Содержание к диссертации
Введение
1. Номенклатура и строение водорастворимых витаминов 13
2. Фармакопейный анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов 18
2.1 Источники информации 18
2.2 Общая информация о фармакопейных водорастворимых витаминах 18
2.3 Фармакопейные требования к качеству субстанций водорастворимых витаминов 21
2.4 Фармакопейные требования к качеству препаратов водорастворимых витаминов 25
3. Нефармакопейный анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов 29
3.1 Химические реакции 29
3.2 Физико-химические методы 30
4. Современные физико-химические методы 35
4.1 Инфракрасная спектроскопия 35
4.2 Ближная инфракрасная спектроскопия 36
4.3 Ультрафиолетовая спектроскопия 40
4.4 Тонкослойная хроматография 41
4.5 Высокоэффективная жидкостная храматография 42
5. Выявление фальсифицированных лекарственных средств с использованием современных аналитических методов 45
5.1 Проблема фальсификации лекарственных средств 45
5.2 Подходы к обнаружению фальсифицированных лекарственных средств 47
выводы по литературным данным 50
экспериментальная Часть 51
6. Материалы и методы исследования 51
6.1 Объекты исследования 51
6.2 Оборудование и условия испытаний 53
7. Анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов методом ик-спектроскопии 57
7.1 Задачи исследования 57
7.2 Методика пробоподготовки 57
7.3 Атлас стандартных ИК-спектров одорастворимых витаминов 62
7.4 ИК-спектры лекарственных средств водорастворимых витаминов 64
7.5 Выводы по главе 72
8. Анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов методом бик-спектроскопии 74
8.1 Задачи исследования 74
8.2 Материалы исследования 74
8.3 Методика анализа лекарственных средств водорастворимых витаминов 75
8.4 Идентификация и дискриминация кислоты аскорбиновой с использованием метода БИК-спектроскопии 76
8.5 Количественное определение кислоты аскорбиновой с использованием метода БИК-спектроскопии 82
8.6 Выводы по главе 86
9. Анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов методом уф-спектрофотометрии 87
9.1 Задачи исследования 87
9.2 Методика пробоподготовки 87
9.3 Анализ полученных УФ-спектров 89
9.4 Количественное определение водорастворимых витаминов с использованием метода УФ-спетрофотометрии 91
9.5 Выводы по главе 100
10. Анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов методом ТСХ 102
10.1 Задачи исследования 102
10.2 Пробоподготовка для анализа
водорастворимых витаминов методом ТСХ 102
10.3 Разработка условий хроматографирования 105
10.4 Полученные результаты 109
10.5 Выводы по главе 114
11. Анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 115
11.1 Задачи исследования 115
11.2 Параметры пригодности хроматографической системы 115
11.3 Методика пробоподготовки 117
11.4 Определение основных хроматографических условий 118
11.5 Разработка состава подвижной фазы 120
11.6 Количественное определение водорастворимых витаминов с использованием метода ВЭЖХ 121
11.7 Выводы по главе 127
Общие выводы 128
Список литературы 130
- Фармакопейные требования к качеству субстанций водорастворимых витаминов
- Высокоэффективная жидкостная храматография
- ИК-спектры лекарственных средств водорастворимых витаминов
- Количественное определение кислоты аскорбиновой с использованием метода БИК-спектроскопии
Фармакопейные требования к качеству субстанций водорастворимых витаминов
В связи с тем, что требования ВР 2007 к субстанциям водорастворимых витаминов полностью соответствуют требованиям ЕР 5, в дальнейшем при описании субстанций будут приводиться ссылки только на ЕР 5. Рассмотрим только те показатели, которые имеют непосредственное отношение к исследованиям, проводимым в данной работе.
Субстанции тиамина гидрохлорида и мононитрада — кристаллические или мелкокристаллические порошки, окраска которых варьрует от практически белой до белой со слегка желтоватым оттенком, со слабым специфическим запахом. Легко растворимы в воде, трудно растворимы в этиловом спирте, практически нерастворимы в эфире.
