Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Проточно-инжекционный анализ лекарственных веществ 13
1.2. Аналитические методы исследования полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов организма человека 29
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 66
ГЛАВА 3. Проточно-инжекционный анализ амииосодержащих лекарственных веществ 82
3.1. Реакции дериватизации амииосодержащих лекарственных веществ в равновесных условиях 84
3.2. Влияние природы растворителя и компонентов смеси на реакции лекарственных веществ в проточных методах анализа 104
3.3. Проточно-инжекционные определения амииосодержащих лекарственных веществ со спектрофотометрическим детектированием 118
ГЛАВА 4. Проточные методы анализа в биофармацевтических исследованиях амииосодержащих лекарственных веществ 138
4.1. Методы оценки скорости генетически детерминированных процессов ацетилирования лекарственных веществ 139
4.2. Исследование индукции процессов ацетилирования 151
4.3. Клиническая фармакокинетика транквилизатора фосфабензида и его взаимодействие с биосубстратами 157
4.4. Изучение метаболических превращений диуцифона в биологических средах 165
ГЛАВА 5. Проточные методы анализа в контроле технологических процессов и безопасности персонала химико-фармацевтических производств 172
5.1. Контроль содержания токсичных ароматических аминов в технологических смесях и готовой продукции 173
5.2. Проточно-инжекционные и хроматографические определения гидразина и его замещенных в реакционных смесях и сточных водах 181
5.3. Химическая дозиметрия токсичных аминососдинении в воздушной среде химико-фармацевтических производств 198
5.4. Тест-системы для определения ариламинов и гидразинов в водных средах 214
Заключение 221
Выводы 223
Литература 226
Приложение 265
- Аналитические методы исследования полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов организма человека
- Влияние природы растворителя и компонентов смеси на реакции лекарственных веществ в проточных методах анализа
- Клиническая фармакокинетика транквилизатора фосфабензида и его взаимодействие с биосубстратами
- Проточно-инжекционные и хроматографические определения гидразина и его замещенных в реакционных смесях и сточных водах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Соединения с аминными функциональными группами представляют собой важные классы лекарственных веществ (ЛВ) и находят широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью. Многокомпонентность технологических смесей синтеза и лекарственных форм, токсичность многих из них при незначительном нарушении дозировки, а также генетическая детерминированность и индивидуальная вариабельность процессов их биотрансформации в организме человека требуют применения избирательных, чувствительных методов определения этих ксенобиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека.
В последнее десятилетие в анализе лекарственных веществ, наряду с развитием высокоэффективной жидкостной, тонкослойной хроматографии и других физико-химических методов, наблюдается тенденция к использованию таких аналитических систем, как проточно-инжекционный анализ (ПИА) и тест-методы. Этому способствовали такие их преимущества, как простота технического исполнения, высокая производительность, надежность и экономичность определений, возможность получения большого объема аналитической информации. Проточные методы анализа все чаще используются для оценки основных параметров, определяющих качество лекарств -их безопасности и эффективности применения.
Проблемой, ограничивающей применение проточных методов в биофармацевтическом анализе, является избирательность и чувствительность детектирования определяемых соединений. Это связано со сложным составом анализируемых матриц при низких содержаниях аналита, а также со спецификой значительной части ЛВ и их метаболитов, имеющих высокую полярность, слабовыраженные хромофорные, элек-трофорные или флуорофорные свойства. Кроме того, измерение аналитического сигнала в неравновесных условиях, когда физические и химические процессы в потоке не завершены, вызывает необходимость быстрого изменения аналитических свойств ЛВ за время движения определяемого соединения к детектору. Использование большей части реакций дериватизации аминосоединений из-за низкой специфичности взаимодействия и реакционной способности реагентов существенно ограничивает возможности проточного анализа ЛВ.
В то же время существует потребность в применении таких доступных аналитических систем, которые можно использовать в режиме проточного анализа для селективных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ в сложных по составу смесях без их разделения.
В этом плане важна разработка неинвазивных, простых в экспериментальном отношении и высокопроизводительных аналитических методов для исследований полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов, что чрезвычайно необходимо в осуществлении ранней досимптоматической диагностики заболеваний, оценке риска интоксикации, канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности организма человека.
Цель работы заключается в развитии научных основ и систематизации применения проточного анализа в фармацевтической химии для создания комплекса экспрессных, высокочувствительных, избирательных и производительных проточно-инжекционных, хроматографических и тест-методов для контроля качества лекарственных препаратов, фармацевтического производства и биофармацевтических исследований, а также оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих лекарственных веществ.
