Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Климактерические расстройства и лекарственные средства для их коррекции (обзор литературы) 9
1.1. Характеристика климактерических расстройств 9
1.2. Лекарственные средства, применяемые для коррекции климактерических расстройств 16
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Характеристика объектов исследования 36
2.2. Методы исследования 37
2.2.1. Методы химического, хроматографического и спектрального исследования биологически активных веществ 37
2.2.2. Методы морфологического и микроскопического исследования 49
2.2.3. Методы товароведческого анализа 49
2.2.4 Методы микробиологической и фармакологической оценки 50
2.3. Методы статистической обработки результатов исследований... 52
ГЛАВА 3. Обоснование компонентного состава и оценка фармакологических свойств сбора, обладающего эстрогеноподобным дествием 53
3.1. Теоретическое обоснование компонентного состава сбора 53
3.2. Экспериментальное обоснование компонентного состава сбора 58
3.2.1. Исследование эстрогенной (утеротропной) активности компонентов сбора 58
3.2.2. Исследование противовоспалительных свойств компонентов сбора 61
3.2.3. Исследование антибактериальной активности компонентов сбора 62
3.2.4 Исследование антигрибковых свойств компонентов сбора 63
3.3. Оценка фармакологических свойств сбора 66
3.3.1. Исследование эстрогенной (утеротропной) активности 66
3.3.2. Исследование противомикробной и противовоспалительной активности 68
ГЛАВА 4. Исследование химического состава сбора, обладающего эстрогеноподобным дествием 71
4.1. Качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ 71
4.2. Исследование фенольных соединений 72
4.3. Исследование полисахаридов 82
4.4. Исследование сапонинов 82
4.5. Исследование элементного состава 83
ГЛАВА 5. Разработка методик стандартизации сбора, обладающего эстрогеноподобным дествием 86
5.1. Изучение морфологических и анатомических признаков подлинности сбора 86
5.2. Разработка методики количественного определения изофлавоноидов в сборе 98
5.3. Определение экстрактивных веществ в сборе 106
5.4. Разработка товароведческих показателей сбора 107
5.5. Определение микробиологической чистоты 109
Выводы 111
Список литературы 113
Приложение. Проект ФСП «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием» 129
- Лекарственные средства, применяемые для коррекции климактерических расстройств
- Методы химического, хроматографического и спектрального исследования биологически активных веществ
- Исследование эстрогенной (утеротропной) активности компонентов сбора
- Разработка методики количественного определения изофлавоноидов в сборе
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время 10% всей популяции земного шара составляют женщины в климактерическом периоде, при этом их число ежегодно возрастает. Симптомы климакса и отдаленные последствия менопаузы значительно ухудшают здоровье и благополучие женщин, снижая качество их жизни. В настоящее время для купирования климактерических симптомов пациенткам широко назначается заместительная гормонотерапия. Однако существует ряд относительных и абсолютных противопоказаний к назначению гормональных препаратов [Кулаков В.А., Сметник В.П., 2001г.]. Поиск альтернативных методов лечения климактерических расстройств проводится постоянно. Одним из видов альтернативного лечения климактерических расстройств является терапия лекарственными растительными сборами и фитокомплексами на их основе.
Среди официнальных лекарственных сборов не представлены фитосредства, рекомендуемые для коррекции климактерических расстройств. Однако в официнальной и народной медицине используется ряд лекарственных растений и сборов, влияющих на отдельные симптомы климактерического периода.
Особенности патофизиологического механизма и симптоматических проявлений климактерического синдрома диктуют необходимость поиска новых фитосредств с поливалентным терапевтическим воздействием на организм.
Таким образом, создание нового многокомпонентного сбора для коррекции климактерических расстройств, его фармакогностическое и фармакологическое изучение, разработка критериев оценки качества и внедрение сбора в медицинскую практику является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось теоретическое и экспериментальное обоснование состава и разработка методик стандартизации многокомпонентного сбора, обладающего эстрогеноподобным действием.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести анализ литературы по физиологии и средствам коррекции патологического течения климактерического периода.
-
Разработать состав сбора на основании данных литературы и экспериментальных исследований по эстрогенной, противо-воспалительной и противомикробной активности лекарственных растений.