Субтанция рибофлавина - желто-оранжевые кристаллические порошки со слабым специфическим запахом. Мало растворимы в воде, практически нерастворимы в спирте, эфире, хлороформе, растворимы в растворах щелочей.
Субстанция пиридоксина гидрохлорида — белые мелкокристаллические порошки. Лекго растворим в воде, трудно растворим в спирте. Субстанция кислоты аскорбиновой - белые кристалические порошки без запаха, кислого вкуса. Легко растворим в воде.
В табл. 8 приведены нормы содержания действующего вещества в субстанциях водорастворимых витаминов в перечете на высушенное или безводное для кристаллогидратов вещество ( то есть с учетом потери в массе при высушивании или результатов определения воды, соответственно) и одновременно указан метод количественного определения.
Как видно из табл. 8, данные различных фармакопеи совпадают либо близки друг к друку, что, безусловно, отражает работу ІСН по гармонизации фармакопейных требований. Поскольку метод титрования является в общем случае более точным, чем физико-химические методы анализа, то для последних в НД границы норм установливаются обьшно более широкие, что находит свое отражение и в данном случае, хотя и не для всех водорастворимых витаминов. 23 В табл. 10 представлены методы количественного определения водорастворимых витаминов в монопрепаратах, используемые в некоторых зарубежных фармакопеях. Титриметрические методы являются традиционными в определении разнообразных витаминов. Так, неводное кислотно-основное титрование [ГФ, СР, ЕР (ВР) и IP] применяется в количественном определении витаминов Bi и ВбВ субстанциях. Метод йодометрического титрования, как правило, используется в определении кислоты аскорбиновой, а также ее солей и эфиров как в субстанции [ГФ, СР, ЕР (ВР), JP, IP и USP], так и лекарственных формах [СР]. Содержание витамина С в таблетках может быть определено с помощью цериметрического титрования [ВР], а титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолом - в растворах, однокомпонентных таблетках и некоторых поливитаминных препаратах [JP, USP]. IP и USP регламентируют при установлении подлинности сравнение ИК- и УФ-спектров испытуемой субстанции со спектрами стандартных образцов. ГФ; СР, ЕР (ВР) и JP при установлении подлинности регламентируют сравнение ИК- и УФ-спектров испытуемой субстанции со стандартными спектрами (находятся в приложениях к соответствующим фармакопеям). Метод флуориметрии используется при установлении подлинности и для количественного определения Ві (по реакции образования тиохрома) и В2 [ВР, СР, JP и USP] в лекарственных формах.
ТСХ используется для оценки подлиности витаминов В2 и В6 в субстанциях [ЕР (ВР)], для обнаружения содержания В] и С в лекарственных препаратах [ВР].
Метод ВЭЖХ является основным методом качественного и количественного определения водорастворимых витаминов [ВР, СР, JP и USP]. Ві в субстанциях определяют количественно с использованием октансульфоната в качестве ион-парного реагента [USP], а в однокомпонентных лекарственных формах — без ионных пар [USP] или с использованием гептан сульфоната и триэтиламина [ВР]. Анализ родственных соединений в В2 натрия фосфате проводят в потоке элюента метанол-0.735% раствор КН2РО4 (15:85) [ВР]. В6 количественно определяют в субстанции с использованием гексансульфоната в качестве ион-парного реагента [СР, USP]. Особый интерес представляют методики, позволяющие определять несколько водораствормых витаминов одновремено. Именно в таких методиках наиболее полно раскрываются все преимущества метода ВЭЖХ. USP рекомендует методику ион-парной (с гексансульфонатом натрия) ВЭЖХ на колонке Cig для одновременного анализа витаминов Вь В2, Вб, РР в многокомпонентных препаратах.
