Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика настоев как лекарственной формы 10
1.1.1. Лекарственная форма настои 10
1.1.2. Способы приготовления настоев 11
1.1.3. Оценка качества настоев 12
1.2. Физико-химические методы, применяемые в исследовании биологически активных веществ растений сем. Яснотковых 15
1.2.1. Хроматографические методы анализа 16
1.2.1.1. Бумажная и тонкослойная хроматография 16
1.2.1.2. Газовая и жидкостная хроматография 17
1.2.2. Спектральные методы 21
1.2.3. Титрометрические методы 23
1.3. Фармакогностическая характеристика растений сем. Яснотковых — объектов исследования 25
1.4. Фармакологическая характеристика основных групп биологически активных веществ растений сем. Яснотковых 30
1.4.1 Фармакологическая характеристика флавоноидов 30
1.4.2. Фармакологическая характеристика дубильных веществ 33
1.4.3. Фармакологическая характеристика органических кислот 34
Выводы 36
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 38
2.1 Объекты исследования 38 -
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Получение настоев 38
2.2.2. Метод спектрофотомерии 39
2.2.3. Метод титрометрии 39
2.2.4. Метод гравиметрии 39
2.2.5. Метод потенциометрии 39
2.2.6. Метод ВЭЖХ 39
2.2.7. Стандартные образцы 41
2.2.8. Методы качественного анализа настоев 41
Глава 3. Изучение флавоноидов в настоях из сырья растений семейства Яснотковых 43
3.1. Качественный и количественный анализ настоев 43
3.2. Количественное определение суммы флавоноидов в настоях 46
3.2.1. Количественный анализ суммы флавоноидов в настоях мелиссы лекарственной и изучение влияния рН экстрагента на их экстракцию 47
3.2.2. Изучение флавоноидного состава настоя травы мелиссы лекарственной методом ВЭЖХ 50
3.2.2.1 Изучение кислотно — основного характера флавоноидов 50
3.2.2.2 Разработка пробоподготовки настоев для проведения ВЭЖХ- анализа 52
3.2.3. Изучение влияния рН экстрагента на экстракцию флавоноидов в
настои из ЛРС семейства Яснотковых 56
Выводы 68
Глава 4. Определение содержания органических кислот и дубильных веществ в настоях методами с использованием индикаторов 70
4.1. Определение содержания суммы свободных органических кислот 71
4.2. Определение содержания суммы дубильных (окисляемых) веществ 70
Выводы 75
Глава 5. Определение суммы органических кислот и дубильных веществ методом потенциометрического титрования 76
5.1. Определение содержания суммы свободных органических кислот потенциометрическим титрованием 76
5.1.1. Изучение возможности использования потенциометрического титрования в количественном определении фенолкарбоновых кислот 79
5.2. Математическая модель по определению состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования 80
5.3. Определение содержания суммы дубильных (окисляемых) веществ потенциометрическим титрованием 85
5.4. Валидационная оценка метода потенциометрического титрования 87
Выводы 90
Общие выводы 91
Литература 93
Приложение 103
- Физико-химические методы, применяемые в исследовании биологически активных веществ растений сем. Яснотковых
- Фармакогностическая характеристика растений сем. Яснотковых — объектов исследования
- Количественный анализ суммы флавоноидов в настоях мелиссы лекарственной и изучение влияния рН экстрагента на их экстракцию
- Математическая модель по определению состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования
Введение к работе
Актуальность темы. Лекарственные растительные средства, обладающие малой токсичностью широко используются в медицинской практике при лечении различных заболеваний организма человека. Из всех видов лекарственного растительного сырья (ЛРС), включенных в Государственный реестр лекарственных средств, около половины используются в виде настоев и отваров для внутреннего и наружного применения.
