Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 11
1.1. Биологически активные вещества 11
1.2. Стратегия создания биологически активных веществ 12
1.3. Биологически активные вещества в ряду бензофуроксанов 15
1.4. Способы получения бензофуроксанов 22
1.4.1. Окисление ароматических о-нитроаминов 23
1.4.2. Термолиз ароматических о-нитроазидов 26
1.5. Свойства органических азидов 32
1.6. Особенности жизнедеятельности сульфатвосстанавливающих бактерий 36
1.6.1. Особенности развития сульфатвосстанавливающих бактерий в нефтяных пластах 37
1.6.2. Механизм участия сульфатвосстанавливающих бактерий в процессе коррозии металлов 38
1.6.3. Методы ингибирования сульфатвосстанавливающих бактерий 41
1.6.3.1. Физические методы 41
1.6.3.2. Применение химических реагентов-бактерицидов для подавления роста сульфатвосстанавливающих бактерий 42
II. Обсуждение результатов 51
2.1. Обоснование выбранного направления и пути его реализации 51
2.2. Разработка рационального способа получения «Тримиксана» 52
2.2.1. Характеристика объектов исследования 52
2.2.2. Метод синтеза «Тримиксана» 56
2.2.2.1. Оптимизация стадии азидирования 2,4,6-трихлорнитробензола 58
2.2.2.2. Разделение смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола методом
жидкостной колоночной хроматографии 60
2.2.2.3. Изучение поведения 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола в реакции нитрования различными нитрующими агентами 63
2.2.2.4. Нитрование смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола концентрированной азотной кислотой в среде 85% серной кислоты 79
2.2.2.5. Оптимизация процесса нитрования смеси 2-азидо-4,6-дихлор-нитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола концентрированной азотной кислотой в среде 85% серной кислоты 80
2.2.2.6. Оптимизация стадии термоциклизации нитропродуктов до бензофуроксановых соединений 84
2.3. Биологическая активность «Тримиксана» 87
2.3.1. Исследование действия «Тримиксана» на тест-объектах сульфатвосстанавливающих бактерий Desulfovibrio 88
2.4. Токсикологическая оценка «Тримиксана» 90
2.5. Области практического применения «Тримиксана» 92
2.5.1. Исследование «Тримиксана» с целью создания ветеринарных лекарственных препаратов 92
2.5.2. Разработка бактерицида «Тримиксан» для предотвращения биодеградации нефти 95
2.5.2.1. Исследование действия «Тримиксана» на сульфатвосстанавливаю-
щие бактерии Desulfovibrio в нефтепромысловых сточных водах 96
III. Экспериментальная часть 100
3.1. Синтез «Тримиксана» 100
3.1.1. Синтез 2,4,6-трихлорнитрозобензола 100
3.1.2. Синтез 2,4,6-трихлорнитробензола 100
3.1.3. Синтез смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола
и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола 101
3.1.4. Разделение смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6- дихлорнитробензола методом жидкостной колоночной хроматографии 102
3.1.5. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6- дихлорнитробензола различными нитрующими агентами 103
3.1.5.1. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола азотной кислотой 103
3.1.5.2. Нитрование 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола азотной кислотой 104
3.1.5.3. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде уксусной кислоты 104
3.1.5.4. Нитрование 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде уксусной кислоты 105
3.1.5.5. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде уксусного ангидрида 105
3.1.5.6. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде уксусного ангидрида с добавлением серной кислоты 106
3.1.5.7. Нитрование 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде уксусного ангидрида 106
3.1.5.8. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола разбавленной азотной кислотой 107
3.1.5.9. Нитрование 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола разбавленной азотной кислотой 107
3.1.5.10. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде серной кислоты 108
3.1.5.11. Нитрование 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде серной кислоты 108
3.1.5.12. Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде 85 %-ной серной кислоты 109
3.1.5.13. Нитрование 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде 85 %-ной серной кислоты 109
3.1.6. Нитрование смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и
4-азидо-2,6-дихлорнитробензола азотной кислотой в среде
85% серной кислоты ПО
3.1.7. Термоциклизация нитропроизводных дихлорфенилазидов 110
3.1.8. Получение «Тримиксана» 111
3.2. Исследование действия «Тримиксана» на сульфатвосста-
навливающие батерии Desulfovibrio Ill
3.2.1. Оценка бактерицидной активности «Тримиксана» на тест-объектах сульфатвосстанавливающих бактерий Desulfovibrio Ill
3.2.2. Описание методики исследования действия «Тримиксана» на сульфатвосстанавливающие бактерии Desulfovibrio
в нефтепромысловых сточных водах 113
IV. Выводы 114
V. Библиографический список
Использованной литературы
- Биологически активные вещества в ряду бензофуроксанов
- Разработка рационального способа получения «Тримиксана»
- Синтез 2,4,6-трихлорнитробензола
- Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6- дихлорнитробензола различными нитрующими агентами
Введение к работе
Актуальность работы. Проблема создания новых высокоэффективных биологически активных веществ является важной задачей химиков-синтетиков.