-
Провести исследование эстрогенной, противовоспалительной и противомикробной активности предлагаемого сбора.
-
Провести исследование химического состава предлагаемого сбора с целью выявления основных групп биологически активных веществ (БАВ) для его стандартизации.
-
Разработать методики стандартизации сбора и проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием».
Научная новизна. На основании анализа банка данных литературы и собственных фармакологических и фитохимических исследований впервые разработан состав лекарственного растительного сбора, обладающего комплексным действием на основные симптомы климактерических расстройств. Установлено, что водно-спиртовый экстракт сбора обладает эстрогенной, противовоспалительной и противомикробной активностью. Новизна предлагаемого нового фитосредства защищена патентом РФ.
Установлен качественный и количественный состав основных биологически активных веществ сбора (изофлавоноиды, кумарины, полисахариды, макро- и микроэлементы). Методами хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и ВЭЖХ идентифицированы: ононин, формононетин, генистеин, биоханин А, рутин, кверцетин, кофейная, галловая, феруловая кислоты.
Для определения подлинности сбора выявлены внешние и микроскопические признаки входящих в него ингредиентов. Разработаны критерии качества сбора по товароведческим показателям и содержанию ведущей группы БАВ – изофлавоноидов.
Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения изофлавоноидов в предлагаемом сборе методами хроматографии в тонком слое сорбента и спектрофотометрии, включенные в проект ФСП.
Практическая значимость. Теоретические и экспериментальные исследования показали целесообразность дальнейшего фармакологического исследования сбора в качестве нового фитосредства, позволяющего решить проблемы женщин при недостатке в организме эстрогенов.
Разработан проект ФСП «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием».
Получен патент на изобретение «Лекарственное средство для профилактики и лечения патологических проявлений климактерического синдрома» № 2376026 от 20.12.2009 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты теоретического и экспериментального обоснования состава нового фитосредства «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием»;
2. Результаты исследования химического состава сбора, обладающего эстрогеноподобным действием;
3. Обоснование методик стандартизации предлагаемого сбора.
Связь задач исследования с планом научных работ. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета в рамках комплексной темы «Изучение природных источников биологически активных веществ и получение на их основе новых лекарственных средств» (№ Государственной регистрации 0120.0 602076).
Апробация работы. Основные положения диссертации были обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); Межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной памяти А.С. Саратикова (Томск, 2006); VII Межрегиональной научно-практической фармацевтической конференции «Биологически активные соединения в профилактике заболеваний и укреплении здоровья нации» (Новосибирск, 2007); 63 Всероссийской научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); IX Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 11 статей и тезисов, отражающих основное содержание диссертации, из них 3 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ; получен 1 патент РФ на изобретение.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполняли на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ (г. Томск), кафедрах микробиологии с курсом вирусологии и фармакологии СибГМУ (г. Томск), в ООО «БИОЛИТ», в лаборатории «Экогеогидрофизхим» филиала АО «Азимут Энерджи Сервисез» (г. Караганда, Республика Казахстан).
Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 140 страницах машинописного текста. В тексте приведено 29 таблиц и 18 рисунков. Библиографический указатель включает 160 источников литературы, в том числе 30 зарубежных.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка использованной литературы и приложения. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе представлен анализ проблемы климактерия и современные методы коррекции его патологического течения, в том числе средствами растительного происхождения. Обозначена необходимость разработки комплексного фитосредства для коррекции климактерических расстройств. Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, охарактеризованы методы и методики, использованные в работе. Третья глава посвящена теоретическому и экспериментальному обоснованию компонентного состава сбора, обладающего эстрогеноподобным действием. В четвертой главе приведены результаты исследования химического состава сбора и обоснования выбора группы БАВ для его стандартизации. Пятая глава посвящена разработке методик стандартизации предлагаемого сбора.
В приложении представлены акты внедрения результатов диссертационной работы, проект фармакопейной статья предприятия «Сбор, обладающий эстронеоподобным действием».