Сырье, применяемое для получения водных извлечений, содержит различные группы биологически активных веществ (БАВ). Наиболее широко используется ЛРС, содержащее эфирное масло, горечи, флавоноиды, полисахариды, дубильные вещества, витамины, антраценпроизводные. Фармакологическое действие водных извлечений определяется комплексом БАВ, переходящим в настои и отвары из ЛРС.
Для изготовления настоев часто используется сырье растений семейства Яснотковых: листья мяты перечной, шалфея лекарственного, трава мелиссы, душицы, чабреца.
Научный подход к анализу настоев впервые разработан на кафедре фармакогнозии ММА им. И.М. Сеченова профессором А. А. Сорокиной. Большое количество ЛРС, используемого для получения настоев и отваров, не стандартизуется по веществам, составляющим гидрофильную фракцию. Традиционные методы с использованием индикаторов требуют значительного разбавления, что снижает точность анализа. В связи с этим вопросы использования физико-химических методов определения БАВ при идентификации и количественном анализе настоев являются актуальными. Целью настоящего исследования является обоснование применения физико-химических методов в анализе настоев из лекарственного сырья растений семейства Яснотковых: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы чабреца, мелиссы лекарственной, душицы обыкновенной. Задачи исследования:
Провести качественный анализ БАВ и определить их суммарное содержание гравиметрическим методом в настоях изучаемых объектов: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы чабреца, мелиссы лекарственной, душицы обыкновенной.
Разработать методику пробоподготовки для идентификации флавоноидов в настоях с использованием ВЭЖХ на примере настоя травы мелиссы лекарственной.
Провести определение содержания суммы флавоноидов в настоях изучаемых объектов спектрофотометрическим методом.
Изучить возможность управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента.
Разработать методики определения содержания суммы дубильных веществ в настоях редокс титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Провести их сравнительный анализ.
Разработать методики определения содержания суммы органических кислот в настоях кислотно-основным титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Провести их сравнительное изучение.
Предложить описание математической модели, позволяющей определить состав раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакогнозии и кафедры химии ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образований на основе достижений медико-биологических исследований» (код темы 24.10.07 проблема № 1056 АМН РФ, номер Госрегистрации 01.2.006 06352)
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ заключается в изучении вопросов применения физико-химических методов в анализе настоев, учитывающих специфику водных извлечений: низкие концентрации
биологически-активных веществ, окраску извлечений, рН среды и др. Разработаны методики определения содержания в настоях суммы свободных органических кислот и дубильных веществ титрованием с использованием индикаторов и потенциометрических методов. Установлена возможность управления процессом экстракции флавопоидов при получении водных извлечений путем изменения рН экстрагента, создаваемого буферными системами. Разработана методика пробоподготовки для идентификации флавопоидов в настоях с использованием ВЭЖХ - анализа на примере настоя травы мелиссы лекарственной. Описана математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.
состоит в разработке методик качественного и определения БАВ (органических кислот, дубильных веществ, флавопоидов) в настоях, учитывающих их специфику. Описанная математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования положена в основу компьютерной программы «ACD-titr». Составлены методические рекомендации «Определение суммы органических кислот в настоях из ЛРС». Методики потенциометрического титрования органических кислот используются в учебном процессе кафедры аналитической и неорганической химии МГУ Технологий и управления.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены на Конгрессе молодых ученых с международным участием (М.,2008 г.), конференции студенческих научных работ «Татьянин день» (М.,2007 г.), научной конференции кафедры фармакогнозии и межкафедралыюй конференции кафедр ММА им. И. М. Сеченова (2007-2008 г.) ПУБЛИКАЦИИ. По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ.
Физико-химические методы, применяемые в исследовании биологически активных веществ растений сем. Яснотковых
Растения являются природными производителями и накопителями различных классов соединений, таких как эфирные масла, карденолиды, буфадиенолиды, алкалоиды, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины и др. Перед исследователями ставится проблема как качественного, так и количественного анализа различных групп биологически активных веществ (БАВ), а также идентификации индивидуальных соединений. В изучении лекарственного растительного сырья (ЛРС) используются биологические, ботанико-фармакогностические методы, но наиболее часто прибегают к физико-химическим методам, имеющим целый ряд преимуществ(14).
