Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы по исследуемым объектам. Методы анализа фенольных соединений нефлавоиоидной природы 8
1.1. Общие сведения о фенольных соединениях 9
1.2. Распространение фенольных соединений 10
1.3. Фармакогностические и фармакологические характеристики растений, содержащих в качестве индикаторных компонентов ресвератрол и пицеид.. 13
1.3.1. Горец гребенчатый Polygonum cuspidatum L 13
1.3.2. Виноград культурный Vitis vinifera L 15
1.4. Фармакогностические и фармакологические характеристики растений, содержащих в качестве индикаторных компонентов тирозол, гидрокситирозол и (или) салидрозид 18
1.4.1. Родиола розовая Rhodiola rosea L 18
1.4.2. Красная щетка Rodiola quadrifida Fischer et Meyer 20
1.4.3. Олива европейская Olea europaea 21
1.5. Фармакогностические и фармакологические характеристики растений, содержащих в качестве индикаторных компонентов гидрохинон и арбутин.23
1.5.1. Брусника обыкновенная Vaccinium vitis-idaea L 23
1.5.2. Толокнянка обыкновенная Arctostaphylos uva-ursi (L.) spreng 26
1.5.3. Бадан толстолистный Bergenia crassifolia (L.) Fritsch 28
1.5.4. Груша обыкновенная Pyrus communis L 30
1.6. Фармакогностические и фармакологические характеристики растений, содержащих в качестве индикаторных компонентов флоретин и флоридзин32
1.6.1. Яблоня домашняя Malus domestica Borkh 32
Выводы по главе I: 34
Глава II. Методы анализа фенольных соединений нефлавоиоидной природы в растительных объектах и продуктах на их основе 35
2.1. Физические свойства фенольных соединений нефлавоиоидной природы 35
2.2. Химические свойства фенольных соединений 36
2.3. Выделение растительных фенолов 36
2.4. Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям 37
2.5. Фармакопейные методы идентификации фенольных соединений нефлавоноидной природы 40
2.6. Физико-химические методы идентификации фенольных соединений нефлавоноидной природы 42
Выводы по главе II: 47
Глава III. Материалы и методы исследования 48
3.1. Оборудование и реактивы 48
3.2. Стандартные образцы 48
3.3. Объекты исследования 50
Глава IV. Разработка методик ВЭЖХ-анализа для идентификации, разделения и количественного определения фенольных соединений нефлавоноидной природы в лекарственном и пищевом-растительном сырье, продуктах его переработки и лекарственных препаратах на их основе 56
4.1. Основные валидационные параметры методик определения 56
4.2. Анализ ресвератрола и пицеида в растительном сырье горца гребенчатого и винограда культурного и продуктах на его основе 59
4.3. Анализ тирозола, гидрокситирозола и (или) салидрозида в растительном сырье родиолы розовой, красной щетки и оливы европейской и продуктах на его основе 69
4.4. Анализ гидрохинона и арбутина в растительном сырье толокнянки обыкновенной, брусники обыкновенной, бадана толстолистного и груши обыкновенной и продуктах на его основе 80
4.5. Анализ флоретина и флоридзина в растительном сырье яблони домашней и продуктах на его основе 92
Общие выводы 100
Список литературы 102
- Виноград культурный Vitis vinifera L
- Физико-химические методы идентификации фенольных соединений нефлавоноидной природы
- Анализ ресвератрола и пицеида в растительном сырье горца гребенчатого и винограда культурного и продуктах на его основе
- Анализ гидрохинона и арбутина в растительном сырье толокнянки обыкновенной, брусники обыкновенной, бадана толстолистного и груши обыкновенной и продуктах на его основе
Введение к работе
Актуальность темы
Использование лекарственных препаратов на растительной основе становится в последнее время все более актуальным. Такие лекарственные препараты обладают многочисленными положительными эффектами при минимальном количестве побочных действий. Одними из важнейших компонентов растительных экстрактов являются полифенольные антиоксиданты. Наряду с более изученными флавоноидами и производными гидроксикоричных кислот эта группа включает фенольные соединения нефлавоноидной природы (ФСНП), среди которых высокой биологической активностью обладают производные дигидроксистильбена (ресвератрол и пицеид), п-гидроксифенилэтанола (тирозол, гидрокситирозол и салидрозид), 1,4-дигидроксибензола (гидрохинон и арбутин) и 1,3,5-тригидроксибензола (флороглюцина) (флоретин и флоридзин), обладающие антиоксидантными, противовоспалительными, антивирусными, антибактериальными и антиаллергенными свойствами и другими типами биологической активности.