Лекарственные средства, применяемые для коррекции климактерических расстройств
Сердечно-сосудистые заболевания. Женщины в периоде постменопаузы представляют собой категорию высокого риска для развития заболеваний сердца и сосудов, в первую очередь артериальной гипертонии, атеросклероза и ишемической болезни сердца. Известно, что распространенность этой патологии значительно выше у молодых мужчин и примерно до 50 лет заболеваемость у представителей обоих полов нарастает одинаковыми темпами. Однако позднее, если у мужчин этот показатель изменяется мало, то у женщин в возрастной группе 40-49 лет он уже увеличивается вдвое, а в группе 50-59 лет - втрое. Если частота артериальной гипертонии у женщин в репродуктивном возрасте составляет около 8%, то после наступления климакса возрастает до 52% — почти в 7 раз [73, 88, 98].
Остеопороз - системное заболевание скелета, характеризующееся уменьшением массы, снижением минерализации и нарушением архитектоники костной ткани. По данным экспертов ВОЗ, остеопороз, наряду с инфарктом миокарда, внезапной смертью и онкологической патологией, занимает ведущее место в структуре смертности. По частоте распространенности остеопороз занимает третье место в мире после сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета. Согласно статистике, в 80% случаев эта болезнь поражает женщин, развиваясь практически у каждой четвертой в возрасте старше 50 лет. Снижение прочности костей (а в течение климактерического периода женщина может потерять до 40% костной ткани) резко повышает риск переломов. Травматические повреждения костей происходят у каждой второй женщины в возрасте 50-70 лет — в 4-7 раз чаще, чем у мужчин того же возраста. В периоды пери- и постменопаузы страдают в основном губчатые кости — позвонки, предплечья, голени. В дальнейшем доминируют явления сенильного (старческого) остеопороза, поражающего преимущественно кости трубчатые - в первую очередь это проявляется в переломах шейки бедра [1, 45, 85, 88, 98, 139].
Онкологические заболевания, в первую очередь рак молочной железы, рак яичников и эндометрия также являются характерным проявлением КС. Полагают, что только в 10-15% возникновение этих опухолей обусловлено генетическими причинами, в остальных же случаях важнейшую роль играет влияние окружающей среды, особенно на фоне применения заместительной гормонотерапии эстрогенами [88, 98, 100].
Климактерический синдром (КС) - своеобразный симптомокомплекс, осложняющий естественное течение климактерия, характеризующийся нейропсихическими, вазомоторными нарушениями, возникающими на фоне возрастных изменений в организме [19, 58, 81, 98]. Если физиологическое течение климактерического периода генетически запрограммировано и означает остановку репродуктивной функции с возрастными изменениями во всех органах и системах женского организма, то патологическое его течение может быть обусловлено следующими причинами: - социально-экономические, бытовые и семейные трудности; - нейропсихические стрессовые ситуации; - гинекологические заболевания; - обменные нарушения; - сочетания ряда факторов. Оценивая причины КС, можно сказать, что это мультифакториальное заболевание, в основе которого лежат факторы внешней среды, наследственные, стрессовые и соматические факторы. Под влиянием неблагоприятных внешних воздействий, заболеваний, интоксикаций, психических и физических травм физиологический климактерий может быстро перейти в патологический. Патогенез КС неоднозначен. У женщин с КС всегда имеют место нарушения взаимодействия и активности лимбико-ретикулярного комплекса, в том числе гипоталамических структур по координации деятельности сердечно-сосудистой, дыхательной и других систем, эмоционально-поведенческих реакций и механизмов терморегуляции. Чем сильнее выражены эти изменения, тем тяжелее протекает КС (рис.1) [58, 88]. Наиболее существенные и серьезные изменения наступают в постменопаузе, которая имеет место у 85% женщин и почти у каждой второй продолжается свыше 15 лет. Наиболее опасными патологическими проявлениями КС в этот период являются повышение уровня сердечно сосудистых заболеваний, остеопороза, а также злокачественных новообразований, в первую очередь, молочной железы, яичников и эндометрия. Таким образом, климактерический период характеризуется не только физиологическими, но и патологическими реакциями органов и систем организма на дефицит половых гормонов: нарушением сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, урогенитальными расстройствами, характеризующимися возрастанием роли условно-патогенных микроорганизмов и воспалением мочеполовой системы, а также признаками остеопороза. Своевременное решение проблем климактерия - это реальный путь сохранения здоровья и обеспечения качества жизни женщины. Проблема коррекции климактерического синдрома (КС) является чрезвычайно актуальной и в последние годы в ее решении достигнут значительный прогресс. В комплексной терапии климактерических расстройств применяются гормональные препараты, а также препараты других фармакологических групп: гомеопатические, витаминно минеральные комплексы; препараты, улучшающие мозговое кровообращение, гипотензивные средства; транквилизаторы; антидепрессанты и снотворные средства (как природного, так и синтетического происхождения) [75, 76, 88, 100].
