Введение к работе
Актуальность. Процессам свободно-радикального окисления в организме, приводящим к старению и гибели клеток и организма в целом, наследственным отклонениям, нарушению обмена веществ и образованию опухолей, противостоит эффективная система защиты. Ее основу составляют вещества, относящиеся к различным классам химических соединений, но объединенные способностью переводить свободные радикалы в неактивное состояние - антиоксиданты. К ним относятся как собственные антиоксидантиые вещества, вырабатываемые организмом, так и антиоксиданты, поступающие извне: витамины (С, Е, (3-каротин), минеральные вещества (соединения селена, магния, меди), некоторые аминокислоты, растительные полифенолы (например, флавоноиды).
Одним из значимых полифенольных флавоиоидов, являющимся эффективным антиоксидантом, является дигидрокверцетин (ДКВ), также проявляющий Р-витаминную активность [Ткжавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А., 1996]. За прошедшие годы выявлено его противовоспалительное, радиопротекторное, антигистаминное, противоопухолевое, антидиабетическое, капилляроукрепляющее действие. ДКВ также влияет на ферментные системы, антиоксидантную активность и проявляет сродство к фосфолипидным компонентам мембран.
Взаимодействие ДКВ с ферментными системами, его антиоксидантная активность сопряжены с реакциями катализа и редокс-процессов с участием ионов переходных металлов, таких как Cu2+, Zn2+, Сг3+, Мп2+, а также с процессами окислительной биодеструкции, промотируемыми ионами щелочных (Na\ К+) и щелочноземельных (Са2+, Mg2+) металлов.
В зависимости от природы ионов металла, рН среды, присутствия других веществ, способных синергетически поддерживать окислительное равновесие в биологической системе, возможна реализация различных механизмов действия ДКВ и, соответственно, достижения прогнозируемого лечебного эффекта.
Разработка новых лекарственных средств (ЛС) и биологически активных добавок (БАДы), представляющих миперало-биотические комплексы, требует знания о возможных взаимодействиях компонентов ЛС в твердом состоянии, в растворах, яри
хранении, способах стабилизации и повышения эффективности действия ЛС и умения прогнозировать свойства ЛС в живой системе.
Целью настоящем работы является разработка новых минерало-биотичееких комплексов на основе дигидрокверцетина и соединений металлов, изучение их физико-химических свойств, выявление условий хранения и стабилизации изучаемых комплексов. Задачи исследования:
Исследование условий получения, изучение физико-химических свойств и стабильности по отношению к окислительным процессам комплексов дигидрокверцетина с ионами щелочных ("Na+, К+), щелочноземельных (Са~+, Mg2+) и переходных металлов (Cu2+, Zn2+, Cr3+, Mn2+ ) в водной среде.
Разработка методов анализа дигидрокверцетина при совместном присутствии с соединениями металлов, комплексов ДКВ с ионами металлов.
Выбор оптимального стабилизатора в составе минерало-биотического комплекса, изучение синергизма их действия.
Прогнозирование проницаемости через мембрану компонентов комплекса, включающих дигидрокверцетин и ионы металлов, проведение сравнительного анализа с препаратами хромоновой группы на синтетических моделях биомембран.
Выбор и обоснование оптимального состава минерало-биотического комплекса, включающего дигидрокверцетин, аспарагинаты переходных металлов и аскорбиновую кислоту.
Фармакологические исследования разработанной фармацевтической композиции.
7. Разработка проекта нормативной документации на новую биологически активную
добавку.
Научная новизна.
Впервые изучены условия получения комплексов дигидрокверцетина с аспарагинатами металлов, исследованы их физико-химические свойства, спектральные свойства в УФ и видимой области. Выявлены показатель К, отражающий вклад интенсивности поглощения хромонового и катехолятного циклов, и длина волны, характеризующая появление новых комплексов в растворах, что может быть рекомендовано для анализа на подлинность минерало-биотических комплексов.