Для достижения этой цели были решены следующие задачи:
обоснование путей повышения избирательности и чувствительности определения лекарственных веществ, содержащих аминные функциональные группы, в равновесных и неравновесных условиях;
выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность определений ЛВ в проточных системах: проточно-инжекционном анализе, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии, тест-методах, установление взаимосвязи между физико-химическими параметрами проточных систем и аналитическими свойствами ЛВ, изучение влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в потоке сигнал;
разработка тест-систем и автоматизированных средств для определения в потоке токсичных соединений в технологических смесях, воздушной среде и сточных водах фармацевтических производств, определение критериев выбора используемых при этом хромогенных реакций, условий проведения аналитических определений, изучение метрологических характеристик методик;
создание методических основ количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев в тест-методах для контроля безопасности технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств;
разработка неинвазивных, избирательных и чувствительных аналитических методов фенотипической оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обоснование их использования для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;
практическое использование разработанных проточно-инжекцион-ных, хро-матографических, спектрофотометрических методик для контроля качества и производства лекарственных препаратов, а также биофармацевтических исследований аминосодержащих ЛВ и выработка на этой основе рекомендаций по совершенствованию применения лекарственных средств.
Диссертационная работа выполнялась при поддержке Международного научно-технического центра (ISTC Projects # 498, 1517, 1891), Российского фонда фундаментальных исследований (проект 03-03-96013-р2003а), Академии наук Республики Татарстан (проекты 19-01/2000 (Ф), 07-7.5-86/2001 (Ф), 09-9.7-13/2001 (Ф), 09-9.2-112/2003 (Ф)), ISSIiP (1999, 2000, 2001г.).
Научная новизна:
на основании систематического исследования аналитических реакций ЛВ, содержащих аминные функциональные группы, выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности определений аналитов в равновесных и неравновесных условиях;
обоснованы выбор и условия использования проточных методов для избирательных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ различного спектра фармакологического действия в биологических жидкостях, технологических смесях и многокомпонентных лекарственных формах;
обоснованы и установлены условия аналитических определений в проточно-инжекционном анализе ЛВ, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации биологически активных аминосоединений различных классов и компонентов их промышленного синтеза;
выявлен характер влияния состава потока, физико-химических характеристик растворителей и компонентов анализируемых сред на избирательность и чувствительность определений ЛВ в проточных системах на основе использования приема кинетического регулирования;
показана возможность использования тест-методов и автоматических средств аналитического контроля для оценки безопасности и качества технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств, предложены методические приемы количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев тест-средств;
установлены рабочие условия проточно-инжекционных, хроматографических, линейно-колористических, спектрофотометрических определений аминосодержащих ЛВ и исходных компонентов их синтеза, а также продуктов метаболических превращений в сложных по составу анализируемых матрицах;
разработаны неинвазивные, избирательные и чувствительные методы оценки скорости генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;
изучена фармакокинетика и биотрансформация диуцифона и фосфабензида, получены данные по индукции N-ацетилтрансферазы.
Практическая значимость. Выявлены и обоснованы новые области применения проточных методов анализа в фармацевтической химии для контроля качества, технологических процессов и безопасности фармацевтических производств, биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных препаратов.
Разработаны экспрессные и чувствительные методики избирательного проточ-но-инжекционного, хроматографического, спектрофотометрического, тест-определения ряда аминосодержащих лекарственных веществ химиотерапевтического, анальгезирующего, антиаритмического, иммуномодулирующего и психотропного действия в реакционных смесях, лекарственных формах, биологических жидкостях человека.
В клинических и производственных условиях апробированы методики определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, замещенных триптамина, производных /7-аминобензойной и w-аминосалициловой кислот, диаминодифенилсульфона, арила-
минов, гетероциклических аминов как в различных биологических жидкостях, полученных у пациентов в процессе терапевтического мониторинга, так и в готовых лекарственных формах и постадийном контроле производства.
Результаты исследования метаболических превращений диуцифона и фосфа-бензида в организме пациентов и их фармакокинетики использованы для оптимизации безопасного и эффективного клинического использования этих новых лекарственных средств.
Разработан комплекс неинвазивных методов определения типа генетически детерминированных процессов ацетилирования в организме человека при использовании гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в качестве тест-препаратов. Методы рекомендованы и апробированы при оптимизации безопасной дозировки лекарственных веществ, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии, а также установления показателей адаптации организма к интенсивной мышечной деятельности.
Результаты работы используются при проведении аналитического контроля (ОАО "Татхимфармпрепараты", ФГУП ФНПЦ ТКНПП им. В.И. Ленина", Казанская академия ветеринарной медицины), в фармакокинетических исследованиях (Казанский государственный медицинский университет), биохимических исследованиях функционального состояния спортсменов, оценке степени их тренированности (Казанский государственный педагогический университет), для обеспечения экологической безопасности личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканского клинического противотуберкулезного диспансера (Казань), Республиканской клинической больницы Татарстана, Казанской городской клинической больницы № 6, детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н Сперанского (Москва).
Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного технологического университета в дисциплинах "Контроль качества лекарственных препаратов", "Экологический мониторинг" и Казанского государственного медицинского университета в последипломном образовании провизоров.
На защиту выносится:
Результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения аналитических определений аминосодержащих лекарственных веществ в проточных системах (проточно-инжекционный анализ, тест-методы, высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматография).
Обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях аминосодержащих лекарственных веществ в виде их производных в равновесных и неравновесных условиях.
Результаты изучения влияния состава потока и его гидродинамических параметров, рН, свойств используемого реагента и определяемого вещества на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования Л В и компонентов их синтеза в системе проточно-инжекционного анализа, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии.
Методики проточно-инжекционного, хроматографического и спектрофотометри-ческого определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, производных п-аминобензойной и w-аминосалициловой кислот, замещенных триптамина, диами-нодифенилсульфона, w-аминофенола, о-фениленди-амина, гетероциклических аминов в промышленных и модельных смесях, лекарственных формах и биологических жидкостях.
Способы определения фенотипа ацетилирования при изучении фармакокинетики тест-препаратов сульфадимезина и изониазида в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях, а также в режиме профессиональной спортивной деятельности.
Данные по индукции N-ацетилтрансферазы при клиническом использовании ряда лекарственных препаратов.
Данные по фармакокинетике и метаболизму диуцифона и фосфабензида в организме человека.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на III - V Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1996, 1997, 1998), I Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), Международной конференции "Ncurochcmistry and Pharmacology of Drug Addiction and Alcoholism" (С.-Петербург, 1996), Всероссийской конференции "Экоаналитика-96"
(Краснодар, 1996), Всероссийской конференции "Мутагены и канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагенеза" (Казань, 1996), II конгрессе "Традиционная медицина. Теоретические и практические аспекты" (Чебоксары, 1996), Российском научно-практическом семинаре "Современное состояние теории и практического применения метода ТСХ" (Москва, 1996), Межвузовской конференции "Актуальные проблемы современной фармакотерапии" (Саратов, 1996), Международной конференции "Современные пути развития гомеопатии и проблемы создания рациональных лекарственных форм" (Пятигорск, 1996), II Международном конгрессе "Huropean Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics" (Берлин, 1997), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С.-Петербург, 1998), III Всероссийской конференции "Экоаналитика - 98" (Краснодар, 1998), V Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Ярославль, 1998), II Всероссийском симпозиуме «Проточный химический анализ» (Москва, 1999), V Всероссийской конференции "Электрохимические методы анализа" (Москва, 1999), Поволжской региональной конференции (Казань, 1999), Региональной конференции "Методы аналитического контроля материалов и объектов окружающей среды" (Пермь, 2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (Москва, 2001), Научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье" (С.-Петербург, 2001), 28 Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), V Всероссийской конференции "Экоаналитика-2003" (С.-Петербург, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), итоговых научных конференциях КГТУ (Казань, 1994 - 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 31 статья, 6 учебных пособий и методических указаний, 35 тезисов докладов и получен 1 патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения и списка использованной литературы. В приложении представлены акты использования разработанных аналитических методик.
Диссертация изложена на 264 страницах, содержит 50 рисунков, 53 таблицы, список использованной литературы включает 425 источников.
Аналитические методы исследования полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов организма человека
В последние годы наблюдается все более интенсивное использование различных аналитических технологий в биофармацевтических исследованиях, изучении полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов в организме человека. Это обусловлено тем, что роль аналитических методов в исследованиях полиморфизма биохимических процессов чрезвычайно важна в осуществлении ранней досимптоматической диагностики заболеваний, оценке риска токсикации, канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности [115-120].
Практическая реализация аналитических исследований процессов метаболизма лекарственных веществ, контролируемых генами предрасположенности, позволяет обеспечить своевременную защиту организма от тех или иных нежелательных эффектов, которые могут возникнуть под действием неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов (лекарства, продукты питания, экологические факторы, вредные привычки, инфекции). Эта возможность достигается по причине того, что гены предрасположенности кодируют продукты своей деятельности (ферменты, белки и рецепторы), а последние способны взаимодействовать с компонентами окружающей среды при осуществлении биохимических процессов организма (116,121-125].
Аналитические технологии используются для определения генных нарушений и продуктов их деятельности на следующих уровнях: - определение конкретной мутации (генной, хромосомной, геномной) посредством цитогенетических и молекулярно-генетических анализов; - регистрация продуктов гена с помощью методов биоаналитической химии; - определение специфических компонентов биохимических процессов (эндогенные и лекарственные соединения, а также их метаболитов), возникающих в результате генетической детерминации реакций биотрансформации.