Методы химического, хроматографического и спектрального исследования биологически активных веществ
Количественное определение суммы флавоноидое проводили спектрофотометрическим методом с использованием комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом [33, 35, 62].
Методика. 0,1 г (т.н.) измельченного сбора помещали в колбу объемом 100 мл, прибавляли 30 мл 40%-ного этилового спирта и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, периодически встряхивая для смывания частиц сбора со стенок. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 50 мл. Бумажный фильтр помещали в колбу для экстрагирования, прибавляли 20 мл 40%-ного этилового спирта и повторяли экстракцию в описанных выше условиях, фильтруя в ту же мерную колбу. Затем объем доводили 40%-ным этиловым спиртом до метки и перемешивали (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл вносили 2 мл раствора А, 2 мл раствора алюминия хлорида в 95%-ном этиловом спирте, 2 капли разведенной уксусной кислоты. Объем раствора доводили до метки 96%-ным этиловым спиртом (раствор Б). Через 40 минут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2 мл раствора А, 2 капель разведенной уксусной кислоты и доведенный 95%-ным этиловым спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряли оптическую плотность комплекса Государственного стандартного образца (ГСО) рутина с алюминия хлоридом. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухой сбор в процентах (X) вычисляли по формуле: Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: около 0,05 г. (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135С в течение 3 ч, растворяли в 85 мл 95% -ного этилового спирта в мерной колбе 100 мл при нагревании на водяной, бане, охлаждали, доводили объем раствора тем же этиловым спиртом до метки и перемешивали. Для хроматографического анализа фенольных, соединений использовали бумагу FN-6, FN-12 (Filtrak, Mittelschnell laufend, Germany). Для тонкослойной хроматографии использовали пластины на алюминиевой подложке фирмы Merck KGaA (Germany) Kieselgel-60 F254; пластины «Сорбфил» на алюминиевой подложке аналитические ПТСХ-АФ-А/ПТСХ-АФ-А-УФ ЗАО Сорбполимер (Россия). Для хроматографирования использовали системы: 2%, 15% и 30% уксусная кислота; систему Форесталя; 5% раствор натрия карбоната; 25% этиловый спирт; хлороформ; хлороформ-этиловый спирт (3:1; 1:1); хлороформ-метанол (15:1; 93:7; 90:3; 95:5; 90:13; 90:15); хлороформ— метанол-раствор аммиака (70:30:3; 90:10:0,5); хлороформ-ацетон— муравьиная кислота (9:1:1); БУВ (3:1:1; 4:1:2; 4:1:5); хлороформ-уксусная кислота (9:1); этилацетат—метанол-вода (100:15,5:13,5); этилацетат— муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (100:11:11:27) [10-13, 52, 56, 154, 159]. В качестве веществ сравнения использовали известные вещества производства Sigma-Aldrich, Fluka: формононетин 47752-F (Fluka), ононин 75375 (Fluka), генистеин 9155 (Fluka), биоханин 14385 (Fluka), феруловую кислоту 46280-F (Fluka); галловую кислоту 48630-F (Fluka); кофейную кислоту С0625 (Sigma); коричную кислоту С80857 (Aldrich). Детектирование фенольных соединений проводили в УФ-свете при длинах волн 365 и 254 нм. Все значения Rf анализируемых соединений являются средними величинами 5-6 измерений.