В анализе веществ растительного происхождения наиболее распространение получили методы хроматографии на бумаге, в тонких слоях сорбента, газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) и высоко эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). 1.2.1.1. Бумажная и тонкослойная хроматография
Бумажная хроматография была первым методом, получившим признание в фармацевтическом анализе. Этот метод нашел применение в анализе производных антрахинона, флавоноидов, кумаринов.
Хроматография в анализе флавоноидных соединений производится в основном с применением систем растворителей, состоящих из растворов уксусной кислоты и смесей уксусной кислоты с н-бутанолом (1). Многочисленными исследованиями выявлена зависимость между строением и хроматографическим поведением флавоноидов. Величина Rf снижается при увеличении количества гидроксогрупп в молекуле. Метилирование гидроксилов приводит к увеличению Rf, а ацетилирование может способствовать как повышению, так и понижению Rf . Гликозидироваыие обуславливает снижение Rf на величину, соответствующую введению одной гидроксогруппы. Орто- и вицинальные положения заместителей приводят к исключению из данных правил в сторону увеличения Rf. Идентификацию флавоноидов после хроматографического разделения за исключением флаванонов и флаванолов можно производить без детектирующих агентов, однако для увеличения чувствительности используют реактивы, образующие окрашенные соединения или флуоресцирующие в УФ-свете (1, 14).
Большая чувствительность хроматографии на бумаге при идентификации флавоноидов, производных антрахинона и кумарина делает этот метод одним из самых применяемых в качественном анализе. Основными недостатками метода является большая затрата времени, а также, в ряде случаев, - малая разделительная способность. Недостатки метода бумажной хроматографии устраняются при использовании ТСХ. Преимущества этого метода заключаются в быстроте и более четком разделении, возможности детектирования без использования агрессивных растворителей и повышенных температур. Наиболее часто в качестве адсорбента при ТСХ применяется силикагель. Эффективность разделения находится в прямой зависимости от величины частиц силикагеля (37).
На скорость потока и чувствительность детектирования влияет толщина слоя сорбента. Для флавоноидов оптимальной является толщина 100 нм (6). Метод ТСХ применим как для предварительной идентификацией групп БАВ в сырье, так и для качественного и количественного анализа. 1.2.1.2. Газовая и жидкостная хроматография
Наиболее совершенными и точными методами хроматогафического анализа является ГЖХ и ВЭЖХ. Преимущество этих методов заключается в возможности проведения качественного и количественного анализа, а также автоматизации процесса контроля. При проведении качественного анализа в методе ГЖХ используют величину относительного времени удерживания (tOTH.), приняв за стандарт одно из хроматографирумых веществ. (71). Однако для некоторых веществ флавоноидной природы, оксикумаринов, оксиантрахинонов невозможно триметилсилилирование, а без применения дериватизации проведение анализа неосуществимо в виду термолабильности веществ. Тем не менее этот метод был успешно использован в анализе 22 флаваноидов (104, 102, 105).
Метод ВЭЖХ широко применяется в качественном и количественном анализе БАВ. ВЭЖХ, и в частности обращеннофазовая ВЭЖХ, является основным методом анализа флавоноидов, а таюке фенольных кислот. Подвижные фазы, используемые при ВЭЖХ анализе фенольных соединений, обычно включают водные растворы уксусной, муравьиной или ортофосфорной кислот, а таюке метанол или ацетонитрил. Значение рН и ионной силы подвижной фазы влияют на удерживание фенолов в колонке, зависящее от степени протонирования молекулы (99). Наличие в спектре поглощения фенольных соединений максимумов в районе УФ - области обуславливает применение УФ - детектора при ВЭЖХ этих соединений. Не существует определенной длины волны, идеальной для мониторинга всех классов фенольных соединений. Оксикоричные кислоты поглощают в УФ — областях, один максимум при 225-235 нм, другой — в области 290-330 нм. При 320 нм производные коричной кислоты могут быть детектированы без какого-либо влияния бензойной кислоты, имеющей лучшую абсорбцию при 254 нм (8). Однако, детектирование при 280 нм лучшая альтернатива для определения обоих классов этих фенольных соединений. Область 350-370 нм широко используется для определения флавоноловых агликонов, а 280 нм -для флаван-3-олов и гликозидов флавонолов (98,101).