Высокоэффективная жидкостная храматография
В связи с введением в практику фармацевтического производства России GMP повышается значимость использования современных унифицированных методов анализа, как на предприятиях-производителях, так и в системе государственного контроля качества лекарственных средств. Базовым методом анализа качества субстанций и готовых лекарственных средств в странах с развитой фармацевтической промышленностью (США, Соединенное Королевство, Япония, страны ЕС) является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Данный метод по своим характеристикам соответствует требованиям количественного анализа около 80-90% препаратов.
Бурное развитие жидкостной хроматографии в последние 40 лет обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов и аппаратуры.
Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3-5 мкм, сейчас до 1.8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 минут).
В настоящее время ВЭЖХ по темпам развития вышла на первое место среди инструментальных методов, обогнав даже газовую хроматографию. Важнейшее преимущество ВЭЖХ по сравнению с газовой хроматографией - возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам, например, по температурам кипения или молекулярной массе.
По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную виды хроматографии.
Количественная жидкостная хроматография является хорошо разработанным аналитическим методом, не уступающим по точности количественной газовой хроматографии и значительно превышающим точность ТСХ или электрофореза. К сожалению, в ВЭЖХ не существует детектора, который имел бы близкую чувствительность для соединений различного химического строения (как катарометр в ГЖХ). Поэтому для получения количественных результатов калибровка обязательна.
Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо развитый инструментальный метод, который широко применяют в самых различных областях науки и техники. Особенно велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений окружающей среды, а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.
Необходимо учитывать целый ряд весьма специфических требований, обусловленных особенностями метода.
1. Колонки для ВЭЖХ наполняют носителем с очень малым диаметром частиц. В результате при таких объемных скоростях растворителя, которые необходимы для быстрого разделения пробы, на колонке создается высокое давление.
2. Детекторы, применяемые в ВЭЖХ, чувствительны к флуктуации потока и давления элюента (шумы). Более того, при применении концентрационных детекторов необходима еще более высокая стабильность объемной скорости элюента.
3. Процесс хроматографического разделения сопровождается рядом антагонистических эффектов, так, например, растворение образца в подвижной фазе ведет к смешению разделяемых компонентов и снижает максимальную концентрацию вещества в элюируемом пике (в детекторе). Растворение наблюдается на всех участках системы от точки ввода пробы до детектора. . Растворители, выполняющие роль подвижной фазы, часто способны вызывать коррозию аппаратуры. Это в первую очередь относится к растворителям, используемым в обращенно-фазовой хроматографии, которая предпочтительна в биохимических приложениях ВЭЖХ В настоящее время проблема фальсифицированных лекарственных средств во всем мире становится все более серьезной. Она представляет растущую угрозу здоровью человека, затрагивает экономические интересы производителей и государства.
Сведение о фальсифицированных лекарственных средствах стали достоянием ВОЗ в 1982 году и касались в основном случаев обналужения поддельных препаратов в развивающихся странах. В 1992 году на совместной конференции ВОЗ и Международной федерации ассоциаций фармацевтических производителей (Intemationab Federation of Pharmaceutical Manufacturers Associations, www.ifpma.org) было дано определение термина «фальсифицированное лекарственное средство» [52]:
«фальсифицированное лекарственное средство — это лекарственное средство, предумышленно маркированное таким образом, чтобы ввести в заблуждение в отношении состава и/или изготовителя». В 2003 г. на конференции FIP в Сиднее дается немного обновленное определение [58]:
«фальсификация в отношении лекарственных средств означает преднамеренное и неправильное обозначение в отношении подлинности, состава и/или источника готового лекарственного средства или ингредиента для приготовления лекарственного средства».
На конференции было также указано, что фальсификация может касаться как оригинальных, так и воспроизведенных лекарств, а также традиционных лекарственных средств.
На сегодняшний день выделяют следующие разновидности фальсификатов[53]. 1. Не содержащие действующие вещества, в том числе и указанные на этикетке — «пустышки» (около 43%).