Многообразие микроорганизмов, привыкание их к используемым веществам является причиной непрекращающегося поиска новых биологически активных веществ. В частности, лечение болезней животных, вызванных патогенными микроорганизмами, представляет весьма трудную задачу. Ветеринарной медициной с профилактической и лечебной целью широко применяются такие вещества как хлорофос, креолин, ДМСО и т.д. Недостатком их является токсичность, недостаточная эффективность, отдаленные нежелательные последствия. Таким образом, современный фармацевтический рынок нуждается в новых лекарственных препаратах, обладающих широким спектром действия и не вызывающих побочных эффектов.
Остро стоит проблема зашиты нефти от биодеградации, которая связана с деятельностью сульфатвосстанавливающих бактерий, обитающих в нефтепромысловых сточных водах. Эффективными бактерицидами по отношению к сульфатвосстанавливающим бактериям являются хлорфенолы, производные циклических ацеталей, четвертичные аминные основания, формалин и т.д. Применение их ограничено, так как они не удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к бактерицидам нефтяной промышленности (токсичность, использование в достаточно больших концентрациях). Таким образом, изыскание новых высокоэффективных реагентов, подавляющих рост сульфатвосстанавливающих бактерий, и к тому же, отвечающих основным требованиям нефтяной промышленности, актуально и требует усилий химиков и биотехнологов.
Производные фуроксанов являются соединениями, обладающими высокой биологической активностью. Многие хлорнитропроизводные бензофурок-санов используются как антибактериальные, фунгицидные и акарицидные средства.
На кафедре ХТОСА Казанского государственного технологического университета проводятся систематические исследования по поиску биологически активных веществ в ряду замещенных бензофуроксанов. В результате исследований разработан ряд высокоэффективных лекарственных препаратов: «Нитро-ксан», «Димиксан», которые прошли широкие производственные испытания и в настоящее время применяются в ветеринарной практике.
Большой интерес для фармацевтической химии представляет новый препарат «Тримиксан», превосходящий по своей биологической активности ранее полученные «Нитроксан» и «Димиксан». Однако метод получения «Тримикса-на» недостаточно исследован для того, чтобы заложить его в основу технологического регламента. В связи с этим остро стоит вопрос разработки технологии получения «Тримиксана».
Таким образом, создание технологии получения высокоэффективного биологически активного вещества «Тримиксан», изучение его токсикологических свойств и применение в качестве лекарственных препаратов в ветеринарии и нового бактерицидного средства в нефтехимии является актуальной задачей, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения.
Цель работы. Разработка технологии получения биологически активного вещества «Тримиксан», изучение его биологической активности, создание лекарственных форм для ветеринарной медицины, нового технического средства для нефтехимии - бактерицида, предотвращающего биодеградацию нефти.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить задачи:
Разработка технологии получения «Тримиксана».
Исследования «Тримиксана» с целью создания лекарственных форм для ветеринарии.
Установление активности «Тримиксана» относительно сульфатвосста-навливающих бактерий Desulfovibrio.
Исследование действия нового бактерицида «Тримиксан» относительно сульфатвосстанавливающих бактерий Desulfovibrio в нефтепромысловых сточных водах.
Методы исследования. Для синтеза соединений использовались общие методы синтетической органической химии. Состав и строение соединений устанавливались с помощью методов ТСХ, ИК-, УФ-, ПМР- спектроскопии.