При анализе флавонолов и фенольных кислот широко используется спектрофотометрический детектор на диодной матрице, что существенно расширяет возможности как селективного детектирования, так и идентификации и определения частоты пика (Lee и Winner 1996). УФ -детекторы, как правило, уступают в чувствительности и селективности флуориметрическим детекторам. Однако флуориметрическое детектирование практически не используется в анализе фенольных соединений, ввиду отсутствия удобных для детектирования максимумов эмиссии в видимой области спектра (98,101).
Фармакогностическая характеристика растений сем. Яснотковых — объектов исследования
Семейство Яснотковые (Lamidceae), или Губоцветные {Labidtae) включает около 210 родов и порядка 3500 видов. На территории бывшего СССР произрастает более 800 видов представителей этого семейства. Большинство Яснотковых — однолетние и многолетние травы, реже полукустарники и кустарники и лишь немного древовидных форм (36). Кустарники и деревья распространены преимущественно в тропиках или субтропиках. К лекарственным растениям семейства Яснотковых, разрешенным к применению в отечественной официнальной медицине и широко используемым, относятся мята перечная, мелисса лекарственная, шалфей лекарственный, душица обыкновенная, тимьян ползучий. Мята перечная (Mentha piperita, L) — многолетнее, широко культивируемое во многих странах травянистое растение. Стебли четырехгранные, листья продолговато - ланцетовидные с неравномернопильчатым краем. Цветки почти правильные, венчик четырехлопастный, соцветия колосовидные. Плод состоит из четырех орешков. В качестве лекарственного сырья заготавливают листья.
Химический состав. Основной группой БАВ мяты перечной является эфирное масло. Листья мяты содержат до 3% эфирного масла, главным компонентом которого является L-ментол. Также в состав масла входят ментон, пинен, лимонен, цинеол, пулегон, жасмон и другие моноциклические терпены. В листьях мяты найден каротин (до 40%), флавоноиды: гесперидин, антоцианы и лейкоантоцианы, бетаин, урсоловая (около 0,3%) и олеаноловая (около 0,12%) кислоты, полифенолы, макроэлементы (мкг/г): калий - 25,2; кальций -20,3; магний - 6,7; железо — 0,3; микроэлементы: марганец, медь, цинк, кобальт, молибден, хром, барий, селен, никель, стронций, свинец (11, 19,21).
Применение. Листья мяты перечной разрешены к медицинскому применению в качестве настоя как спазмолитическое и желчегонное средство. Входят в состав сборов. На производстве из листьев мяты перечной получают настойку, входящую в состав ряда комплексных препаратов. Желчегонное действие препаратов мяты связывают с полифенолами. Эти препараты в эксперименте усиливают не только внешнесекреторную функцию печени, изменяют состав желчи, усиливают выделение с желчью холатов, холестерина и билирубина, но и повышают антитоксическую функцию печени, нормализуют метаболизм, уменьшают отек гепатоцитов у крыс при гепатите, вызванном декстраном (23, 72, 79).
Шалфей лекарственный (Salvia officinalis, L) — полукустарник с ветвистыми округлыми деревянистыми стеблями внизу и травянистыми четырехгранными - вверху. Листья простые, удлиненно ланцетовидные, расположены супротивно. Цветки собраны ложными мутовками, имеют две тычинки, соцветия колосовидные. В качестве лекарственного сырья от культивируемых растений заготавливают листья.