Эти определения проводятся как на уровне различных биологических жидкостей организма (кровь, моча, слюна, секреты различных желез и пр.), так и клеток.
Для реализации этих целей используют различные аналитические методы (хроматография, электрофорез, иммуноферментный анализ, электроаналитические и спектральные методы) и приемы пробоподготовки, способствующие повышению чувствительности и избирательности определений компонентов сложной биологической матрицы. Особое внимание при этом приобретает проведение анализа в проточном варианте, что значительно способствует повышению экспрессности и производительности аналитических определений.
Молекулярно-генетические аналитические технологии. Молекулярно-генетические методы (МГМ) предназначены для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК вплоть до идентификации первичной последовательности азотистых оснований. В основе этих методов лежат аналитические "манипуляции" с ДНК и РНК.
Основные этапы молекулярно-генетического анализа включают в себя пробо-подготовку образцов ДНК или РНК, рестрикцию ДНК на фрагменты и их последующую идентификацию различными физико-химическими методами (126]. Пробопод-готовка является одним из основных этапов МГМ, поскольку ее цель состоит в выделении всей ДНК или накоплении ее определенных фрагментов, которые в дальнейшем подвергаются анализу. Приоритетным подходом в последнем случае является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) [126,127]. Благодаря применению ПЦР-технологии удается выявить и воспроизвести миллионы копий исследуемого участка ДНК. Такой подход позволяет без ущерба для конечного аналитического результата исследовать небольшой фрагмент генома, поскольку амплификация (умножение) участков ДНК проводится с помощью ПЦР. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируе-мого фрагмента. В соответствии с нуклеотидной последовательностью концов анализируемого участка синтезируются два праймера - копии небольшого, соответствующего 20-30 азотистым основаниям участка ДНК, с которых под влиянием ДНК-полимеразы происходит удлинение цепи, комплементарной азотистым основаниям нити материнской ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза выделена из термофильных бактерий Thermits aquatics, оптимум работы которой находится в области 70-72С, что позволяет полностью автоматизировать синтез ДНК, поскольку фермент-катализатор аналитической реакции не инактивируется при денатурации ДНК нагреванием. В связи с этим каждый цикл амплификации, повторяемый многократно, включает температурную денатурацию ДНК (разделение на одноцепочечные молекулы), присоединение праймеров, синтез полинуклеотидных цепей. На практике эти процедуры часто проводятся при автоматическом терморегулировании режима ПЦР в амплификаторах. Необходимым звеном МГМ также является ферментативная рестрикция ДНК на фрагменты, которая осуществляется бактериальными эндонуклеаза-ми. При обработке рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.
Разновидностями метода ПЦР-технологий являются мультипраймерная и гнездовая ПЦР [127]. В первом случае осуществляется аналитический процесс амплификации нескольких ДНК-матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет в итоге исследовать несколько аллельных генов. Во втором варианте используются две пары праймеров, одна из которых ампли-фицирует внутренний участок фрагмента ДНК, полученного после первого этапа амплификации с внешней парой праймеров.
ПЦР-технологии успешно применены для молекулярно-генетического анализа различных генов, например, кодирующих N-ацетилтрансферазу [128,129], ферментов системы цитохрома Р450 [130-133], дигидропиримидиндегидрогеназы [134], гена инсулина [135].
Продукты ПЦР-аналитических технологий можно детектировать.различными физико-химическими методами. Одним из самых простых в техническом исполнении, эффективных и распространенных в клинических аналитических лабораториях является электрофорез в полиакриламидном или агаровом геле [126, 136]. При этом визуализация и идентификация фрагментов ДНК является либо конечным этапом аналитических процедур, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. После электрофоретического разделения гель часто модифицируют высокоизбирательными аналитическими реагентами. При этом предпочтение отдается флуоресцирующим соединениям, которые связываются с ДНК и позволяют значительно понизить предел обнаружения (ПрО) и повысить избирательность детектирования аналита. Например, комплексообразование с ионами лантаноидов (европий, самарий) значительно усиливает флуоресценцию образующихся производных при установлении полиморфизма рецептора гена витамина Д [137], в качестве интеркалирующих зондов широко используется бромид этидия [126]. В последние десятилетие все более распространенным аналитическим инструментом фракционирования продуктов ПЦР-технологий является капиллярный электрофорез (КЭ) [138]. Обеспечение высокоэффективного разделения в сочетании с отсутствием прецизионной техники и расхода большого количества высокочистых растворителей позволяют использовать КЭ в практике клинико-диагностических лабораторий. Высокочувствительное определение при этом достигается применением флуоресцентных и диодно-матричных вариантов детектирования, например, с лазерно-индуцированной флуоресценцией [139].