Научная новизна. Разработана лабораторная технология получения высокоэффективного биологически активного вещества «Тримиксан». Впервые проведено разделение смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола на индивидуальные изомеры и исследовано нитрование их различными нитрующими агентами, выявлены условия управления реакцией нитрования. Впервые показана высокая активность «Тримиксана» относительно сульфатвосстанавливающих бактерий Desulfovibrio.
Практическая значимость. Разработаны лабораторная технология получения высокоэффективного БАВ «Тримиксан» на основе доступного сырья — анилина и лабораторный технологический регламент на его получение. Созданы лекарственные формы «Тримиксана» для применения в качестве лечебного средства при поражениях кожи животных микотической и паразитарной этиологии. «Тримиксан» предложен в качестве нового технического средства в нефтехимии - бактерицида, предотвращающего биодеградацию нефти, эффективного при концентрации 10 мг/л.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: VI Республиканской школе студентов и аспирантов «Жить в XXI веке» (Казань, 2006), научной сессии КГТУ (Казань, 2006), международной научно-технической конференции «Современные проблемы технической химии» (Казань, 2007), научной сессии КГТУ (Казань, 2007), конкурсе «УМНИК» (Казань, 2007).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
результаты разработки технологии получения «Тримиксана»;
результаты разделения смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола на индивидуальные изомеры и исследования нитрования их различными нитрующими агентами;
результаты исследований действия «Тримиксана» на тест-объектах суль-фатвосстанавливающих бактерий Desulfovibrio;
результаты исследований действия «Тримиксана» на сульфатвосстанав-ливающие бактерии Desulfovibrio в нефтепромысловых сточных водах.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 9 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа содержит введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы из 134 наименований. Общий объем диссертации изложен на 147 страницах, включая 32 таблицы и 3 рисунка.
Научным консультантом по постановке задач, выполнению эксперимента и обсуждению результатов глав 2.3.1. и 2.5.2. является ассистент кафедры неорганической химии КГТУ, к.х.н. Гусева Е.В.
Автор выражает глубокую благодарность сотруднику ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН д.х.н., член - корр. АН РТ Нуретдинову И.А. за неоценимую помощь при постановке эксперимента по хроматографическому разделению изомеров; профессору кафедры органической* химии КГТУ, д.х.н. Газизову М.Б. за помощь при присвоении названий веществам по номенклатуре ИЮПАК.
*
Биологически активные вещества в ряду бензофуроксанов
Синтез новых биологически активных соединений является актуальной задачей. Известно, что большинство гетероциклических соединений являются БАВ и служат основой для получения новых биологически активных препаратов. Широко известна физиологическая активность разного плана для ряда ими-дазолов, пиримидинов, пиридинов.
Фуроксановые и фуразановые производные обладают близкими спектрами биологической активности, однако сила действия в каждом конкретном случае значительно различается. В проведенных ранее исследованиях [9] изучалась способность ряда производных бензодифуразанов и 4,5-фуроксанбензофураза-нов задерживать рост бактерий, грибов и простейших в зависимости от структуры соединения. Оказалось, что 4,5-фуроксанбензофуразаны с различными заместителями несколько превосходят бензодифуразановые аналоги по антибактериальному, фунгистатическому и акарицидному действию. Таким образом, был сделан вывод, что по данным видам фармакологической активности фурок-сановые соединения более перспективны, чем фуразановые.
Анализ литературы показал, что бензофуроксаны как биологически активные вещества исследованы еще недостаточно широко. Сам бензофуроксан биологической активностью обладает незначительно, но с введением таких функциональных как хлор-, нитро-, метокси-групп и др. его активность резко возрастает.