2. Содержащие действующие вещества, не указанные на этикетке (около 7%). Обычно в таких «препаратах» дорогое действующее вещество заменяется менее активным и более дешевым аналогом. Возможна также продажа «высокоактивных» препаратов, например растительного происхождения, в которые, на самом деле, включены действительно активные лекарственные вещества, (например, стероиды или эфедрин и его производные).
3. Содержащие действующие вещества, указанные на этикетке, но изготовленные другим производителем — не тем, который указан на этикетке (до 50%). Они включают в себя до 21% подделок с низким содержанием указанного на этикетке действующего вещества, до 5% имеющих ненадлежащую упаковку и до 24% имеющих низкое качество изготовления самого препарата.
Встречаются также поддельные препараты, имеющие высокое «качество» изготовления, что затрудняет их обнаружение. По данным CIPR (март, 2003), отмечается улучшение качества упаковки поддельных лекарств.
Следует отметить, что к фальсификатам могут относиться и биологически активные добавки. Они не являются лекарственными средствами, но могут содержать вышеуказанные недекларируемые компоненты (гормоны, эфедрин и т.п.).
Известны также основные способы распространения поддельных лекарств.
1. Официальная продажа в аптеках.
2. Продажа лекарств на улицах («аптеки» на колесах).
3. Продажа лекарств через Интернет.
4. Неофициальный («черный») рынок лекарств.
5. Спорт-клубы (анаболические стероиды, ингибиторы аппетита и т.п.).
ИК-спектры лекарственных средств водорастворимых витаминов
Следующая задача, которая решалась в данной работе, связана с получением ИК-спектров препаратов без предварительного извлечения действующего вещества из лекарственной формы. В работе [4] указывается на возможность получения ИК-спектров не только субстанций, но и лекарственных препаратов, например таблеток.
Нами было показано на примере кислоты аскорбиновой, что при относительно высоком содержании активной субстанции в препарате ИК-спектр можно получать напрямую - вспомогательные вещества не искажают картину и не маскируют полосы действующего вещества.
На рис. 5 в качестве примера представлен ИК-спектр препарата, содержащего кислоту аскорбиновую - таблеток Витамин С (Nanjing Baijingyu Pharm, Китай).
Из рис. 4 и 5 видно, что ИК-спектры субстации и таблеток Витамин С (Nanjing Baijingyu Pharm, Китай) различают крайне незначительно — практически совпадают. Аналогичная ситуация наблюдается и для других водорастворимых витаминов. При этом содержание действующего вещества в таблетках кислоты аскорбиновой составляет в среднем около 67%. Анализ таблеток, содержащих лекарственные средства других фармакологических групп в различных дозировках [7], позволяет нам сделать общий вывод:
При достаточно большом содержании действующего вещества в лекарственной форме «таблетки» (не менее 30-40%) можно получать ИК-спектр, на котором видны практически все полосы поглощения активной субстанции.
Тем не менее, при анализе таблеток следует использовать другую дозировку при пробоподготовке. Если при. анализе субстанций навеска испытуемого вещества должна составлять около 15 мг, то при анализе таблеток содержание действующего вещества в пробе (навеска порошка растертой таблетки плюс 1 капля вазелинового масла) должно быть около 5 мг. Именно при таком соотношении полосы вспомогательных веществ либо отсутствуют, либо немногочисленны и имеют небольшую интенсивность.
Таким образом, использовали следующую методику. В агатовой ступке растирали навеску измельченной таблетки, соответствующую содержанию 5 мг действующего вещества, с 1 каплей вазелинового масла качества «для ИК-спектроскопии» до получения однородной пасты. Полученную пасту на кончике стеклянной палочки помещали между двумя пластинами из КВг и получали ИК-спектр образца. Часто в ИК-спектрах таблеток появляется дополнительная широкая полоса (или группа полос) малой или средней интенсивности в области 3600-3100 см-1. В остальной части спектра могут появляться отдельные полосы вспомогательных веществ очень малой интенсивности (до 5% по шкале пропускания). Дальнейшие исследования методик непосредственного получения ИК-спектров содержимого порошка измельченных таблеток при низких концентрациях кислоты аскорбиновой в таблетках в виде пасты с маслом вазелиновым показали, что образцы нуждаются в предварительной экстракции действующего вещества и его концентрировании.