Влияние природы растворителя и компонентов смеси на реакции лекарственных веществ в проточных методах анализа
Предложены методики ВЭЖХ определения АПФ, включающая использование обращенно-фазных вариантов с изократическим элюированием и детектированием разделенных продуктов гидролиза субстратов АПФ в УФ-области [246].
Методы исследования ферментов антиоксидантной системы (глутатионза-висимых ферментов, супероксиддисмутазы, каталазы). Тесты маркеров окислительной модификации белков и ДНК. Аналитические исследования процессов сво-боднорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) обусловлены огромным влиянием генетических дефектов этих процессов на резистентность организма к воздействию на него неблагоприятных экологических факторов, а также на формирование и развитие различных заболеваний, таких как рак, атеросклероз, болезни Альц-геймера, Паркинсона и др. [248-254]. Показано, что именно генетическая детерминированность антиоксидантной защиты от воздействия свободных радикалов во многом определяет процессы старения организма [249]. Ферментативными ингибиторами реакций свободнорадикального ПОЛ являются супероксиддисмутаза (СОД) эритроцитов и других тканей, глутатиопероксидаза (ГП), глутатионредуктаза (ГР), каталаза, а также рассмотренный выше фермент фракции гликопротеинов церуплазмин. Антиоксидантная вторичная защита обеспечивается глутатион-Я-трансферазами (GST), проявляющими пероксидазную активность и контролирующие реакции биотрансформации с участием восстановленного глутатиона (ГТ) [250-254]. Показана роль окси-дантного статуса организма человека в чувствительности генома к повреждающим факторам окружающей среды [255-257].
Наиболее удобны и доступны для определения активности глутатионзависи-мых ферментов кинетические методы, позволяющие надежно косвенно оценивать содержание фермента в инкубационной среде по его влиянию на индикаторную реакцию. Активность GST в эритроцитах определяют кинетическим спектрофотометриче-ским методом по ингибирующему действию фермента на реакцию глутатиона с цве-тореагентом 1-хлор-2,4-динитробензолом при аналитической длине волны 340 нм [249]. Было установлено, что курящие люди, имеющие генетически детерминированный дефицит этого фермента, имеют 2-кратный риск заболеть раком легких по сравнению с курильщиками без этого дефицита. Еще выше (почти в 20 раз) риск развития рака молочной желез у курящих женщин с дефицитом GST и медленной формой N-ацетилтрансферазы [249J.
Для ГР индикаторной реакцией является восстановление окисленного ГТ при участии НАДФН или НАДН в качестве доноров протонов и электронов [249]. Активность ГР рассчитывают по кинетике окисления НАДФН при 340 нм. ГП катализирует реакцию восстановленного ГТ за счет перекисей органического и неорганического происхождения, что лежит в основе методов определения ее активности в эритроцитах. В ряде методов для определения степени конверсии продуктов используют глу-татионредуктазную реакцию, в других - определяют концентрацию оставшегося после реакции ГТ с гидроперекисью третичного бутила в виде производного с дитио-нитробензойной кислотой, избирательно взаимодействующей с меркаптанными функциональными группами [249, 258]. В обоих группах методов детектирование аналитического сигнала осуществляется спектрофотометрическим методом.
Особое место занимают методы определения СОД, поскольку этот антиокиси-дант участвует в прерывании цепи свободнорадикальных процессов в начальной стадии восстановления молекулярного кислорода, вызывая дисмутацию образовавшегося супероксид анион-радикала (СОАР) [259]. Для определения активности СОД создают аналитические системы, обеспечивающие постоянную генерацию СОАР. Прямые методы основаны на использовании физических подходов генерации СОАР: фотолиза и радиолиза. Уменьшение концентрации СОАР при этом контролируется методом ВЭЖХ с электрохимическими системами детектирования [260]. В непрямых методах генерация СОАР осуществляется в ходе его образования в результате окислительно-восстановительных процессов. В данном случае об активности фермента судят не по снижению концентрации СОАР, а по изменению уровня содержания продуктов окислительно-восстановительной реакции, которые взаимодействуют с СОАР. Этот подход отличается высокой чувствительностью аналитических определений, для этого достаточно 10"8-10 13 М генерированного СОАР. В прямых методах требуются значительно большие концентрации СОАР (до 10 5 М). В качестве аналитических ре-докс систем генерации СОАР широко применяют: ксантин/ксантиноксидазу, адрена-лин/адренохром, НАДН/феназинметасульфат/нитросиний тетразолий, кверцетин [249,261,262]. Использование этого подхода предполагает спектрофотометрическое детектирование окрашенного продукта в результате реакции или комплекса последовательных редокси процессов. Независимо от выбранного метода, подходы к оценке активности СОД общие. Она определяется по ингибирующей способности СОД на используемую индикаторную реакцию. При этом активность фермента выражают в условных единицах, за которую принимается 50%-ное ингибирование окислительно-восстановительной реакции.