Описание некоторых лекарственных растений, содержащих ФСНП, легли в основу статей ряда зарубежных фармакопей (Европейской (Ph. Eur. VI), Британской (BP 2009), Французской (Ph. Fr. X), Немецкой (DAB 2008), Американской травяной (AHP 2008), Японской (JP 15), Китайской) на корневища и корни горца гребенчатого, лист винограда культурного и вино из него, листья толокнянки обыкновенной, лист и масло оливы европейской, плоды яблони домашней. В отечественной нормативной документации качественный и количественный анализ ФСНП встречается только в трех статьях ГФ XI: определение салидрозида в корневищах и корнях родиолы розовой, определение арбутина в листьях брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной. Статья ГФ XI на корневища бадана, несмотря на высокое содержание в нем арбутина и гидрохинона, нормирует содержание только малоспецифичных дубильных веществ, не являющихся индикаторными компонентами сырья.
Идентификация и количественное содержание ФСНП в этих растениях и продуктах на их основе может позволить рассматривать их в качестве источника соответствующих ФСНП и при разработке и производстве лекарственных препаратов на их основе. Необходимость определения незначительных концентраций ФСНП на фоне сложного матрикса предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа, поэтому для проведения работ нами был выбран метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Цель и задачи исследования
Цель: исследовать различные лекарственные и пищевые растительные источники на наличие фенольных соединений нефлавоноидной природы, установить их количественное содержание. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи.
Изучить физико-химические свойства ФСНП (растворимость, УФ- и видимые спектры, хроматографическая подвижность).
Подобрать оптимальные хроматографические условия анализа ФСНП на фоне сложного матрикса растительных объектов и продуктов на их основе.
Разработать методики пробоподготовки для сырья и продуктов на его основе, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции ФСНП из объектов при невысокой трудоемкости.
Оценить хроматографические параметры, метрологические характеристики, провести валидацию методик количественного определения.
Апробировать разработанные методики на лекарственном и пищевом растительном сырье, продуктах их переработки и лекарственных препаратах на их основе.
Подготовить проекты нормативной документации для лекарственного и пищевого растительного сырья, продуктов их переработки и лекарственных препаратов на их основе, содержащих ФСНП.
Научная новизна результатов исследования
Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных фенольных соединений нефлавоноидной природы: ресвератрола и пицеида в горце гребенчатом и винограде культурном; тирозола, гидрокситирозола и (или) салидрозида в родиоле розовой, красной щетке и оливе европейской; гидрохинона и арбутина в бруснике обыкновенной, толокнянке обыкновенной, бадане толстолистном и груше обыкновенной; флоретина и флоридзина в яблоне домашней.
Практическое значение результатов исследования
Результаты работы переданы для использования в соответствующих статьях 4 части ГФ XII и включены в сборник «Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи». Разработанные методики применялись при экспертизе более 100 образцов лекарственного и пищевого растительного сырья и продуктов на их основе для целей государственной регистрации БАД к пище растительного происхождения.
Апробация работы
Результаты исследований доложены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (май 2007, Рязань); Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (к юбилею профессора О. Г. Ларионова) (июль 2007, Москва), Х Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей «Итоги и перспективы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (ноябрь 2007, Москва), Конгрессе «Фитофарм 2008» (июнь 2008, Санкт-Петербург), XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (ноябрь 2008, Москва), на научных конференциях кафедры фармацевтической и токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (с августа 2010 г Первый МГМУ им. И.М. Сеченова) (2006 – 2010 гг.); Конгрессе «Фитофарм 2010» (июнь 2010, Санкт-Петербург).
Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им И.М. Сеченова 4 октября 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК России.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545, «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований. Рег. № 01.2.006.06352».
Объем и структура работы
Виноград культурный Vitis vinifera L
Синонимы: Vitis vinifera var. sativa Beck.; Vitis byzantina, Vitis deliciosa, Vitis antiquorum, Vitis allemanica Andrasovs.; Vitis vinifera ssp. sativa Beg.
Лиана винограда достигает ЗО—40 метров длины, в средней полосе России, как правило, всего 1,5—3 м. Лиана прикрепляется с помощью усиков, которые обвивают опоры. Кора на старых стволах коричневая, глубоко-бороздчатая, с отделяющейся коркой, на молодых — желтоватая или красноватая. Листья очерёдные, черешковые, цельные, трёх- или пятилопастные. Цветки мелкие, обоеполые, зеленоватые, собраны в рыхлую или густую метёлку. Чашечка маленькая, блюдцеобразная с пятью малозаметными зубчиками; венчик пятилепестный, желтовато-зеленый: лепестки около 5 мм длины, внизу свободные, в верхней части сросшиеся в виде колпачка, который сбрасывается при распускании цветка. Тычинки в числе 5, по длине превышающие пестик. Завязь верхняя, двугнездная, при основании с железками, более или менее спаянными в кольцо; столбик короткий; рыльце малозаметное. Цветёт виноград в мая—июне, плодоносит в августе—сентябре, некоторые сорта в октябре. Плоды — сочные ягоды с 1—4 мелкими семенами (в некоторых сортах семена отсутствуют) — собраны в гроздья, которые сильно варьируют по форме, окраске: могут быть зелёными, розовыми, жёлтыми, тёмно-красными, чёрно-фиолетовыми (обычно с восковидным налётом).
Одно из самых древних культурных растений Евразии [12]. В России иногда встречается в одичавшем состоянии на Кавказе и в Средней Азии. Широко культивируется на Кавказе, в Средней Азии, в Молдавии, на Украине, в южных районах России. Средняя урожайность ягод 5-6 т с 1 га.
Химический состав винограда культурного.
Насчитывается несколько тысяч сортов винограда, сильно отличающихся по химическому составу плодов. Ягоды винограда культурного содержат углеводы (18—20%): глюкоза, фруктоза и немного сахарозы, около 2,5% органических кислот (яблочная, винная, глюкуроновая, лимонная, янтарная, муравьиная, кремниевая, следы щавелевой и салициловой кислот), пектиновые и дубильные вещества (энотаннин), состоящие из флобафена и галловой кислоты (до 3,4%); витамины Bl, В6, В12, С, Р, РР, каротин, значительное количество фолиевой кислоты и минеральные соли: 2,25 мг% калия, кальция и магния, железа и двойные соли от этих же элементов, красящие вещества, флавоноиды: кверцетин, мирицетин, катехины, антоцианы (гликозиды дельфинидина, петунидина, мальвидина; пеонидин, цианидин), проантоцианидины, стильбены ресвератрол и его гликозид пицеид, а также фитостерины. Листья содержат сахара (около 2%), винную, яблочную и протокатеховую кислоты, дубильные вещества, инозит, кверцетин, каротин, холин, бетаин и алоксуровые основания. Семена содержат жирное масло (до 20%), дубильные вещества (до 8%), лецитин, ванилин, витамин Е [12, 55].
Фармакологическая характеристика фенольных соединений винограда культурного. Доказана эффективность длительного применения плодов винограда и их сока для регуляции кровяного давления и при функциональных нарушениях сердечно-сосудистой системы, а также экстракта из листьев красного винограда при варикозном расширении вен. Листья винограда оказывают также противовоспалительное, антисептическое, кровоостанавливающее и ранозаживляющее действие. Из винограда вырабатывали препарат натурозу, который применялся для внутривенных инъекций при больших потерях крови, при коллапсе и шоке. Водный настой рекомендуют для полоскания полости рта при ангинах и стоматитах. Семена винограда обладают мочегонным, потогонным и желчегонным эффектами [86].