Для экстракции кислоты аскорбиновой из таблеток был выбран спирт 96%. При этом вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток (особенно крахмал) не переходят в фильтрат.
Пробоподготовку таблеток осуществляли путем предварительного извлечения кислоты аскорбиновой из препаратов спиртом 96%, высушивания при 30С и растиранием полученного извлечения с вазелиновым маслом качества «для ИК-спектроскопии». Полученную пасту наносили между двумя пластинками из КВг и получали ИК-спектр образца.
На рис. 6-7 в качестве примеров представлены ИК-спектры двух препаратов, содержащих данное лекарственное вещество - Аскорбиновая кислота с глюкозой (Фармстандарт-УфаВИТА, Россия) и Лиду С (Vita Come, Китай) после проведения экстракции спиртом 96%.
На основании анализа спектров субстанции кислоты аскорбиновой имеющихся в нашем распоряжении серий и производителей были выделены следующие характеристических полосы поглощения: vc=o в у-бутиролактоне (1755 см"1), Vc=c (1675 см-1), v c-o-o (1322 см-1) и vs(C-o-C) (1026 см-1).
Таким образом, разработаны методики подтверждения подлинности кислоты аскорбиновой в таблетках методом ИК-спектроскопии, которые могут быть использованы для выявления фальсифицированных препаратов, содержащих указанное вещество.
Разработанные методики могут использоваться для установления подлинности таблеток водорастворимых витаминов в фармакопейном анализе, а также при выявлении фальсифицированных препаратов, не содержащих указанное на упаковке действующее вещество. Воспроизводимость ИК-спектров в данном случае близка к таковой при анализе субстанций. Поэтому допускается сравнение со стандартным ИК-спектром лекарственного лекарственного препарата.
При установлении подлинности и выявлении поддельных лекарственных средств с использованием метода ИК-спектроскопии необходимо принимать во внимание ряд моментов. В классическом фармакопейном анализе в разделе «подлинность» используется примерно следующая формулировка:
ИК-спектр испытуемого образца должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения прилагаемого спектра сравнения по положению и относительной интенсивности.
Но при интерпретации ИК-спектров эту формулировку не понимают буквально. При проведении анализа учитывают, что современные ИК-спектрофотометры имеют достаточно большую чувствительность и управляются серьезным программным обеспечением. Полученные спектры также анализируются с помощью этих компьютерных программ, а не рисуются относительно грубо с помощью самописца. Это позволяет видеть на рисунке полосы поглощения практически любой интенсивности — вплоть до 0,5% по шкале пропускания. Высокое разрешение рядовых современных приборов (в данном случае 1 cm") дает возможность разделять полосы, находящиеся на расстоянии нескольких cm"1. С другой стороны, воспроизводимость физических методов анализа хотя и улучшилась, но порядок значений остался прежним. Для качественных аналитических приборов воспроизводимость (RSD) составляет обычно 2-5% с учетом погрешностей пробоподготовки.
Поэтому в случае ИК-спектроскопии, особенно при получении спектров таблеток, где имеется некоторое влияние вспомогательных веществ, добиться полного совпадения полос для подлинного препарата даже на одном приборе не всегда удается. Некоторые очень слабые полосы иногда могут исчезать, а иногда могут появляться артефактные полосы поглощения очень небольшой интенсивности.
ЕР при сравнении ИК-спектра испытуемой субстанции и стандартного спектра устанавливает норму отклонения волновых чисел 0,5%. Это значит, что, например, для волнового числа 3500 cm"1 абсолютное отклонение может составлять около 17 cm"1, 1500 cm"1 -отклонение 7,5 cm"1, 1000 cm" — отклонение 5 cm"1. USP, не конкретизируя область, указывает, что в зависимость от прибора абсолютное отклонение может составлять до 10 cm"1.