Исследование фенольных соединений методом ВЭЖХ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Миллихром-А-02», с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы МультиХром-СПЕКТР для Windows. В качестве неподвижной фазы использовали колонку ProntoSIL 120-5-С18 AQ, №80303 размером 2,0x75 мм, размер частиц 5,0 мкм. В качестве подвижной фазы использовали [4М LiClC 4+0,lM НСЮ4]:Н20 в соотношении 5:95. Скорость подачи элюента 100,00 мкл/мин. Температура — 40С. Давление — 2,0 МРа. Продолжительность анализа 115 минут. Параллельно с испытуемым раствором в хроматограф вводили растворы достоверных образцов. Детектирование данных веществ проводили по УФ-спектрам при длинах волн 210 — 300 нм.
Сапонины. Предварительное обнаружение сапонинов в сборе проводили по образованию стойкой пены при встряхивании водного извлечения [35].
Более достоверное присутствие сапонинов в сборе и их природу устанавливали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах "Сорбфил" в системах растворителей хлороформ-метанол в соотношении 25:3. Пластины после высушивания обрабатывали 25%-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты, нагревали в сушильном шкафу при температуре 105С до появления пятен.
Количественное определение сапонинов проводили гравиметрическим методом [35]. Около 1,0 г (т.н.) измельченного и очищенного хлороформом сбора извлекали в аппарате Сокслета метиловым спиртом в течение 16-20 часов. Растворитель отгоняли до 5-10 мл и остаток количественно переносили в предварительно взвешенную колбу емкостью 50 мл. Приемник промывали дважды по 5 мл горячим метанолом и сапонины осаждали 30 мл диэтилового эфира. Колбу закрывали и оставляли на холоде на 10-12 часов. Жидкость декантировали, остаток эфира удаляли на водяной бане при температуре 50С, осадок в колбе сушили в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 100С и взвешивали.
Исследование эстрогенной (утеротропной) активности компонентов сбора
Для оценки качества сбора нами определены его основные товароведческие показатели по методикам Государственной фармакопеи XI издания. В качестве примесей в растительном сырье рассматриваются части этого же растения, не являющиеся сырьем, части других неядовитых растений (органическая примесь) и минеральная примесь.
Примеси. В анализируемых образцах сбора обнаружены в качестве примесей частицы корневищ аира, побуревшие на изломе, кусочки корневищ хвоща полевого, побуревшие части корзинок ромашки аптечной и шишек хмеля, пожелтевшие частицы листьев клевера и овса. Содержание данных примесей, отнесенных нами к органической примеси, не превышало 2,69%, поэтому предлагается установить предел для этого показателя не более 3%. Вместе с тем, в образцах сбора присутствовала минеральная примесь (частицы, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 0,18 мм) и не превышала 1,21% . Предлагается этот показатель не более 2%.
Измелъченностъ сырья (результаты ситового анализа). Для определения фракционного состава сбора (степени его измельченности) нами проведен его ситовой анализ. Для этого использовали набор сит с диаметром отверстий от 5 до 0,1 мм. Как показывают результаты анализа, представленные в таблице 27, сбор состоит преимущественно из частиц сырья размером 3-5 мм (не менее 82,44%); на сите с диаметром отверстий 5 мм остается не более 8,91% сбора, а через сито с диаметром отверстий 0,25 мм проходит не более 3,64% частиц. Таким образом, сбор представляет собой практически однородную по размерам смесь. Предлагаем внести в проект ФСП показатель «содержание частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм» не более 10%; содержание частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм не более 5%.
Влажность сырья (потеря в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ при высушивании) определяли согласно фармакопейной методике [32] при температуре 105С, высушивая навески до постоянной массы. Потеря в массе сырья при высушивании колебалась от 5,55% до 6,10% (табл.28). Предлагается внести в нормативную документацию максимальный для растительного сырья показатель влажности не более 13%.
Зола. Для растительного сырья принято определять содержание золы общей, образующейся при сжигании и показывающей накопление минеральных веществ в сырье, в том числе при его загрязнении [33]. Кроме того, определяется содержание золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной. При анализе показатель золы общей составил не более 6,72%. Содержание золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной составило не более 1,92 % (табл.28). Предлагаем внести в проект ФСП нормы по данным показателям — не более 8% и не более 3% соответственно.