Физико-химические методы идентификации фенольных соединений нефлавоноидной природы
Для испытания подлинности, чистоты и количественного определения многих фенольных соединений используют спектральные и хроматографические методы (БХ, ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ) [2,18, 20, 27, 32,84].
Колориметрические методы основаны на измерении оптической плотности окрашенных растворов в видимой области спектра. Суммарное содержание полифенольных соединений (обычно в пересчете на галловую кислоту, танин или катехин) определяют методом Фолина-Чокальтеу, основанным на образовании раствора окислов вольфрама и молибдена, с максимумом абсорбции при длине волны 750 нм [25].
Хроматографические методы анализа.
Наиболее распространенным методом идентификации и количественного определения фенольных соединений в настоящее время является ВЭЖХ [6,34,38,42]. Ввиду относительно высокой полярности полифенольных соединений практически не используется НФ-ВЭЖХ на силикагеле. Наиболее широко используется. ОФ-ВЭЖХ, т.е. хроматографический процесс, при котором неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная [7,37,40,43].
В обращенно-фазовой жидкостной хроматографии часто используется химически модифицированный длинноцепочечными (С 18, С16, С8) алкилсиланами силикагель (химически привитая обращенная фаза), поверхность которого становится малополярной в результате образования устойчивых к гидролизу обычно при рН 2-8 Si-0-Si-C связей. Силикагель переводят в обращено-фазовый сорбент путем реакции с алкилтрихлорсиланом, чаще всего октадецил-трихлорсиланом. В результате поверхность силикагеля модифицируется химически связанным Сі8 -углеводородными цепями. В отличие от НФ-ВЭЖХ на силикагеле, при ВЭЖХ на химически привитых фазах механизм разделения основан не только на явлениях адсорбции (за счет гидрофобных взаимодействий между разделяемыми компонентами и углеводородными цепями сорбента), но включает и ЖЖР между ПФ и слоем растворителя, удерживаемого неполярной поверхностью сорбента.
В анализе фенольных соединений методом ВЭЖХ в качестве элюента наиболее часто используются водные смеси с полярными, водорастворимыми органическими растворителями: метанол, ацетон, ацетонитрил. Величина рН среды является одним из главных факторов. Чаще всего используются такие кислоты как муравьиная, уксусная, фосфорная кислоты, а также кислотный фосфатный буфер, для подавления диссоциации полифенолов при кислотных рН и образования неионогенных форм фенольных соединений.
Для детектирования всех классов фенольных соединений не существует определенной фиксированной длины волны в УФ-видимой области. Область 270 - 290 нм широко используется для определения фенольных соединений [2,28,29].
Флуориметрический детектор по чувствительности и селективности превосходит спектрофотометрический, однако, ввиду отсутствия удобных для детектирования максимумов эмиссии в видимой области спектра, используется намного реже спектрофотометрии.
Электрохимическое детектирование (ЭД) — чувствительный метод для соединений, которые способны легко окисляться или восстанавливаться. ЭД становится всё более важным способом для определения очень малых количеств соединений в исследуемых объектах. Недостатком указанного способа детектирования являются высокие требования к чистоте используемых реактивов и воды, сложность обслуживания детектора [32].
Масс-спектрометрическое детектирование (ВЭЖХ-МС или ГЖХ-МС) дает более полную информацию о структуре соединения. При ВЭЖХ-МС электроспрей ионизация (ЭСИ), ионспрей (ИС) и химическая ионизация под атмосферным давлением (ХИАД) на сегодняшний день являются самыми распространенными приемами, которые позволяют анализировать широкий спектр соединений с различной молекулярной массой и полярностью. ВЭЖХ широко применяется в анализах фенольных соединений нефлавоноидной природы (ФСНП), используя при этом различные ВЭЖХ условия (таблица 3) [41].
Анализ ресвератрола и пицеида в растительном сырье горца гребенчатого и винограда культурного и продуктах на его основе
Выбор оптимальных условий для разделения индикаторных фенольных соединений горца гребенчатого и винограда культурного
Использование горца гребенчатого в различных лекарственных формах и комбинированных препаратах, а также плодов винограда привело к необходимости поиска индикаторных компонентов, которые позволили бы выделять его на фоне сложных матриксов и служили бы критерием качества самого сырья.