При определении акивности СОД необходимо учитывать участие большой группы высоко- и низкомолекулярных антиокисдантов в дисмутации СОАР. Для этого пробо подготовка включает специфическую обработку биологического материала этанолом, хлороформом и солями фосфорной кислоты, что обеспечивает осаждение гемопротеинов и других белков за счет дегидратации, частичной денатурации и высаливания. Отмечено, что фосфаты способствуют осаждению специфических ингибиторов СОД, препятствующих определению ферментативной активности в нативной плазме [249].
Активность каталазы эритроцитов достаточно просто оценить по кинетике разложения перекиси водорода в инкубационной среде по поглощению в УФ области спектра [263]. Разработаны амперометрические биосенсоры для детектирования перекиси водорода в биологических субстратах, которые содержат селективные к Н2О2 мембраны и компенсирующие электроды для устранения мешающего влияния природных доноров электронов биологических матриц [264]. Показано, что определение активности каталазы входит в комплексную диагностику синдрома хронического утомления работников химических производств [265].
Тесты окислительной модификации белков, протекающей за счет инициации рядом генетически детерминированных ферментативных систем, имеют большое значение при оценке физиологических и патологических биохимических процессов [249,266]. Интенсивность окисления белков можно оценить по изменению гидрофоб-ности белковых молекул, потерей ими гистидиновых остатков, изменению УФ-спектра белков. Наиболее информативным являются определение карбонильных группировок аминокислотных остатков белков, которые образуются в результате окислительной модификации. При этом степень окислительной деструкции белков оценивается путем дериватизации карбонильных групп 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ), флуоресцеинсемикарбазидом и флуоресцеинамином [267-270]. Довольно эффективным приемом определения карбонильных групп белков является иммуно-ферментный анализ типа HLISA. Белок из любого биологического материала неспецифически адсорбируется на IiLISA пластинках, а образовавшиеся производные с ДНФГ детектируют с помощью биотинилированных анти-ДНФГ антител со стрепта-видин-связанной пероксидазой хрена [271]. Для более полной оценки степени окислительной модификации также определяют и окисление аминокислотных остатков, в частности тирозина и триптофана. Разработаны спектрофлуориметрические методы определения степени окислительной модификации белков по флуоресценции продукта окисления тирозина - битирозина и снижению флуоресценции триптофана [272-274]. В ряде случаев информативным оказывается анализ структурных изменений аминокислот с помощью электрофореза и хроматографии [249].
Клиническая фармакокинетика транквилизатора фосфабензида и его взаимодействие с биосубстратами
Создание высокоэффективных и безопасных лекарственных средств требует проведения комплексных биофармацевтических исследований всасывания, транспорта, выведения лекарственного вещества и его метаболитов, их связывания с биологическими субстратами организма человека, изучения кинетики процессов биотрансформации, а также выявления возможных генетических основ полиморфизма метаболических превращений. При этом перспективным направлением развития фармацевтической химии является разработка избирательных, чувствительных, высокопроизводительных и достаточно доступных для клинической практики методов биофармацевтического анализа [5,12,104,105]. Таким требованиям в большой степени отвечают проточные методы анализа, такие как проточно-инжекционный анализ и высокоэффективная жидкостная хроматография, особенно со спектрофотометрическими вариантами детектирования.
Помимо теоретического значения, которое имеют исследования в области биофармацевтического анализа для изучения вновь создаваемых и внедряемых в лечебную практику лекарственных средств, несомненна и практическая роль этих результатов в области клинической фармации. Во многом это определено значительным расширением арсенала лекарственных средств и динамизмом фармакотерапии, увеличением объема информации о действии ЛВ в последние годы. В клинической фармации особое значение приобретает использование фармакокинетических исследований для выявления особенностей действия лекарственных средств от различных факторов среды, оценки индукции и угнетения ферментных систем метаболизма [226].
Применение высокоэффективных технологий биофармацевтического анализа дает возможность предупреждать возможное побочное действие лекарств, разрабатывать оптимальные режимы фармакотерапии, контролировать процесс лечения и оценивать риск возникновения токсикации, канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности, а также осуществлять раннюю досимптоматическую диагностику заболеваний.
Избирательность детектирования ряда лекарственных веществ (гидразидов кислот, сульфаниламидов) в биологических субстратах нашла применение для фарма-кокинетических исследований генетически детерминированных процессов биотрансформации лекарственных веществ в организме человека.