Химический состав. Листья содержат эфирное масло (0,5-2,5%), в состав которого входят цинеол (до 15%), 1-а-туйон, d-p-туйон, d-а-пинен, сальвен, d-борнеол, d-камфора, цедрен. Также в листьях найдены алкалоиды, флавоноиды, среди которых нарингенин, рутин, дигидрокверцетин, дубильные вещества, урсоловая, олеановая, хлорогеновая кислоты, никотиновая кислота, горечи (26, 31, 50).
Применение. Листья шалфея лекарственного разрешены к медицинскому применению в качестве противовоспалительного средства в виде настоя и для получения препарата «Сальвин» (31). Настой листьев шалфея лекарственного обладают антисептическими, противовоспалительными свойствами. Противомикробные свойства связывают с эфирным маслом, противовоспалительные - с дубильными веществами и флавоноидами, которые уплотняют эпителиальные ткани, снижают проницаемость клеточных мембран, стенок кровеносных и лимфатических сосудов (72).
Душица лекарственная (Origanum vulgare, L) - травянистое растение с четырехгранными стеблями. Листья супротивные, удлиненно-яйцевидные, цельнокрайние или мелкозубчатые. Цветки собраны в мутовки. В качестве лекарственного сырья заготавливают траву душицы.
Химический состав. Трава душицы содержит эфирное масло (0,1-2,17%), в состав которого входит тимол, а-пинен, Р-пинен, мирцен, селинен, а-туйон, оцимен, лимонен, сабинен, борнеол-4, карвакрол, ментрол, ориганен и др., углеводы - стахиоза; фенолкарбоновые кислоты (3,82%) — розмариновая кислота, кофейная кислота, коричная кислота, ванилиновая кислота, сиреневая кислота; тритерпеноиды — урсоловая кислота; флавоноиды — лютеолин, апигенин, 7 — глкжоуронид апигенина, 7 — гликозид апигенина, вицетин; витамины: С, Bl, В2; антоцианы; органические кислоты; дубильные вещества (13, 36, 37, 91).
Применение. Трава душицы разрешена к медицинскому применению в качестве настоя как отхаркивающее средство. Входит в состав грудного и потогонного сборов, комбинированного препарата «Уролесан» (31).
Количественный анализ суммы флавоноидов в настоях мелиссы лекарственной и изучение влияния рН экстрагента на их экстракцию
Как видно из таблицы 5.2 наибольшее количество дубильных веществ обнаружено в настое травы мелиссы, наименьшее — в настое травы чабреца, что коррелирует с данными, полученными по методике с использованием индикатора.
Валидационная оценка методики анализа суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ в настоях методом потенциометрического титрования
Валидационную оценку методики количественного определения органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ проводили по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость в соответствии с ОФС сравнением с методиками, рекомендуемыми НД, по - «Валидация фармакопейных методов». Статистическую обработку данных проводили по ГФХІ, используя программу Microsoft Excel Специфичность методик анализа доказана методом введено — найдено. Величины относительного стандартного отклонения (меньше 0,01) свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки. Однородность выборки проверялась с помощью контрольного критерия. Рассчитанные значения критериев были меньше табличных. Линейность результатов и аналитическая область методик устанавливалась путем статистической обработки выборки, полученной в результате количественного анализа 10 модельных проб на 5 уровнях концентраций на примере яблочной кислоты для определения содержания кислот. Для доказательства линейности и становления аналитической области потенциометрического определения окисляемых веществ были анализированы 10 модельных проб на 5 уровнях танина. Исследование зависимости рН от концентрации кислоты показало, что она описывается уравнением: Р& - /2 &а /2 с Зависимость ЭДС от концентрации дубильных (окисляемых) веществ может быть описана уравнением: Е=Ей + " ln " Рассчитанные значения коэффициентов корреляции составляют 0,999 и 0,997 соответственно для методов определения содержания органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ. Правильность и воспроизводимость предлагаемых методик оценивались результатам 10 определений. Используя