В качестве таких веществ можно использовать фенольные соединения нефлавоноидной природы, присутствующие в существенных количествах и во многом обуславливающие фармакологическое действие горца и винограда.
Для выбора оптимальной аналитической длины волны детектирования были изучены УФ-спектры имеющихся стандартных образцов производных дигидроксистильбена: транс-ресвератрола (в дальнейшем ресвератрол) и транс-пицеида (в дальнейшем пицеид). Было показано, что они имеют максимумы поглощения при длинах волн 215-220 и 307-318 нм (см. рис. 25). В качестве аналитической длины волны детектирования предпочтительно использование полос поглощения с большей длиной, как более специфичной. Кроме этого коэффициент молярной экстинкции при 307 нм имеет большую величину по сравнению с диапазоном 215-220 нм. На основании этого детектирование ресвератрола и пицеида при ВЭЖХ исследовании проводили при длине волны 307 нм.
Для проведения анализа использовалась обращенно - фазовая ВЭЖХ. Колонка: Waters Symmetry С18, 5 мкм 250мм х 4.6 мм Температура термостата 30 С Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин УФ - детектор. Длина волны детектирования 307 нм
Объем вводимой пробы 10 мкл
Подбор оптимальной подвижной фазы осуществлялся в следующих условиях:
1. Метанол : водный раствор фосфорной кислоты (рН2.5) (45:55)
2. Метанол : водный раствор фосфорной кислоты (рН 2.5) (40:60)
3. Ацетонитрил : водный раствор фосфорной кислоты (рН 2.5) (25:75)
4. Ацетонитрил : водный раствор фосфорной кислоты (рН 2.5) (30:70)
5. Ацетонитрил : водный раствор трифторуксусной кислоты (рН 2.5) (градиентное элюирование от 15:85 до 35:65)
6. Ацетонитрил : водный раствор трифторуксусной кислоты (рН 2.5) (30:70)
Оптимальное разделение, давление в колонке и время выхода пиков было достигнуто при использовании подвижной фазы №6 (рис. 26). Идентификацию пиков проводили, сравнивая времена удерживания и спектры каждого вещества на приборе «Agilent» 1100 series со стандартными веществами.
Времена удерживания пицеид - 5,1 и ресвератрол - 8,3 минуты.
В горце гребенчатом пицеид практически не обнаруживается. Более высокое содержание пицеида по сравнению с ресвератролом характерно для экстрактов, соков и вин на основе винограда (рис. 27).
Подготовка проб и подбор оптимальных условий экстракции ресвератрола и пицеида для хроматографического анализа
Исследуемые объекты представляют собой сложные многокомпонентные системы, содержащие комплекс химических веществ. При экстракции, наряду с основными биологически активными веществами, извлекается большое количество сопутствующих балластных соединений, затрудняющих анализ. Один из путей повышения селективности экстракции является подбор растворителей.
В работе Парка Йонг Куна и Икегаки Масахару [57] была приведена сравнительная характеристика смесей спирта с водой в различных концентрациях для экстракции. Были исследованы водные растворы этанола с концентрациями 5%, 20%, 35%, 50%, 65%, 80% и 96% и водные растворы метанола с концентрациями 5%, 20%, 35%, 50%, 65%, 80%, 90% и 100%, а также водный экстракт. Контроль полноты экстракции осуществлялся методом ВЭЖХ при 307 нм. Во всех образцах были получены одинаковые пики с максимумом поглощения при длине волны 307 нм. Уровень абсорбции при данной длине волны сильно отличался в зависимости от концентрации спирта. Водный экстракт показал наименьший результат в сравнении с водно-спиртовыми смесями, где содержание возрастало вместе с концентрацией спирта до значения концентрации 80%, при использовании метанола значения также были выше. В экстрактах с содержанием 96% этанола или 90%о и 100%о метанола наблюдалось уменьшение абсорбции при длине волны 307 нм (табл. 6).