Изучены УФ спектры комплексов в процессе окисления дигидрокверцетина в водных растворах под действием света и в присутствии кислорода воздуха, а также в присутствии ионов металлов. Выявлена полоса поглощения, характеризующая окисленную (хиноидную) форму дигидрокверцетина и доказано, что введение аскорбиновой кислоты приводит к стабилизации комплекса при хранении.
Предложены методики качественного и количественного анализа дигидрокверцетина, ионов металлов, аскорбиновой кислоты в предлагаемых фармацевтических композициях.
Исследованы межмолекулярные взаимодействия комплексов
«дигидрокверцетин - аспарагинаты металлов» с гидрофильными и липофильными фрагментами биомембран на искусственных моделях. Эти результаты использованы для прогнозирования проницаемости компонентов комплекса через биомембрану.
Разработан минерало-биотический комплекс «Офтальвит» на основе дигидрокверцетина, аскорбиновой кислоты и аспарагинатов цинка и хрома. Практическая значимость результатов исследования.
Фармакологические исследования, проведенные в офтальмологическом отделении городской больницы № 35 г. Нижнего Новгорода, показали, что у больных, принимающих биологически актавную добавку «Офтальвит», содержащую дигидрокверцетин, аскорбиновую кислоту и аспарагинаты хрома и цинка, улучшаются показатели перекисного окисления липидов и кровоснабжение нервозрительиого аппарата при диабетической ретинопатии.
По результатам исследований разработан проект фармакопейной статьи предприятия на указанную биологически активную добавку.
Состав на основе дигидрокверцетина, аспарагинатов цинка и хрома внедрен НПП «Росбиопром», г. Сэров Нижегородской области (торговая марка «Офтальвит»), предназначенный для лечения диабетической ретинопатии и других заболеваний зрительного аппарата (акт внедрения). Апробация работы.
Результаты работы были представлены на Всесоюзном конгрессе «Рациональное использование лекарств», г. Пермь, 2004 г; Международной конференции «From molecules towards materials», г. Нижний Новгород, 2005г„ Международном семинаре «Новые лекарственные средства: успехи и перспективы», г.Уфа, 2005 г, [Межвузовской конференции молодых ученых «Современные проблемы фармации», г.Самара, 2006 г.
По результатам исследований опубликовано 3 статьи в ведущих российских и международных журналах («Ремедиум», Мексиканский химический журнал «2 Гош aoademioo nacional de Ingenierlas у Arquileetura», Казанский медицинский журнал) и 4 тезисов научных конференций.
Работа выполнена в рамках совместного проекта ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава» с научно-производственным предприятием «Росбиопром» (г. Сэров Нижегородской области). Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертация выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований Проблемной комиссии «Фармация» ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава» (№ государственной регистрации 01200409406). Положения, выносимые иа защиту:
- результаты изучения физико-химических свойств комплексных соединений
дигидрокверцетина с аспарагииатами металлов (Са2+, Мп2*, Cr31", Zn2+, Cu2+) как
компонентов биологически активных добавок в водной среде;
- УФ и ИК спектральные исследования, данные потенциометрии, тензиометрии
комплексных соединений дигидрокверцетина с аспарагииатами металлов и условия
проведения анализов для установления подлинности компонентов разрабатываемых
минерало-биотических комплексов;
- адаптированные методики количественного определения дигидрокверцетина,
аскорбиновой кислоты в присутствии аспарагинатов металлов;
- результаты исследований проницаемости (пенетрации) компонентов изучаемых
комплексов в липидные и гидрофильные фрагменты биомембраи на искусственных
моделях;
разработка и обоснование оптимальных составов минерало-биотических комплексов «дигидрокверцетин-аспарагинаты металлов»;
разработка проекта фармакопейной статьи предприятия на мииерало-биотичеекпй комплекс, содержащий дигидрокверцетин, аскорбиновую кислоту, аспарагинаты хрома и цинка.
Структура и обьем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав (литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и клииико-лабораторпой оценки биологически-активной добавки «Офтальвит»), списка цитируемой
литературы, приложения, включающего проект нормативной документации на лекарственный препарат «Офтальвит», акты внедрения и отчет о проведенных клинико-лабораторных испытаниях. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 20 рисунков. Список цитируемой литературы включает 115 наименований. Объекты исследования и используемые материалы.
