лекарственные средства, которые в настоящий момент используются в клинике для лечения ЦМВ-инфекции, включают ганцикловир, цидофовир и фоскарнет. Однако их использование в клинике сопровождается множеством нежелательных эффектов. В частности, эти препараты проявляют заметную токсичность, имеют низкую биодоступность и при длительной терапии возникают резистентные варианты вируса (Bedard, J., 1999).
Степень разработанности темы. На сегодняшний день, нет эффективного лекарственного средства, способного полностью удалить вирус из организма. Несмотря на то, что разработаны различные лекарственные препараты, которые позволяют продлить и улучшить качество жизни ВИЧ-инфицированных людей, ЦМВ инфекция остается серьезной проблемой для таких пациентов (Springer, K. L., 2004). Следует также подчеркнуть, что особо остро стоит проблема создания противовирусных средств, способных одновременно подавлять репродукцию различных вирусов, в частности ВИЧ-1 и ЦМВ. По этим причинам поиск новых высокоэффективных противовирусных средств является одной из важнейших и актуальных проблем современной фармации.
В настоящее время в комплексной терапии ВИЧ-инфекции и вызываемого ею синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) широко применяются не-нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) (Volberding P., 2013). Эти ингибиторы связываются с вирусным ферментом в гидрофобном «кармане», удаленном от активного центра обратной транскриптазы (ОТ) примерно на 10 . Однако, несмотря на достаточно интенсивный поиск ненуклеозидных ингибиторов репликации ВИЧ-1, данная проблема продолжает оставаться в ряду наиболее актуальных и значимых. Это связано с относительно высокой токсичностью препаратов, а также с высокой изменчивостью вируса, которая обуславливает появление лекарственно-устойчивых штаммов в ходе длительной терапии. В этой связи поиск новых противовирусных препаратов, эффективных как в отношении диких штаммов, так и в отношении клинически наиболее важных мутантных изолятов для лечения ВИЧ-инфекции и СПИД, является чрезвычайно актуальной задачей.
Цели и основные задачи исследования. Целью настоящего диссертационного исследования является разработка на основе производных урацила новых противовирусных агентов, эффективно ингибирующих репродукцию ВИЧ-1 и ЦМВ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать простой и эффективный метод синтеза хлорацетанилидов, являющегося исходным для синтеза 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1-ил)-N-фенилацетамидов;
разработать простые и эффективные методы синтеза 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1-ил)-N-фенилацетамидов и их изомерных аналогов – 2-(3-бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-N-фенилацетамидов;
разработать методы синтеза 1-циннамил-производных 3-бензилурацила – ряда соединений, содержащих при атомах азота несимметричные заместители;
разработать простой и эффективный метод синтеза 1-[-(фенокси)алкил]урацилов;
изучить физико-химические и спектральные свойства синтезированных соединений;
изучить противовирусную активность синтезированных соединений in vitro в отношении вирус-специфических ферментов и на клеточных культурах, на основе данных скрининга выявить основные закономерности структура-противовирусная активность.
Научная новизна. В результате проведенных исследований были открыты новые классы ненуклеозидных ингибиторов репродукции ВИЧ-1 и ЦМВ, в основе которых лежит ядро урацила.
Разработан новый способ синтеза хлорацетанилидов, отличающийся простотой и эффективностью от описанных в литературе методов.
Осуществлен синтез ранее не описанных в литературе 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1-ил)-N-фенилацетамидов и их изомерных аналогов – 2-(3-бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-N-фенилацетамидов, являющихся потенциальными анти-ВИЧ-1 и анти-ЦМВ агентами.
Синтезированы новые анти-ВИЧ-1 агенты – 1-циннамил-производные 3-бензилурацила.
Разработаны условия и осуществлен синтез 1-[-(фенокси)алкил]урацилов путем конденсации 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинов с 1-бром--(фенокси)алканами.
Обнаружено, что некоторые 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1-ил)-N-фенилацетамиды проявляют мощную анти-ЦМВ активность в культуре HEL клеток, в то время как их структурные изомеры – 2-(3-бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-N-фенилацетамиды активны в отношении ВИЧ-1 как в культуре МТ-4 клеток, так и в отношении ОТ ВИЧ-1.
Показано, соединения ряда 1-циннамил-3-бензилурацила являются эффективными ингибиторами репродукции ВИЧ-1 в культуре МТ-4 клеток и ОТ ВИЧ-1 как дикого типа, так и некоторых клинически важных мутантных вариантов ОТ. Кроме того, найдено, что соединения данного ряда проявляют заметную активность в отношении ЦМВ в культуре HEL клеток.