Исследования различных авторов показали, что фуроксановые соединения проявляют биологическую активность разного типа. Антибактериальная и антигрибковая активность обнаружена у бензофуроксанов с функциональными группами: 4-Ме, 5-Ме, 4,6-Ме2, 5-С1, 5-С1-6-МеО, 4-N02, 4,6-(N02)2, 5-N02, 5,6-(N02)2. Показано, что алкильные заместители понижают активность, а С1 и N02-группа увеличивают [10]. Кроме того, было изучено действие бензофуроксана на 20 культурах грибов. Установлено, что введение галогенов, нитрогруппы, ал-кокси- и алкилогрупп повышают активность [11]. Фунгицидное действие проявляет бензофуроксан и его 4-N02, 5-С1, 5-Вг, 4-Ме, 5-Ме, 5-МеО при разведении (1:100)-(1:4000) против Glenospora ganmeli, G. Graphii, Trichophyton rubrum, T. Mentagrophytes, T. Violacent и другие. Фунгицидная активность проявляется для 4-метилбензофуроксана при разведении 1:100, для бензофуроксана - 1:200, для 5-метилбензофуроксана - 1:400, для 5-бромо- 1:500, для 5-метокси- 1:500, для 4-нитро- 1:2000, для 5-хлоро- 1:4000 [12]. В качестве нейротропных средств были исследованы аминофенилфуроксаны (проявили миорелаксирующую и противо-судорожную активность), некоторые нитробензофуроксаны проявили антианги-нальные и антиагрегатные свойства [13,14]. Однако отмечено, что некоторые из этих соединений обладают также и достаточной токсичностью [15]. Наименее активен сам бензофуроксан и его метальные производные, наиболее активны 4-нитро- и 5(6)-хлорпроизводные [16].
Бензофуроксан и его хлорпроизводные предлагались как бактерициды и фунгициды для обработки семенного гороха, бобов и картофеля [17]. Бензофуроксан, его 5-метокси- и 4-нитропроизводные при опрыскивании посевов риса препятствуют заражению растений бактериями [18]. 4,5,6,7-тетрабромтетра-гидробензофуроксан проявляет активность против Phytophthora festuns и Ventu-ria inacoyalis и предложен в качестве противогрибкового препарата для сельского хозяйства [19].
Некоторые хлор-, нитро- и алкоксизамещенные бензофуроксаны запатентованы как алгициды [20]. Некоторые бензофуроксаны испытывались против долгоносиков, но особой активности не проявили [21].
Средняя смертельная доза (LD5o) бензофуроксана составляет приблизительно 30 мг/кг (для крыс) при пероральном или внутрибрюшном введении. Это соединение обладает местнораздражающим действием на слизистые оболочки и кожу [22].
Гхош и Эверитт [23] обнаружили сосудорасширяющее действие замещенных бензофуроксанов и пришли к выводам о том, какие структурные особенно-сти ответственны за этот тип физиологической активности. Во-первых, они показали путем сравнения с бензофуразановыми соединениями, что необходимым структурным фрагментом является N-оксидная группа кольца. Во-вторых, они установили, что резкое возрастание активности происходит тогда, когда рядом с фуроксановым кольцом «пристраивается» к бензольному циклу второе пяти-членное диазольное кольцо - тиадиазольное, фуразановое, фуроксановое. В этом же порядке увеличивается активность.
Разработка рационального способа получения «Тримиксана»
В настоящее время одной из актуальных проблем ветеринарии и медици ны является широкое распространение кожных заболеваний микотической и саркоптоидознои этиологии. Это объясняется резким снижением естественной резистентности организма и возникновением иммунодефицитов, развивающих ся вследствие нарушения экологического баланса и физиологически необосно ванного рациона [113].
Известно широкое применение ветеринарной службой с профилактической и лечебной целью акарицидов на основе фосфорорганических препаратов (например, хлорофоса) и производных гамма-изомера гексахлорана. Недостатками данных препаратов являются высокая токсичность для животных и человека, а также возникновение отдаленных последствий их применения. Кроме того, использование гексахлорансодержащих и многих фосфорорганических соединений ограничено в связи с наличием у них мутагенных свойств. Использование данных групп препаратов до настоящего времени было обосновано только отсутствием других доступных высокоэффективных лекарственных средств. Высокая стоимость импортных препаратов, а часто и серьезные побочные эффекты, также ограничивают возможность их широкого применения, как у людей, так и в ветеринарной практике.