критерий Фишера сравнивали методы потенциометрического титрования и фармакопейные методы по воспроизводимости. Поскольку рассчитанный коэффициент Фишера (1,14 и 1,38 соответственно для метода определения органических кислот дубильных веществ) меньше табличного (3,18), то можно заключить, что различия между дисперсиями статистически не значимы (табл.5.3). Дисперсии однородны. Методы сравнимы по воспроизводимости. Для оценки правильности методов рассчитывали критерий Стьюдента. Так как рассчитанный критерий (1,67 и 1,89 соответственно для метода определения органических кислот и дубильных веществ) меньше табличного (2,26), результаты эксперимента не отягощены систематической ошибкой. Методика потенциометрического титрования отличается простотой эксперимента, значительно удешевляется за счет сокращения используемых реактивов, не требует дорогостоящего оборудования и позволяет более точно определить точку эквивалентности. Этот метод может быть применим для проведения массовых анализов на фармацевтических предприятиях для титрования органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ в настоях. 1. Определены показатели, характеризующие содержание БАВ настоев травы мелиссы, душицы, чабреца, листьев шалфея и мяты перечной. 2. Разработана методика определения суммы свободных органических кислот в настоях редокс - титрованием с использованием индикаторов 3. Определено содержание суммы свободных органических кислот настоев по методикам с использованием индикаторов. Значение данного показателя лежит в интервале 0,14 ±0,02% (листья мяты) до 0,18 ±0,02% (травы мелиссы). 4. Разработана методика определения содержания суммы дубильных веществ в настоях редокс-титрованием с использованием индикатора. 5. Установлено содержание дубильных веществ настоев методом с применением индикатора. Значение данного показателя лежит в интервале 0,0210 ±0,0045% (листья мяты) до 0,19 ±0,02% (листья шалфея). 6. Разработаны методики потенциометрического титрования суммы органических кислот и дубильных веществ в настоях листьев и трав. Относительная ошибка потенциометрического определения органических кислот — 1,50 %; дубильных веществ — 1,82%. 7. Описана математическая модель по определению состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования 8. На основании теоретических проработок практических результатов написана компьютерная программа для потенциометрического титрования органических кислот. 1. Проведен качественный анализ БАВ настоев листьев мяты перечной, шалфея лекарственного, травы душицы, чабреца, мелиссы. Подтверждено присутствие флавоноидов и дубильных веществ. 2. Определено суммарное количество БАВ (сухой остаток) в настоях -объектов исследования гравиметрическим методом, которое колеблется от 0,55 + 0,03 до 1,56±0,02%. 3. На примере настоя травы мелиссы разработана методика пробоподготовки для идентификации флавоноидов с помощью ВЭЖХ-анализа. Установлено присутствие в настое травы мелиссы рутина, кверцетина, лютеолина и дегидрокверцетина. 4. Определено содержание суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом в настоях исследуемого ЛРС, которое колеблется от 0,009 ±0,001% до 0,029 ±0,003%.
Математическая модель по определению состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования
На хроматограмме, представленной на рис. 3.6 обнаружены все флавоноиды, стандарты которых были введены в базу данных прибора. Положительный результат (обнаружение всех 4-х флавоноидов) был достигнут после экстракции флавоноидов из раствора органической фазой 4-х туб Toxi-Lab типа В (для веществ кислого характера). В настое травы мелиссы обнаружены флавоноиды: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, лютеолин.
Для сравнительного изучения влияния различных экстрагентов на переход флавоноидов анализировали настои, приготовленные с использованием прокипяченной водопроводной воды. Водопроводная вода была выбрана в качестве экстрагента, чтобы получить настои аналогичные приготавливаемым согласно инструкции по применению пациентом на дому. Настои готовились по методике, описанной в пункте 2.2.1.