Найдено, что 1-[-(фенокси)алкил]-производные урацила являются мощными ингибиторами репродукции ЦМВ в культуре HEL клеток.
Теоретическая и практическая значимость. Все целевые соединения были исследованы в ФГБУН Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) (Москва) с целью выявления ингибиторной активности в отношении вирусного фермента обратной транкриптазы (ОТ) ВИЧ, и в Рега Институте Медицинских Исследований (Левен, Бельгия) для выявления противовирусной активности на клеточных культурах в отношении широкого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов.
На основании скрининга и обнаруженных закономерностей структура-активность в ряду новых производных урацила выявлены структуры, которые в ближайшем будущем могут послужить для дальнейшего дизайна соединений на основе урацила, обладающих мощной противовирусной активностью, с целью создания на их основе отечественных лекарственных средств для лечения ВИЧ-инфекции и СПИД, а также ЦМВ инфекции.
На основании результатов исследования составлено информационное письмо «Синтез и противовирусная активность N-бензилзамещенных урацилов и их аналогов» (протокол № 2 от 12.04.2013 г.), материалы которого внедрены Волжским политехническим институтом (филиалом) ФГБОУ ВПО «ВолгГТУ» для проведения научных исследований и синтезу новых соединений гетероциклического ряда студентами и аспирантами кафедры химии и общей химической технологии (акт внедрения от 14.05.2013 г.).
Результаты диссертационного исследования внедрены в ФГБУН Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва) для проведения научных исследований в лабораториях института (акт внедрения № 12312-9311 от 06.09.2013 г.), а так же включены в материалы лекций и используются в учебных и научно-исследовательских процессах кафедры общей и органической химии ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ РФ.
Методология и методы исследования. На основе тщательного анализа литературных данных о строении и закономерности структура-противовирусная активность ряда известных ННИОТ были выявлены структурные особенности данных соединений и разработана общая концепция создания новых ННИОТ. Опираясь на данную концепцию, определены этапы синтеза целевых соединений, целесообразность проведения которого подтверждена методом компьютерного моделирования с использованием пакета программ AutoDock Vina 1.1.2. Выбор оптимальных методов синтеза целевых соединений осуществлен в соответствии с поставленными задачами с учетом анализа источников релевантной научной литературы.
При проведении диссертационного исследования были использованы современные методы очистки и разделения сложных смесей, основанные на тонкослойной хроматографии с использованием пластин с закрепленным слоем сорбента и препаративной колоночной хроматографии. Для доказательства строения синтезированных целевых соединений использовались современные спектральные методы – 1Н и 13С ЯМР спектроскопия и различные варианты масс-спектрометрии, включающие методы электронного удара и масс-спектрометрию высокого разрешения.
Положения, выдвигаемые на защиту
1. Некоторые 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1-ил)-N-фенилацетамиды проявляют мощную высокоселективную анти-ЦМВ активность в культуре HEL клеток.
2. 2-(3-Бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-N-фенилацетамиды демонстрируют высокую активность в отношении ВИЧ-1 как в культуре МТ-4 клеток, так и в отношении ОТ ВИЧ-1.
3. 1-Циннамил-производные 3-бензилурацила являются эффективными ингибиторами репродукции ВИЧ-1 в культуре МТ-4 клеток и ОТ ВИЧ-1 как дикого типа, так и некоторых клинически важных мутантных вариантов ОТ, а также проявляют заметную ингибиторную анти-ЦМВ активность в культуре HEL клеток.
4. 1-[-(Фенокси)алкил]-производные урацила показывают мощную анти-ЦМВ активность в культуре HEL клеток.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследования определяется выбором методов, обеспечивающих получение надежных и однозначных результатов. Основные фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград 2012), ежегодных научных конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2011-2012). Материалы диссертационной работы отражены в 9 публикациях: 3 статьи в иностранных журналах, включенных в перечень ВАК, 4 статьи и 2 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице, состоит из введения, литературного обзора, 4 глав экспериментальных исследований, заключения, списка литературы. Работа иллюстрирована 40 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы включает 184 наименования, из которых 175 из иностранных источников.
![Синтез, свойства, биологическая активность N-гетериламидов [А]-оксокислот и продуктов их химических превращений](/i/i/4597/277637.png "Синтез, свойства, биологическая активность N-гетериламидов [А]-оксокислот и продуктов их химических превращений Мокин Павел Александрович")