Производные фуроксанов зарекомендовали себя как соединения, обладающие высокой биологической активностью. На основе хлорнитропроизвод-ных бензофуроксанов получены высокоэффективные лекарственные препараты «Нитроксан» (смесь 4-нитро - 5,7-дихлорбензофуроксана и 5-нитро-4,6-дихлор-бензофуроксана) и «Димиксан» (смесь 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана и 5-нитро-4,6-дихлорбензофурокеана), проявляющие фунгицидную, акарицидную и бактерицидную активности [3,114]. Кроме того, эти препараты отличаются от отечественных и зарубежных аналогов не только высокими характеристиками биологической активности, но и доступностью способа получения, безопасно 52 стью в обращении, отсутствием мутагенных, кумулятивных и аллергизирующих свойств.
Продолжением исследований в ряду галогеннитробензофуроксанов стал синтез нового препарата «Тримиксан», представляющего смесь 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана, 4-нитро- 5,7-дихлорбензофурокасана и 5-нитро-4,6-ди-хлорбензофуроксана. Исследования физиологического действия этого препарата показали, что по акарицидной активности он превосходит на два порядка активность ранее полученных препаратов «Нитроксан» и «Димиксан». Таким образом, актуальным является разработка эффективного способа синтеза и лабораторной технологии высокоэффективной биологической смеси, ее лекарственных форм.
Кроме патогенных микроорганизмов, в природе существует много непатогенных бактерий и грибов, вызывающих разрушение технических изделий. В частности, актульным является проведение исследований действия «Тримикса-на» по отношению к непатогенным сульфатвосстанавливающим бактериям De-sulfovibrio , жизнедеятельности которых является причиной микробиологической коррозии нефтепромыслового оборудования и биодеградации нефти.
Основной целью нашей работы стала разработка рационального способа получения биологически активного вещества «Тримиксан», разработка его лекарственных форм, исследование его в качестве нового бактерицида для подавления роста сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) Desulfovibrio.
В настоящей работе объектом исследования является «Тримиксан» и его рациональный способ получения. «Тримиксан» - это кристаллический продукт желто-оранжевого цвета, ТШ1. = 98-104С, нерастворим в воде, однако хорошо растворяется в органических растворителях (этиловый спирт, толуол, хлороформ, ДМСО и другие), неустойчив при действии щелочей, но устойчив к кислотам. «Тримиксан» - это трехкомпонентная система, в состав которой входят следующие компоненты: 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксан (4,6-ДН-5,7-ДХБФО), 5-нитро-4,6-дихлорбензофуроксан (5-Н-4,6-ДХБФО) и 4-нитро-5,7-дихлорбензофуроксан (4-Н-5,7-ДХБФО): 4,6-ДН-5,7-ДХБФО 5-Н-4,6-ДХБФО 4-Н-5,7-ДХБФО По номенклатуре ИЮПАК компоненты «Тримиксана» называются следующим образом: 4,6-ДН-5,7-ДХБФО - 4,6-динитро-1-оксо-5,7-дихлорбенз [6,5-ё]-2,1,3-оксадиазол; 5-Н-4,6-ДХБФО - 5-нитро-1-оксо-4,6-дихлорбенз [4,5-d]-2,1,3-оксадиазол; 4-Н-5,7-ДХБФО - 4-нитро-1-оксо-5,7-дихлорбенз [6,5-d]-2,l,3-оксадиазол. Так как в литературе данные вещества называются «производными бензофуроксанов» было решено придерживаться привычных названий.
В ранее проведенных исследованиях [3,38] охарактеризованы смесь, в состав которой входят компоненты 4,6-ДН-5,7-ДХБФО и 5-Н-4,6-ДХБФО («Ди-миксан»); смесь, в состав которой входят компоненты 5-Н-4,6-ДХБФО и 4-Н-5,7-ДХБФО («Нитроксан»), индивидуальные 5-Н-4,6-ДХБФО и 4-Н-5,7-ДХБФО.
Синтез 2,4,6-трихлорнитробензола
Для возможного внедрения «Тримиксана» в производство «Татнефти» возникла необходимость в технико-экономической оценке «Тримиксана».
Степень обводненности нефти на промыслах ОАО «Татнефть» составляет 60%. В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в нефтепромысловых сточных водах происходит биодеградация нефти на 5% . По расчетам, при использовании «Тримиксана» в концентрации 0,01 г/л возможно сокращение биодеградации нефти с 5% до 0,2%. Годовой объем нефти, сохраненной от биодеградации в этом случае составит 1,224 млн тонн.