Бимодальность скорости процесса ацетилирования характерна для целого ряда лекарственных веществ, содержащих аминные функциональные группы (гидразиды кислот, производные изоникотиновой и п-аминобензойной кислот, апрессин, сульфаниламиды и др.), а также промышленных продуктов (ариламины, гидразины и их замещенные). Скорость их биотрансформации генетически детерминирована и определяется активностью фермента N-ацетилтрансферазы в цитозолс печени [204,205,208].
При этом наблюдается бимодальное распределение пациентов по скорости метаболических превращений (быстрые и медленные ацетиляторы). Побочные явления от передозировки лекарственных средств, например, при лечении гипертонии, наблюдаются у медленных ацетиляторов. Для быстрых инактиваторов обычные дозы лекарств могут оказаться неэффективными. Полиморфизм ацетилирования используют в качестве фенотипичсского маркера, позволяющего прогнозировать побочные эффекты лекарственных веществ (ЛВ) и экотоксикантов, выявлять различную устойчивость к заболеваниям.
Определение фенотипа ацетилирования основано на реакциях получения окрашенных диазопроизводных лекарственных веществ, продуктов их конденсации с карбонильными соединениями и других производных [213,217-220]. Использование этих аналитических приемов, однако, часто малоизбирательно из-за сложного состава анализируемой матрицы, не пригодно для дсриватизации тсст-марксров в системе ПИ А и требует обязательного применения методов разделения и концентрирования на предварительных стадиях анализа биологических жидкостей. Особую актуальность при выборе аналитической технологии приобретают не-инвазивные процедуры, которые предусматривают использование методов пробоот-бора без нарушения естественных барьеров организма. Для этих целей особенно перспективно использование мочи и слюны обследуемых.
С использованием результатов, полученных при исследовании аналитических реакций гидразидов кислот (изониазид, апрессин) и сульфаниламидов (глава 1), были предложены методы определения фенотипа биотрансформации лекарственных веществ по типу ацетилирования. Методы основаны на изучении фармакогенетических параметров выведения тест-маркеров ацетилирования изониазида и сульфадимезина с мочой обследуемого после однократного перорального приема разовой дозы препарата. Основным продуктом метаболических превращений этих ЛВ в организме человека (до 70 %) являются их ацетильные производные. Для этих препаратов характерно бимодальное распределение скорости выведения из организма человека в соответствие с его генетическими особенностями. В связи с этим изониазид и сульфадимезин можно использовать в качестве фармакогенетических маркеров для определения фенотипа биотрансформации ксенобиотиков по типу ацетилирования.
Аналитические определения свободного лекарственного вещества в биосубстратах пациентов проведены спектрофотометрическим, хроматографическими (ОФ-ВЭЖХ, ТСХ) и ПИ методами. Детектирование изониазида по собственному УФ-поглощению в хроматографическом анализе для решения фармакокинетических задач оказалось невозможным из-за низкой (10" моль/л) чувствительности определений. Кроме того, тест-маркеры оказалось неустойчивыми в моче. Так, вторичные взаимодействия изониазида в биосубстрате при комнатной температуре приводят к уменьшению его содержания на 50 % в течение суток. Последние, по-видимому, связаны с протеканием реакций конъюгации в биологическом субстрате или редокс превращений.
Реакция дериватизации аналита 4-хлор-5,7-динитробензофуразаном (изониазид) и 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном (сульфадимезин) приводила к понижению пределов обнаружения, позволяя охватывать всю область фармакокинетических концентраций ксенобиотиков (10"6 моль/л в ПИ А, спектрофотометрии и ОФ-ВЭЖХ, 0,2 мкг в ТСХ), а также позволяла сохранить анализируемые образцы в клинических исследованиях при длительном (до 5 суток) хранении биосубстратов пациента.
Проточно-инжекционные и хроматографические определения гидразина и его замещенных в реакционных смесях и сточных водах
Гидразин и его замещенные (1,1-диметилгидразин, несимметричный диметил-гидразин, НДМГ и фенилгидразин) находят широкое применение в химико-фармацевтическом производстве [393, 397-402]. На их сырьевой основе осуществляется синтез гидразидов и алкилгидразидов кислот, 3-(2,2,2-триметилгидразиний) про-пионата, производных пиразола и пиперидина, а также модификация природных соединений, фталоцианинов, эстрана и эстрадиола с образованием разнообразных по фармакологической активности соединений. Значительную массу гидразина используют в качестве сырья для производства росторегуляторов и стимуляторов роста растений (до 40%), вспенивателей, катализаторов полимеризации.