Затем готовили разведения полученных настоев и снимали их спектры поглощения. В качестве раствора сравнения использовали воду. Абсорбционный спектр водного извлечения травы мелиссы лекарственной снимали в диапазоне длин волн 200 - 800 нм на приборе SPECORD UV-VIS. Затем получали спектры поглощения настоев в присутствии 2% спиртового раствора алюминия хлорида. В качестве раствора сравнения использовали раствор, аналогичный рабочему, но без добавления настоя. При сравнении адсорбционного спектра водного извлечения в присутствии алюминия хлорида со спектром водного извлечения заметен небольшой гипохромный сдвиг. Наличие сдвига в область коротких длин волн и отсутствие батохромного сдвига длинноволнового максимума свидетельствует о том, что характер кривой поглощения определяется в основном комплексом веществ фенольной природы. Затем был получен спектр поглощения комплекса флавоноидных соединений с 2% раствором алюминия хлорида в спирте этиловом. Для исключения влияния окрашенных и сопутствующих соединений нефлавоноидного характера изучены дифференциальные адсорбционные спектры извлечений и УФ спектр раствора ГСО рутина в присутствии алюминия хлорида (рис.3.7). К 1 мл настоев добавляли 2 мл 2% этанольного раствора алюминия хлорида и 0,01 мл 1М кислоты хлористоводородной. Раствором сравнения являлась смесь 1 мл извлечения, 2 мл 96% спирта этилового и 0,01 мл 1М кислоты хлористоводородной. Так как в кювете сравнения присутствуют все те же компоненты, что и в рабочей, за исключением алюминия хлорида, влияние окрашенных соединений нефлавоноидной природы исключается, в то время как интенсивность светопоглощения флавоноидов усиливается за счет образования комплекса с алюминия хлоридом. Максимум поглощения флавоноидного комплекса приходится на длину волны 410-415 нм.
Раствор комплекса рутина с алюминия хлоридом получали аналогично методике, описанной в пункте 3.2.1. Спектр водно-спиртового раствора рутина в присутствии алюминия хлорида на фоне раствора сравнения представлен на рисунке 3.7 .
Для подтверждения зависимости эффективности экстракции флавоноидов от рН нами были изучены настои сырья мяты перечной, мелиссы, душицы, чабреца и шалфея лекарственного, приготовленные с использованием буферных растворов с рН равными 1,68; 6,86 и 9,18. Настои готовились по методике, указанной в пункте 2.2.1. Полученные спектры на представлены на рис.3.8.
Сравнение спектров поглощения извлечений со спектрами извлечений в присутствии алюминия хлорида можно заметить разницу в значениях оптической плотности и небольшой гипохромный сдвиг извлечений с хлоридом алюминия. Это свидетельствует о вкладе в спектр веществ флавоноидной природы. Далее были изучены дифференциальные абсорбционные спектры флавоноидов с алюминия хлоридом. Спектры представлены на рисунке 3.9 По величине оптической плотности видно, что наиболее полная экстракция флавоноидов травы душицы происходит в щелочную среду, наименьшая - в кислую среду. Полученные данные показывают, что эффективность экстракции флавоноидов травы душицы зависит от рН. Наиболее эффективно экстракция происходит в щелочную среду. Далее нами было исследовано содержание суммы флавоноидов настоев травы чабреца с разными значениями рН. На рисунке 3.10 представлены спектры настоев травы чабреца на примере образца 3. Обозначения на рисунке: извлечение 1-настой, приготовленный на буферном растворе с рН=1,68; извлечение 2-настой, приготовленный на буферном растворе с рН 6,86; извлечение 3-настой, приготовленный на буферном растворе с рИ-9.18. Далее были получены дифференциальные спектры поглощения комплексов флавоноидов в присутствии алюминия хлорида. Спектры представлены на рисунке 3.11. По величине оптической плотности можно предположить, что наибольшее количество флавоноидов присутствует в извлечении 2, наименьшее — в извлечении 1. Количественное содержания флавоноидов в настоях травы чабреца и метрологические характеристики метода определения представлены в таблице 3.6.