В результате проведенных расчетов можно сделать вывод, что экономически выгодно использовать «Тримиксан» в концентрации 10 мг/л. При этой концентрации мы предотвращаем биодеградацию нефти на 4,8% и получаем годовой экономический эффект, равный 5281,56 млн. руб. Таким образом, «Тримиксан» в концентрации 10 мг/л можно рекомендовать для применения в нефтяной промышленности.
Разработанный в данной работе рациональный способ позволит получить «Тримиксан» с хорошим выходом в необходимом количестве из недорогого исходного сырья, на установке, не требующей специальных условий. Полученное биологически активное вещество «Тримиксан» можно успешно использовать в 2-х актуальных направлениях: в качестве лекарственных препаратов в ветеринарии и технического средства в нефтехимии.
Использование «Тримиксана» в концентрации 0,1% в лекарственных препаратах выгодно отличается не только от известных аналогов, но и от ранее полученного высокоэффективного препарата «Нитроксан», который использовался в концентрации 0,5-1%. Разработанные на основе «Тримиксана» лекарственные препараты обладают высокой эффективностью при лечении болезней кожи животных микотической и паразитарной этиологии.
Помимо этого проведены первые исследования применения бензофурок-сановых соединений в новой области — нефтехимии. Новый реагент для подавления роста СВБ Desulfovibrio «Тримиксан» отвечает всем требованиям, предъявляемым к бактерицидам нефтяной промышленности. В небольшой концен 99 трации — 10 мг/л он обеспечивает чрезвычайно высокую бактерицидную активность, отличаясь тем самым даже среди лучших бактерицидов. Поэтому «Три-миксан» является конкурентоспособным реагентом для подавления роста СВБ и может быть рекомендован в качестве бактерицида для предотвращения биодеградации нефти на нефтепромыслах.
Инфракрасные спектры снимались на спектрометре CARLZEISS ZENA (Германия) в диапазоне 500-3700 см_1 в виде суспензий в вазелиновом масле.
Контроль полноты протекания реакций и чистоты синтезированных соединений проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах «Silufol UV-254», проявитель - УФ-облучение, пары йода.
Ультрафиолетовые спектры снимались на спектрофотометре СФ-26 (Россия). Спектры ЯМР Н записаны на спектрометре Tesla В -567(рабочая часто-та для ПМР спектров 100 МГц); химические сдвиги протонов указаны относительно ГМДС. Показатель рН снимали на иономере И - 120.2.
В трехгорлую колбу, снабженную механической мешалкой и термометром, загружали Зг (0,0153 моля) трихлоранилина, добавляли 9,75 мл уксусной кислоты и осторожно прикапывали 0,6 мл серной кислоты при комнатной температуре. Затем реакционную смесь нагревали до 40С, после чего убирали нагрев и постепенно приливали 3 мл Н202 так, чтобы температура не превышала 40 - 45С. При этой температуре реакционную смесь выдерживали в течении 2-х часов. Реакционная масса становилась темно-коричневой. По окончании реакции полученный продукт отфильтровывали на воронке Шотта, тщательно промывали водой и сушили на воздухе до постоянной массы. Продукт - порошок светло-коричневого цвета. Выход трихлорнитрозобензола 2,87 г (95,5%), Тпл= 127-128С.
В трехгорлую колбу, снабженную механической мешалкой и термометром, заливали 4 мл азотной кислоты, затем при комнатной температуре порциями прибавляли 5г (0,024 моля) трихлорнитрозобензола таким образом, чтобы температура не превышала 20-25С. По окончании дозирования устанавливали обратный холодильник и нагревали на водяной бане до 60 - 65С. Реакционную смесь выдерживали в течение 2-х часов. По окончании реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выливали в толченый лед. Выпавший осадок отфильтровывали на воронке Шотта, тщательно промывали водой и сушили на воздухе до постоянной массы. Продукт - светло-коричневый порошок. Выход трихлорнитробензола 4,82 г (96,3%), Тпл= 68-70С.