Испытание на микробиологическую чистоту включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление определенных видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах. Анализу подвергали пять образцов сбора по методике, изложенной в ГФ XI издания, вып.2, стр. 193 и Изменением №3 к ГФ XI от 19.06.03 г. Результаты анализа представлены в таблице 29.
Из таблицы 29 видно, что по числу аэробных бактерий, грибов и бактерий кишечной группы исследуемый сбор соответствует нормативным требованиям и может быть допущен для приготовления спиртовых экстрактов и настоев с использованием кипящей воды.
Таким образом, на основании полученных результатов нами разработаны и представлены в проекте ФСП «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием» числовые показатели данного сбора, позволяющие оценивать его качество: содержание изофлавоноидов не менее 1,5%; экстрактивных веществ, извлекаемых 40%-ным этиловым спиртом не менее 20%; влажность не более 13%; золы общей не более 8%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты не более 3%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм не более 10%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,25 мм не более 5%; органической примеси не более 3%; минеральной примеси не более 2%.
При разработке и оформлении проекта ФСП «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием» руководствовались ОСТ 91.500.05.001-00 «Стандарты качества ЛС. Основные положения», Методическими указаниями ИСЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» Министерства Здравоохранения РФ «Требования к разработке и оформлению проектов нормативных документов на лекарственное растительное сырье различных морфологических групп. Модели нормативных документов на лекарственное растительное сырье различных морфологических групп - «Цветки», «Листья», «Трава», «Плоды», «Семена», «Кора», «Корни, корневища, клубни, луковицы, клубнелуковицы» (2004 г.), а также Методическими рекомендациями ИСЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора «Правила составления, изложения и оформления стандартов качества на фармацевтические субстанции» (2009 г.). 1. На основании анализа банка данных литературы и собственных исследований предложено лекарственное растительное сырье для сбора, обладающего эстрогеноподобным действием: шишки хмеля, цветки ромашки аптечной, трава хвоща полевого, трава овса посевного, трава клевера лугового, корневища аира, корни солодки, корневища бадана. 2. На основании экспериментальных данных предложены две прописи сбора, обладающего эстрогенной активностью в сочетании с противовоспалительным и антимикробным действием.
Разработка методики количественного определения изофлавоноидов в сборе
Волоски часто отпадают и в центре розетки виден круглый валик. По жилкам располагается кристаллоносная обкладка {трава клевера лугового) (рис.9); - обрывки эпидермиса верхней и нижней стороны листа с вытянутыми почти прямыми или волнистыми неравномерноутолщенными стенками клеток (простые поры); характерным ромбовидным устьичным аппаратом с замыкающими клетками в виде двух палочек, расширенных на концах (гантелеобразная форма), к каждой замыкающей клетке прилегает более или менее треугольная побочная клетка. В мезофилле листа расположены проводящие сосуда со спиральным и кольчатым утолщением клеточных стенок. Клетки эпидермиса стебля с вытянутыми прямыми стенками и простыми одноклеточными конусовидными выростами с заостренной, слегка изогнутой верхушкой. Клетки эпидермиса цветочных чешуек вытянутые извилистостенные, по краю с многочисленными простыми одноклеточными тонкостенными волосками {трава овса посевного) (рис. 10); - обрывки эпидермиса язычковых цветков с извилистыми стенками клеток и сосочковидными выростами, обрывки или цельные трубчатые обоеполые цветки с прямыми или слегка извилистыми клетками эпидермиса с тонкими стенками и эфиромасличными железками, состоящими из 6-8 клеток, расположенных в 2 ряда и 3-4 яруса (цветкиромашки) (рисЛ1); - обрывки верхнего (внутреннего) эпидермиса с извилистыми стенками и складчатой кутикулой, устьица отсутствуют; клетки нижнего (наружного) эпидермиса почти ровноконтурные с немногочисленными устьицами; эфирномасличные (лупулиновые) железки (щитковидные железистые волоски) состоят