Количественное определение кислоты аскорбиновой с использованием метода БИК-спектроскопии
Из 78 образцов (с концентрацией кислоты аскорбиновой от 0,83% до 66,67%) были случайным образом выбраны 66 образцов и создан обучаюший набор для создания статистической модели количественного анализа. Остальные 12 образцов были отобраны для проверочного набора, который используется для оценки достоверности модели прогнозирования.
При разработке калибровок спектров использовали популярный метод многомерной калибровки в хемометрике — метод проекции на латентные структуры (PLS). Анализ проводили с помощью программы Thermo Scientific TQ Analyst. Точность калибровки принято характеризовать величинами среднеквадратичного остатка калибровки (RMSEC) и среднеквадратичного остатка прогноза (RMSEP), соответствующие расчетные формулы представлены в работе [21]. Чем меньше RMSEC и RMSEP, тем точнее описываются обучающие данные. Кроме того, качество калибровки характеризуется еще и коэффициентом корреляции г2 - чем он ближе к единице, тем достовернее модель.
При предварительной обработке спектров используется метод множественной коррекции сигнала (MSC) для уменьшения влияния случайного шума и сглаживания сигнала. В табл. 15 представлены результаты хемометрических параметров (г, RMSEC и RMSEP) при обработке спектров в полном диапазоне с оригинальными спектрами, первыми производными и вторыми производными спектрами. Очевидно, что при подготовке калибровочной модели с множественной коррекцией сигналов предпочтительно использовать вторые производные спектры.
Для дальнейшей валидации модели был использован метод Кросс-валидации с тем же набором образцов для калибровки. Кросс-валидация подтвердила достоверность калибровки модели. В настоящей работе значение среднеквадратичного остатка кросс-валидации (RMSECV) равно 5,88%. Схема прогноза остаточной ошибки суммы квадратов (PRESS) используется для выбора соответствующего числа главных факторов модели PLS (рис. 14). Разработанные схемы калибровки и остатка показаны на рис. 15. В табл. 17 представлены результаты анализа проверочных образцов с использованием данной хемометрической модели при определении концентрации кислоты аскорбиновой в таблетках.
Из полученных данных следует, что проведение количественного определения кислоты аскорбиновой в таблетках реально возможно при её содержании в лекарственной форме на уровне не менее 25%. При снижении массовой доли кислоты аскорбиновой в общем случае существенно возрастает относительная ошибка определения.
1. Метод БИК спектроскопии с математической обработкой может использоваться для установления подлинности и идентификации производителей субстанций и таблеток кислоты аскорбиновой.
2. Для установления подлинности таблеток кислоты аскорбиновой методом БИК спектроскопии содержание действующего вещества в препарате дожно быть не менее 25%.
3. Построена калибровочная модель, позволяющая определять процентное содержание кислоты аскорбиновой в таблетках. Количественный анализ рекомендуется проводить при содержании данного действующего вещества в таблетках на уровне не менее 25%.
4. Метод ближней ИК-спектроскопии может быть рекомендован для внесения в Государственную фармакопею РФ в качестве общего метода анализа лекарственных средств. В настоящее время УФ-спектрофотометрия используется для идентификации субстанций и препаратов, в том числе и водорастворимых витаминов. Данный метод не теряет свою ценность для фармакопейного анализа. Для веществ, обладающих хорошими хромофорами, этот метод также дает возможность проводить анализ по разделам «подлинность» и «количественное определение», а в ряде случаев может использоваться и для анализа чистоты по поглощению при определенных длинах волн.
Наличие сложных сопряженных систем в структурах водорастворимых витаминов дает возможность широкого применения УФ-спектрофотометрии для их фармакопейного анализа.
Для этого решались следующие задачи:
- разработка методик пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов;
- разработка методик установления подлинности и количественного определения субстанций и лекарственных препаратов (таблеток).
