Введение к работе
Актуальность темы. Недостаток оригинальных отечественных лекарственных средств, соответствующих современному мировому уровню, является реальной экономической и национальной проблемой России. Зависимость от импортных субстанций негативно влияет на лекарственную безопасность страны. На российскую фармацевтическую отрасль оказывают влияние негативные факторы, среди которых технологическое отставание от зарубежных производителей с соответствующими различиями в части номенклатуры производимой продукции. Сегмент, по которому отставание приобретает широкий масштаб, представлен наиболее современными лекарствами, производство которых является чрезвычайно ёмким в отношении использования технологий. На сегодняшний день российская фармацевтическая промышленность производит достаточно ограниченный спектр лекарств, многие из которых можно считать устаревшими. Государство на протяжении последних лет демонстрирует высокую степень интереса к перспективным рынкам. Без сомнения, фармацевтический рынок также относится к их числу. Примером государственной заинтересованности является национальная программа «Стратегия Фарма 2020».
В этой связи одной из приоритетных задач действующей государственной программы развития фармацевтической промышленности Российской Федерации, в связи с переходом на инновационную модель, является обеспечение надлежащего контроля качества лекарственных средств.
Только используя эффективную материально-техническую аналитическую базу, можно обеспечить надлежащий уровень качества лекарственных средств, биологически активных соединений и, как результат, их эффективность и безопасность. Это определяет необходимость систематического совершенствования существующих методов фармацевтического анализа.
Известно, что к фармацевтическому анализу предъявляются достаточно высокие требования. Он должен отвечать критериям: «Специфичность», «Чувствительность», «Воспроизводимость», «Точность», «Экспрессность».
Следует иметь ввиду, что острая проблема дефицита инструментальной базы, сложившаяся в нашей стране в постсоветский период, по-прежнему остаётся актуальной. Это в целом препятствует обеспечению системы контроля качества лекарственных средств на уровне, отвечающем международным правилам GMP. Данное обстоятельство определяет необходимость внедрения новых и модифицированных методов анализа. Одним из путей решения данной проблемы является использование современных масс-спектрометрических методов.
За последние 40 лет создано большое количество масс-спектрометрических методов анализа, в связи с открытием мягких десорбционных способов ионизации.
Но из всего многообразия только некоторые из них реально обеспечили возможность эффективного анализа биологически активных соединений, это электроспрейная ионизация, химическая ионизация при атмосферном давлении, ионизация электронным ударом и матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация. Однако первые три метода используются как удобные детекторы в хроматографии, поэтому имеют исключительно подчинённый характер и самостоятельного применения не приобрели.
Выгодно от указанных методов отличается масс-спектрометрия матрично-активированной лазерной десорбционной ионизацией (MALDI/TOF/MS). Основными достоинствами метода являются: универсальность при анализе соединений любой молекулярной массы, полярности и термочувствительности; экспрессность, чувствительность, объём получаемой информации. Важно отметить, что данный метод практически не требует расходных материалов и сложной пробоподготовки.
Опубликованные к настоящему времени работы, посвящённые результатам использования MALDI/TOF/MS, не касаются вопросов фармацевтического анализа.
Поэтому теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение использования метода MALDI/TOF/MS для анализа лекарственных средств и биологически активных соединений определяет актуальность настоящего исследования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности использования MALDI/TOF/MS для количественного анализа на примере исследования отдельных биологически активных соединений различных групп.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие основные и сопутствующие задачи исследования:
-
Экспериментально подтвердить возможности использования метода MALDI/TOF/MS для исследования качественных характеристик изучаемых тест-объектов природного и синтетического происхождения. Доказать аналитические преимущества MALDI/TOF/MS перед традиционными методами анализа.
-
Предложить набор оригинальных методик идентификации исследуемых тест-объектов с использованием спектра традиционных и современных методов анализа.
-
Выявить дополнительные аналитические возможности метода MALDI/TOF/MS в ходе идентификации отдельных соединений.
-
Провести сравнительную характеристику методов MALDI/TOF/MS и ОФ ВЭЖХ, ГЖХ при идентификации полифенольных компонентов, жирных масел, каротиноидов, выделенных из растительных объектов.
-
Теоретически обосновать и экспериментально подтвердить возможность количественного определения изучаемых тест-препаратов методом MALDI/TOF/MS и провести сравнительную оценку с результатами, полученными альтернативными методами анализа.
-
Разработать нормативную документацию на масс-спектрометрический метод анализа. Предложить проекты нормативных актов на некоторые изученные виды лекарственного растительного сырья с учётом тенденций современной фармацевтической науки, для чего установить значимые анатомические диагностические признаки объектов исследования, в том числе с использованием растровой электронной микроскопии.