Аспарагинаты цинка Zn(C4N04H6)2, хрома СлчАЫС^йУз, кальция Ca(C4N04Hf,)2, меди Cu(C4N04H6)2, марганца Mn(C4N04H6)2 и кобальта Co(C4N04H(,)2 были 99% чистоты и получены от ОАО «Кристалл».
Церулоплазмин - КФ 1.16.3.1 был представлен ФГУП НПО «Микроген» Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов «ИмБио».
Дигидрокверцетии (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-[3',4',-дигидроксифенил]-4Н-1-бензопиран-4-он), полученный из древесины лиственницы Даурской, был предоставлен НПП "Росбиопром" (г. Сэров Нижегородской области). ДКВ был многократно перекристаллизован из смеси спирта с водой и высушен до постоянной массы и соответствовал требованиям ФС 42-3853-99.
Концентрацию ДКВ определяли методом цианидиихлоридной пробы и анализом УФ-спектров в области Х]П(И=290нм в соответствии с калибровочным графиком.
Лецитин (1-пальмитоил-2-олеил-8п-глицерофосфатидилхолин) 99% чистоты, для получения модельных биомембран использован в виде хлороформного раствора (SIGMA Chemical Со).
Приборы и техника эксперимента.
Электронные спектры были записаны в области 200-700им в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре "Specord М-40" фирмы Carl Zeiss Ієна (DDR). Спектры записывались в сравнении с бидистиллированной водой.
Идентификация ДКВ в БАД проводили методом ВЭЖХ иа хроматографе «Shimadzu LC-10». ГСО ДКВ определяли на колонке С18, подвижная фаза- смесь ацетонитрила и воды (градиентный режим) при скорости потока подвижной фазы Імл/мик. Спектр поглощения - 230 им и 287 им.
ИК-спектры исследуемых образцов были получены на ИК-спектрометре "Shimadzu LC-10Avp" в области 3200-500 см"1 в виде смесей с бромистым калием при концентрации изучаемых веществ в смеси 0,1-0,3%, а также в тонкой пленке вазелинового масла.
Изотермы сжатия 7t=f(A0) были получены на автоматизированной установке,
Размер тефлоновой ванны 200х137*2(мм). Весы Ленгмюра, снабженные ИК-
датчиком, позволяют обеспечить точность измерения поверхностного давления я, равную 0,05мН/м, погрешность определения молекулярной площади по стандарту -арахиновой кислоте - составляла не более 2-5%.
Измерение поверхностного натяжения растворов производили двумя методами: полустатическим методом максимального давления образования пузырька и методом пластинки Вильгельми.
Содержание катионов определялось методом АЭС ИСП на многоканальном анализаторе эмиссионных спектров МАЭС марки АЭС ИСП-28 и фотометрически. Использовался спектрофотометр видимой области НАСН DR/2000 с кюветами толщиной ] дюйм. Во всех определениях применялись градуиравочныс кривые, заложенные в прибор производителем.
Исследования метаболитических показателей у больных с диабетической ретинопатией, старческой дальнозоркостью, глаукомой и миопатией различной этиологии оценивали:
- по интенсивности свободно-радикального окисления методом хемилюминисценции,
индуцированной железом и пероксидом водорода.
- по уровню первичных продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) -
диеновых коиъюгатов (ДК) и триеновых коиъюгатов (ТК) в метанол-гекеановой фазе
экстракта липидов при длинах волн 232нм и 275нм, а также по содержанию конечных
продуктов - оснований Шиффа (ОШ) методом флуоресценции при длине волны
возбуждения 365мм и длине волны эмиссии 420нм.
![Кукурбит[n]урилы и комплексы металлов - супрамолекулярные аддукты, комплексы и соединения включения](/i/i/4229/371797.png "Кукурбит[n]урилы и комплексы металлов - супрамолекулярные аддукты, комплексы и соединения включения Герасько Ольга Анатольевна")