Нитрование 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6- дихлорнитробензола различными нитрующими агентами
3 г (0,013 моль) смеси 2-азидо-4,6-дихлорнитробензола и 4-азидо-2,6-дихлорнитробензола медленно дозировали в заранее приготовленную смесь 14 мл (0,25 моль) 85% серной кислоты (d=l,78) и 14 мл (0,33 моль) азотной кислоты (d=l,5) с такой скоростью, чтобы температура не превышала 15-20С и реакционную смесь выдерживали при температуре 20-25С в течение 3-х часов. По окончании реакции смесь выливали в толченый лед. Выпавший осадок отфильтровывали на воронке Шотта, промывали водой до нейтральной реакции и сушили на воздухе до постоянной массы. Продукт - порошок желтого цвета. Выход продукта 3,42 г (95 %), Т„л= 99-103С. ИКС, см"1: 2130 (N3), 800-600 (СС1), 1510 - 1300 (N02), 1600,1500,1450 (бензольное кольцо). ТСХ: продукт содержит три пятна с Rf = 0,3, Rf = 0,36 и Rf = 0,4.
Реакцию осуществляли по общей методике. В нитратор, снабженный механической мешалкой, термометром, обратным холодильником и гидрозатвором загружали 3 г нитропродукта. Добавляли заранее приготовленную смесь 30 мл уксусной кислоты и 6 г ТХУК и нагревали до 125-130С на масляной бане, при перемешивании давали выдержку при этой температуре 1-1,5 часа. По окончании реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Из полученного раствора медленно по каплям высаживали небольшим количеством воды продукт реакции. Выпавший продукт отфильтровывали, промывали тщательно водой и сушили на воздухе до постоянной массы. Получение бензо-фуроксанового соединения контролировали по исчезновению на ИК-спектре пика, характерного для азидной группы -2130 см" и присутствию фуроксаново-го цикла в области 1560 (С= N-Ю) и 1340 (N02), 1250 (N-Ю), 1630 (C=N) и 800-600 (С-С1).
В нитратор, снабженный механической мешалкой, термометром, обратным холодильником и гидрозатвором загружали 3 г нитропродукта. Добавляли заранее приготовленную смесь 30 мл уксусной кислоты и 6 г ТХУК и нагревали до 125-130С на масляной бане, при перемешивании давали выдержку при этой температуре 1-1,5 часа. По окончании реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Из полученного раствора медленно по каплям высаживали небольшим количеством воды продукт реакции. Выпавший продукт отфильтровывали, промывали тщательно водой и сушили на воздухе до постоянной массы. Выход продукта 2,65 г (98%), Тпл= 98-104С. ИКС, см"1: 1580 (С- N-Ю) и 1530 (N02), 1250 (N-Ю), 1630 (C=N) и 800-600 (С-С1). ТСХ: продукт содержит три пятна с Rf = 0,2, Rf = 0,35 и Rf = 0,38. ПМР: 7,9 и 7,97 м.д. УФ: 390 нм при D=0,4. Объектом исследования служила культура СВБ Desulfovibrio, выделенная из добывающих скважин Ромашкинского нефтяного месторождения РТ, с оптимумом роста при концентрации NaCl в среде 15%.
Для развития активной чистой культуры СВБ Desulfovibrio использовали питательная среда следующего состава:
Питательную среду готовили следующим образом. Автоклавирование растворов А и В проводили по отдельности в течение 15 минут при температуре 121 С. Затем охлаждали раствор А до комнатной температуры. После этого при постоянном перемешивании к раствору А приливали раствор В. Затем щелочью (NaOH) доводили рН смеси растворов до значения 7,8.
В питательную среду вносили 10% активной культуральной среды. Клетки отбирали в экспоненциальной фазе. Количество культуральной среды в каждом опыте составило два литра.
Для оценки бактерицидной активности «Тримиксана» использовались пять различных концентраций тірепарата (в расчете на 1 л ферментативной среды): 100 мг/л, 10 мг/л, 1 мг/л, 0,1 мг/л, 0,01 мг/л.
Определение бактерицидной активности «Тримиксана» проводили in vitro методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Первоначально бактериоста-тическое свойство реагента определяли визуально по отсутствию роста культуры в пробирках после суточной инкубации при температуре 30С.
Оценку бактерицидной активности «Тримиксана» проводили по методике оценки защитного действия реагентов [134].