из одно- двухклеточной ножки и многоклеточной головки, некоторые из которых с бурым содержимым; простые одноклеточные тонкостенные конические волоски, расширенные у основания, варьирующие по размеру; в мезофилле многочисленные друзы оксалата кальция (шишки хмеля) (рис.12); - рыхлая основная ткань корневища, с крупными межклетниками (аэренхима); клетки ее округлые, овальные, заполнены крахмалом. Крахмальные зерна очень мелкие, простые. В клетках основной ткани, обычно более крупных, содержится эфирное масло желтоватого цвета. Встречаются фрагменты проводящих пучков, в составе которых спиральные и лестничные сосуды, волокна (корневища аира) (рис.13); - удлиненные клетки эпидермиса с утолщенными прямыми или слегка извилистыми пористыми стенками с устьицами или без устьиц. Устьица погруженные, с характерной лучистой складчатостью кутикулы, расположены обычно в два - три ряда, реже в четыре и один. На коротких стенках (стыках) некоторых клеток эпидермиса видны выросты, которые при рассмотрении препарата с поверхности, имеют вид спаренных кружочков, а при рассмотрении сбоку — вид закругленных или зубчатых выступов с ясно выраженной перегородкой (трава хвоща полевого) (рис.14); - обрывки пробки и тонкостенной паренхимы, клетки которой содержат большое количество крахмальных зерен, группы склеренхимных волокон коры и древесины обычно с остатками кристаллоносной обкладки, а также обрывки сосудов с широкими короткими члениками («бочковидные») имеют Для подтверждения подлинности сбора наряду с «Внешними признаками» и «Микроскопией» нормативная документация должна/ содержать методики качественного обнаружения действующих веществ. Хроматография. Для качественного обнаружения биологически; активных веществ в лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах наиболее целесообразным является использование метода хроматографии в тонком слое сорбента. Наиболее значимым для предлагаемого сбора является обнаружение в его составе изофлавоноидов. Поэтому для. определения подлинности сбора нами разработаны условия хроматографического определения данной группы БАВ. Для проведения анализа использовали экстракт сбора на 40%-ном этиловом спирте, полученный для количественного определения суммы изофлавоноидов. Хроматографию проводили на. пластинах Kieselgel F254 (Merk) в системе хлороформ-метанол (97:3) в присутствии известных веществ формононетина и ононина. Проявление хроматограммы осуществляли в УФ-свете при длинах волн 365/254 нм. Методика. 10 мл раствора А, приготовленного для количественного определения суммы изофлавоноидов в сборе, помещали в выпарительную чашку и удаляли растворитель досуха. Остаток в чашке смывали 95%-ным этиловым спиртом и наносили на пластину микропипеткой 0,02: мл полученного раствора полосой 18-20 мм. На расстоянии 2 см. от пятна наносили микропипеткой по 0,015 мл растворов известных веществ ононина и формононетина. Пластину подсушивали на воздухе, и хроматографировали при комнатной температуре в вертикальной камере в системе растворителей хлороформ-метанол (97:3). После прохождения фронта растворителя 15-17 см хроматограмму вынимали и высушивали на воздухе, затем просматривали в УФ-свете при длинах волн 365/254 нм.
На хроматограмме исследуемого извлечения наблюдали зоны адсорбции с Rf около 0,09 и 0,64, имеющие бурую флюоресценцию, соответствующие известным веществам ононина и формононетина (рис.16).
Для обеспечения высокого уровня стандартизации лекарственных средств растительного происхождения необходимо применять объективные, современные методы количественного определения биологически активных веществ. Для количественного определения суммы изофлавоноидов в исследуемом сборе предлагаем использовать спектрофотометрический метод [15,29,35,40,59,62, 101, 144].
Для характеристики электронного спектра сбора использовали экстракт на 40%-ном этиловом спирте. Оптическую плотность экстракта измеряли на спектрофотометре в диапазоне длин волн от 220-1000 нм. В качестве раствора сравнения использовали 40%-ный этиловый спирт. Как показано на рисунке 17, в ультрафиолетовой области спектра экстракта сбора присутствуют максимумы поглощения, характерные для изофлавоноидов (X max - ононин 258±5нм, формононетин 248±5нм, генистеин 260±5нм, биоханин 261±5нм) [154].