Гидразин и его замещенные относятся к наиболее токсичным загрязнителям окружающей среды, так как обладают сильно выраженными мутагенными и канцерогенными свойствами. Высокая токсичность этих загрязнителей привела к тому, что для них характерны низкие значения нормируемых содержаний в объектах окружающей среды (ПДК в воде для НДМГ составляет 0,02 мг/л, для гидразина - в рыбохозяй-ственных водоемах 0,2 мг/л 4()31). Это вызывает необходимость использования селективных и чувствительных высокопроизводительных проточных методов определения токсикантов в реакционных смесях синтеза фармацевтических препаратов и производственных водах химико-фармацевтических производств.
Основные методы определения гидразана и его замещенных основаны на образовании окрашенных соединений в ходе реакций комплексообразования или конденсации с органическими соединениями, содержащими карбонильные группы [404,405]. При этом применяется фотоколориметрические, флуориметрические, ГЖХ методов анализа при определении гидразина в виде его производных с п-диметиламинобензальдегидом, 2-фуральдегидом, 5-нитросалицилальдегидом, пен-тафторбензальдегидом [404].
Однако условия промышленного использования гидразина и его замещенных при синтезе фармацевтических продуктов различного назначения, многокомпонентность экосистем ограничивают или полностью исключают возможность использования этих методов без предварительного разделения компонентов анализируемых смесей. По этой причине проблема автоматизации методов определения гидразина и его замещенных является весьма актуальной. Вольтамперометрические и амперометри-ческие методы детектирования являются наиболее широко используемыми для мониторинга этих легко окисляющихся веществ в жидкостной хроматографии и ПИА [405-407]. Однако электрохимические определения затрудняются из-за высокого перенапряжения электродных процессов. Кроме того, в указанных работах практически не обсуждается влияние компонентов анализируемой матрицы, имеющих близкие химические свойства (замещенных гидразина, гидразидов, других аминосоединений), на результаты определения гидразина в системе ПИА. В то же время используемая система детектирования принципиально не позволяет проводить избирательные определения из-за близости потенциалов восстановления гидразина и его замещенных.
Сложность определения содержания гидразина и НДМГ в водных средах связана с их неограниченной растворимостью в воде и низкой растворимостью в малополярных средах, используемых для экстракционного концентрирования, высокой склонностью к окислительным превращениям при выполнении таких операций, как отгонка паром. Пределы обнаружения достигают 5 мкг/л при фотоколориметрическом, 50 мкг/л при полярографическом и 100 мкг/л при газохроматографическом определении гидразина и НДМГ. Они превышают допустимые уровни содержания гидразина и НДМГ в воде и вызывают необходимость концентрирования токсикантов при их следовых содержаниях в сточных водах химико-фармацевтических производств.
Ранее было изучено взаимодействие гидразина с БФЗ, которое в кислых и нейтральных средах происходит с образованием (4,4-гидразобис-(5,7-динитробензофуразана), являющегося двухпротонной NH-кислотой [322].
В электронных спектрах производного наблюдается интенсивная полоса переноса заряда (ППЗ) в длинноволновой области (=39000 л.моль 1.см 1 при 635,5 нм в ацетонитриле) (рис. 5.3). Сложные спектральные равновесия, характерные для этого производного в зависимости от состава среды, обусловлены эффектами избирательной сольватации и существованием различных форм этого соединения [322].
В отличие от динитробенз-2,1,3-оксадиазольных производных первичных алкил- и ариламинов, для растворов производного гидразина характерен батохромный сдвиг ППЗ по мере повышения кислотности среды. Эти результаты указывают на влияние сольватационных эффектов на спектральные свойства при образовании межмолекулярных Н-связей между NH-кислотными группами растворенного вещества и ABC (триэтиламин), а также между аци-формами о- и п-нитрогрупп карбоциклических фрагментов молекулы.
При двадцати- и более кратном избытке БФЗ спектральное равновесие необратимо смещается в сторону формы с полосой поглощения при Хм=635 нм независимо от состава среды и содержания в ней воды (рис. 5.4). Спектральные свойства производного гидразина в растворах при этом устойчивы в течение нескольких дней.
Для динитробензоксадиазольных производных замещённых гидразина (фенил-гидразин, 1,1-диметилгидразин, гидразиды кислот) образование бис-продуктов реакции с БФЗ уже невозможно. Поскольку равновесия двух форм, характерные для гид-разоБФЗ, для них не обнаруживаются, можно полагать, что влияние среды на спектры поглощения вещества определяется изменением в степени сопряжения концевых электроноакцепторных бензоксадиазольных фрагментов молекулы. Известно, что электронная проводимость замещенных гидразина определяется эффектом ря -ря отталкивания НЭП атомов азота, которое в основном состоянии понижена за счет поворота аминогруппы относительно друг друга [397]. Роль среды для рассматриваемого равновесия, по-видимому, заключается во влиянии сольватационных эффектов на степень сопряжения в молекуле вещества и проявляется в изменения электронной проводимости межъядерных аминогрупп.