Оптимальной для экстракции оказалась смесь воды с метанолом с концентрацией 80 % [26].
Методики проведения экстракции
Подготовка проб для анализа растительного сырья: образец сырья тщательно измельчают, отбирают около 1,00 г (точная навеска), помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл, экстрагируют 50 мл 80%) раствора метанола в течение 30 минут на водяной бане с обратным холодильником при перемешивании. После этого пробу обрабатывают ультразвуком в течение 10 минут, фильтруют, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, и доводят объем раствора до метки 80% метанолом.
Подготовка проб для анализа растительных экстрактов: около 100 мг экстракта (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют около 50 мл 80% раствора метанола, растворяют и доводят объем раствора до метки 80 % раствором метанола.
Подготовка проб для анализа соков, нектаров и вин: около 10,00 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки.
Полученные растворы перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугируют при 14000-15000 об/мин.
Параметры пригодности хроматографической системы и метрологические характеристики методики.
Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики приведены в таблице 7, где: Число теоретических тарелок: N= 5,54(tR/co0,5)2=16(Wcos)2 Разрешающая способность: Rs = 2 (t2{)/(03i+032) Коэффициент разделения: k = t2/ti - 1 Селективность: а= кг / kj tR;i;2 - времена удерживания веществ; соо,5 - ширина пика в половине высоты, полученной непосредственно электронными интеграторами; s;i;2 _ ширина пика в основании полученного, экстраполируя относительно прямые стороны пика к базовой линии; кід - коэффициент разделения соответствующих веществ;
Как следует из таблицы эффективность колонки составила от 14079 до 17107 т.т., селективность колонки 2,1, разрешение составило 15,03. Были определены такие параметры как предел обнаружения, предел количественного определения, диапазон линейных концентраций, линейность (коэффициент корреляции) (таблица 8).
Анализ гидрохинона и арбутина в растительном сырье толокнянки обыкновенной, брусники обыкновенной, бадана толстолистного и груши обыкновенной и продуктах на его основе
На предварительном этапе исследования, было изучено влияние состава подвижной фазы на разделение гидрохинона и его глюкозида -арбутина. Разделение проводилось в режиме обращеннофазовой хроматографии, в частности на колонках С18, при элюировании смесями ацетонитрил—вода или метанол—вода с небольшим содержанием ортофосфорной или трифторуксусной кислоты. Эти подвижные фазы удобны для разделения сложных смесей, как фенольных соединений, так и их гликозидов в условиях изократического и градиентного элюирования и допускают использование УФ-детекторов и ФЛ - детекторов.
Гидрохинон и арбутин по сравнению с полифенольными соединениями обладают более слабыми кислотными свойствами и практически не диссоциируют в условиях подвижной фазы. Поэтому добавление в систему кислоты не приводит к существенному улучшению хроматографических показателей.
В ходе предварительных испытаний нами исследовались разнообразные подвижные фазы. При выборе условий хроматографирования нами сравнивались смеси состава ацетонитрил/вода, метанол/вода в нейтральной среде и с добавлением ортофосфорной кислоты или фосфатного буфера, применительно к разделению модельной смеси арбутина и гидрохинона. Практически все исследованные системы давали хорошее разделение тестовых соединений. В результате экспериментальных исследований-была подобрана изократичная система: метанол-вода (15:85), которая является; оптимальной для разделения арбутина и гидрохинона.
Простые фенольные: соединения детектируются по УФ поглощению при длине волны 280 нм. Поскольку гидрохинон и. его глюкозид, как;нами-было установлено, обладают флуоресценцией с максимумами возбуждения при длине волны 280 нм и эмиссии при длине волны 320 нм, для повышения селективности и чувствительности количественная оценка: арбутина и гидрохинона проводилась по данным флуориметрического: детектирования (рис. 33)
Использование флуориметрического детектора позволило увеличить чувствительность методики до 10 раз, а также значительно повысить селективность, в виду того что компоненты экстрактов, обладающие близкой хроматографической подвижностью "с арбутином, не обладают флуоресцентными свойствами. Таким образом, хроматографическое разделение проводили на колонках «Waters Symmetry» 5мкм С 18(2), 250x4,6 мм, температура термостата 40С. Подвижная фаза метанол : вода = 15 : 85, Скорость потока элюента составляла 1 мл/мин. Обьем вводимой пробы 10 мкл. Длина волны УФ-детектора 280 нм, при использовании ФЛД: длина волны возбуждающего света 280 нм, эмиссия 320 нм. Перед использованием подвижную фазу фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазировали обработкой ультразвуком.