Научная новизна работы. Впервые проведена идентификация субстанций 3,5,4’-тригидрокси-транс-стильбена, карнозина и лоратадина с использованием комплекса традиционных методов анализа – ОФ ВЭЖХ, ТСХ, УФ-, ИК-спектроскопии, химических реакций, а также MALDI/TOF/MS. Показано, что применение метода MALDI/TOF/MS характеризуется существенными преимуществами перед традиционными методами анализа, в первую очередь чувствительностью и экспрессностью.
Впервые разработан новый способ идентификации комплексов растительных полифенолов, заключающийся в использовании матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации с времяпролётным анализатором масс, позволяющий исключить этап предварительного разделения комплексов анализируемых соединений.
Впервые с использованием метода MALDI/TOF/MS охарактеризован состав фенольных соединений будры плющевидной, репешка обыкновенного, клевера лугового, можжевельника длиннохвойного, лофанта анисового; антоцианов ирги ольхолистной, смородины чёрной, рябины обыкновенной, винограда культурного, черёмухи обыкновенной, поздней и виргинской, шиповника колючейшего. Правильность полученных результатов подтверждена методом ОФ ВЭЖХ.
Проведена количественная оценка биологически активных соединений будры плющевидной, репешка обыкновенного, клевера лугового, лофанта анисового методом абсолютной градуировки по доминирующим компонентам в условиях ОФ ВЭЖХ.
Впервые с помощью метода MALDI/TOF/MS установлен состав триацилглицеридов жирных масел энотеры двулетней, ореха грецкого. Правильность полученных результатов подтверждена методом газожидкостной хроматографии.
В результате проведённых исследований подтверждена целесообразность использования метода MALDI/TOF/MS для идентификации индивидуальных компонентов и суммарных растительных комплексов, в связи с чем впервые сформулировано понятие «масс-спектрометрический профиль».
В результате использования метода ОФ ВЭЖХ для анализа растительных объектов установлены закономерности между строением и подвижностью фенольных соединений.
Впервые теоретически обоснована и доказана в эксперименте возможность количественного определения биологически активных соединений различной природы методом MALDI/TOF/MS с использованием принципа внутренней стандартизации.
Практическая значимость.
Разработанные методики количественного определения, 3,5,4’-тригидрокси-транс-стильбена, карнозина, лоратадина в субстанциях методом масс-спектрометрии (MALDI/TOF/MS) с применением внутренней стандартизации включены в рабочие программы кафедр фармацевтической химии и фармакогнозии, фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения ФГАОУ ВПО «Белгородский национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации.
Разработаны проекты фармакопейных статей: ОФС «масс-спектрометрия», ФС «Черёмухи плоды», «Репешка трава». Данные проекты НД приняты к рассмотрению Центром фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения России.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках научного направления «Разработка методологических подходов к анализу природных и синтетических биологически активных соединений в объектах различного происхождения. Изучение фармакологических аспектов использования данных биологически активных соединений» и государственным контрактом №14.740.11.0119 от 8 сентября 2010 года, проект «Комплексные фармакологические и технологические исследования ряда субмикроструктурированных (наноструктурированных) фармацевтических субстанций с доказанными изменёнными физико-химическими свойствами», номер государственной регистрации темы 01201061846.
Основные положения, выносимые на защиту:
- полученные экспериментальные данные доказали объективные аналитические преимущества метода MALDI/TOF/MS перед традиционными при определении качественных характеристик исследуемых соединений в поликомпонентных объектах;
- в результате теоретических и экспериментальных исследований доказана возможность применения метода MALDI/TOF/MS в целях количественного анализа биологически активных соединений различного происхождения на основе принципа внутренней стандартизации.
Личный вклад автора. Автором проведён анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, лично проводился отбор объектов исследования, анализировались экспериментальные образцы растительных материалов и фармацевтических субстанций с помощью классических (ТСХ, УФ- и ИК-спектроскопия, ГЖХ) и современных (ВЭЖХ, MALDI/TOF/MS) методов анализа. Диссертантом самостоятельно выполнялись анализ и обобщение результатов, составление таблиц и графиков, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. Доля автора в совместных публикациях составила 75%.
Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы фитодизайна» (г. Белгород, 2007), 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008), международной научно-практической конференции, посвящённой 10-летию образования Ботанического сада Белгородского государственного университета «Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения» (Белгород, 2009), 65-й региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвящённой 45-летию фармацевтического факультета «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011).
По материалам диссертационной работы опубликована 51 работа, из них: 1 монография, выпущенная издательством РАМН, 35 работ в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК, получено 3 патента Российской Федерации, 2 свидетельства о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности, 2 методических пособия.
Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 326 страницах машинописного текста, иллюстрирована 123 рисунками, 75 таблицами и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы, включающего 318 источников, из которых 182 работы иностранных авторов, и приложений.
Похожие диссертации на Методологические основы комплексного исследования полифенольных веществ и тест-соединений природного и синтетического происхождения
![Аналитические и технологические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной [Электронный ресурс]](/i/i/4601/192337.png "Аналитические и технологические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной [Электронный ресурс] Климова Инна Юрьевна")