Подготовка проб и подбор оптимальных условий экстракции арбутина и гидрохинона для хроматографического анализа
При подборе условий экстракции были изучены различные способы: влияние полного разрушения клеточных стенок при экстракции водно-ацетоново-гексановой смесью, влияние многократной экстракции чистым растворителем в условиях экстракции на аппарате типа «Сокслет», а так же было изучено влияние времени и концентрации этанола при экстракции водно-этанольными смесями при нагревании с обратным холодильником.
Жидкостная экстракция образцов смесями этанол : вода, около 1,0 г (точная навеска) образца измельчают и помещают в круглодонные колбы с обратными холодильниками, прибавляли по 60 мл 0, 10, 25, 50, 60, 70, 80 и 96% водного раствора этилового спирта и нагревают на водяной бане в течение 30 минут, далее обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 10 минут. Затем сырье отжимают, доводят объем экстракта до 100 мл соответствующим раствором этанола.
Жидкостная экстракция образцов на аппарате типа «Сокслет»: около 5,0 г (точная навеска) измельченных листьев помещают в аппарат типа «Сокслет» заливают 100 мл этанола, и проводят экстракцию в течение 6 часов (30 циклов), затем сырье отжимают, объем экстракта доводят до 100 мл этанолом.
Жидкостная экстракция образцов смесью ацетон : гексан : вода: около 5,0 г (точная навеска) измельченных листьев экстрагируют 50мл смеси ацетон : гексан : вода (1:1:1) в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Затем добавляют 15,0 г аммония сульфата, после расслоения фаз центрифугируют и органический слой упаривают в вакууме на ротационном испарителе. К маслянистому остатку прибавляют 50 мл метанола, нагревают на водяной бане с обратным холодильником до растворения осадка. Метанольный раствор выдерживают в течение 24 часов при - 20 С для осаждения основной части смолистых веществ и других липофильных соединений.
Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм или центрифугируют при 14000-15000 об/мин.
Как видно из полученных данных (табл. 20) многократная экстракция 96% этанолом, как в случае экстракции на аппарате «Сокслет» и экстракция органическим растворителем в случае ацетон : гексан : вода не приводят к существенному увеличению степени извлечения. В связи с этим оптимальным способом, как с экономической точки зрения, так и по трудоемкости является экстракция водно-этанольной смесью при нагревании. В результате изучения влияния времени и концентрации спирта на полноту извлечения было установлено, что оптимальным является экстракция в течение 30 минут 25% водным раствором этанола. На рисунках 36 и 37 приведены данные по изучению влияния экстрагента и времени экстракции на полноту извлечения арбутина.
Пробоподготоека образцов экстрактов: около 100 мг экстракта (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют около 50 мл 25% раствора этанола, растворяют и доводят объем раствора до метки 25 % раствором этанола.
Подготовка проб для анализа соков и нектаров: около 10,00 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки водой. Полученные растворы перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугируют при 14000-15000 об/мин.
Параметры пригодности хроматографической системы и метрологические характеристики методики
Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики приведены в таблице 21.
Подобранная хроматографическая система показала хорошую селективность (2,11) и разделяющую способность (9,94) для арбутина и гидрохинона. Эффективность системы — около 10000 теоретических тарелок для обоих соединений, что позволяет использовать ее для определения арбутина и гидрохинона на фоне сложного матрикса.
Были определены такие параметры как предел обнаружения, предел количественного определения, диапазон линейных концентраций, линейность (коэффициент корреляции) для 2 детекторов (табл.22)
