Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Итоги и перспективы фармакогностических исследований фармакопейных видов зверобоя (обзор литературы) 13
1.1. Историческая справка 13
1.2. Ботанико-фармакогностическое описание некоторых представителей рода Hypericum 13
1.2.1. Ботаническое описание. Распространение 14
1.2.2. Химический состав фармакопейных видов зверобоя 18
1.2.3. Применение фармакопейных видов зверобоя -зверобоя пятнистого Hypericum maculatum Granz. и зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L. 23
1.2.4. Заготовка и сушка 24
1.2.5. Изучение перспектив создания импортозамещающих антидепрессантных препаратов 25
1.2.6. Сравнительный анализ побочных действий разных групп антидепрессантов
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 31
2.1. Объекты исследования 31
2.2. Методы исследования 32
2.2.1. Химические и хроматографические методы 32
2.2.2. Метод тонкослойной хроматографии 33
2.2.3. Метод колоночной хроматографии 34
2.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 34
2.3. Физико-химические и спектральные методы ( Н- 34 ЯМР-спектроскопия, УФ- и масс-спектрометрия)
2.4. Количественное определение 35
2.4.1, Методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в траве зверобоя 35
2.4.2. Методика прямого спектрофотометрического определения суммы антраценпроизводных в траве зверобоя 36
2.5. Методики морфолого-анатомическго анализа 37
2.6. Технологические методы 38
2.7. Методики фармакологического исследования 39
2.7.1. Тест «Отчаяние» 39
2.7.2. Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»
ГЛАВА 3. Морфолого-анатомический анализ плодов некоторых видов рода hypericum 41
3.1. Морфолого-анатомическое исследование плодов Hypericum perforatum L. 42
3.1.1. Изучение морфологических характеристик плодов Hypericum perforatum L. 42
3.1.2. Изучение анатомо-гистологических особенностей плодов Hypericum perforatum L . 43
3.2. Морфолого-анатомическое исследование плодов Hypericum maculaium Grantz. 50
3.2.1. Изучение морфологических характеристик плодов Hypericum maculatiun Grantz. 51
3.2.2. Изучение анатомо-гистологических особенностей плодов Hypericum maculatum Grantz. 52
3.3. Морфолого-анатомическое исследование плодов Hypericum elegans Steph. 56
3.3.1. Изучение морфологических характеристик плодов Hypericum elegans Steph. 57
3.3.2. Изучение анатомо-гистологических особенностей плодов Hypericum elegans Steph. 58
3.4. Микроскопия измельченного сырья зверобоя Hypericum perforatum L., Hypericum maculatiun Grantz., Hypericum elegans Steph.
ГЛАВА 4. Сравнительное изучение химического состава травы и препаратов зверобоя пятнистого {hypericummaculatum grantz.) и зверобоя продырявленного (hypericum perforatuml.)
4.1. Качественный и количественный анализ травы и препаратов зверобоя пятнистого (Hypericum macidatum Grantz.) 68
4.2. Выделение и идентификация индивидуальных соединений из травы зверобоя пятнистого (Hypericum macidatum Grantz.)
ГЛАВА 5. Сравнительное исследование комплексного состава травы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленого методом ВЭЖХ 79
5.1. ВЭЖХ-анализ индивидуальных веществ из травы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного 79
5.2. Методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного
Глава 6. Стандартизация и создание импортозамещающих препаратов «зверобоя сироп» и «зверобоя таблетки» 87
6.1. Разработка способа получения и методов анализа препарата «Зверобоя сироп» 87
6.1.1. Методика качественного анализа препарата «Зверобоя сироп" 87
6.1.2. Методика количественного анализа препарата «Зверобоя сироп» 88
6.1.2.1. Определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин 88
6.1.2.2. Определение суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин 89
6.2. Разработка способа получения нового препарата «Зверобоя таблетки» 92
6.2.1. Методика качественного анализа препарата «Зверобоя таблетки» 96
6.2.2. Методика количественного определения препарата «Зверобоя таблетки» 97 6.2.2.1. Определение флавоноидов в пересчете на рутин 97
6.2.2.2. Определение антраценпроизводных в пересчете на гиперицин 98
6.3. Определение фармакологической активности препаратов фармакопейных видов зверобоя общие выводы 104
Список литературы 106
- Ботаническое описание. Распространение
- Метод тонкослойной хроматографии
- Изучение анатомо-гистологических особенностей плодов Hypericum perforatum L
- Методика качественного анализа препарата «Зверобоя сироп"
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время депрессивные состояния рассматриваются как одна из важнейших проблем современной медицины. В материалах ВОЗ имеются данные, свидетельствующие о том, что более 110 млн. человек в мире страдают депрессией, и тенденция к последовательному увеличению распространенности депрессивных расстройств сохраняется.
Лечение депрессивных состояний, как правило, длительное, в результате чего важное значение приобретают безопасность и переносимость применяемых лекарственных средств. В связи с этим возрос интерес к препаратам растительного происхождения, которым на сегодняшний день отдают предпочтение до 80% населения.
В настоящее время в качестве источника антидепрессантных лекарственных препаратов природного происхождения служит зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.). Однако на фармацевтическом рынке Российской Федерации имеются только импортные дорогостоящие препараты («Деприм», «Негрустин» и др.). В нашей стране фармакопейными видами являются зверобой продырявленный и зверобоя пятнистый (Самылина И.А., Северцев В.А.,2003; Киселева Т.Л. и др., 2007), из травы которых производят антисептические, противовоспалительные и вяжущие лекарственные средства, и в этом плане данные виды рассматриваются как равноценные. Однако по последним литературным данным обнаружены некоторые отличия между ними как по химическому составу, так и по спектру биологической активности. Учитывая тот факт, что антидепрессантные свойства обусловлены несколькими группами действующих веществ (антраценпроизводными, некоторыми флавоноидами, флороглюцинами), представляется актуальным изучение особенностей химического состава биологически активных соединений (БАС) менее исследованной в этом плане травы зверобоя пятнистого. Результаты данных исследований могут явиться обоснованием рациональности использования сырья травы зверобоя пятнистого в качестве источника импортозамещающих антидепрессантных лекарственных средств.
Кроме того, до настоящего времени не изучены возможности применения высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья и препаратов видов рода Зверобой.
На данный момент остается нерешенным и вопрос определения качества сырья по такому критерию, как числовой показатель содержания плодов в сырье, введение которого позволит более жестко регулировать сбор сырья с точки зрения фазы вегетации. Кроме того, не до конца изученным представляется вопрос по анатомо-морфологическим признакам плодов видов рода зверобой.
С учетом особенностей химического состава целесообразно изучение спектра нейротропной активности травы и субстанций зверобоя пятнистого.
Учитывая ограниченный ассортимент антидепрессантов растительного происхождения, актуальными являются исследования по обоснованию создания лекарственных форм в виде сиропа и таблеток.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое исследование по обоснованию целесообразности разработки антидепрессантных препаратов на основе травы зверобоя.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Исследование анатомо-морфологических признаков плодов и семян зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), зверобоя пятнистого (Hypericum maculatum Grantz.) и зверобоя изящного (Hypericum elegans Steph.).
-
Препаративное выделение и разделение основных БАС зверобоя пятнистого и установление структуры и физико-химических характеристик выделенных веществ.
-
Оценка возможностей и перспектив метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для анализа сырья и лекарственных препаратов зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного.
-
Разработка новых импортозамещающих антидепрессантных препаратов «Зверобоя сироп» и «Зверобоя таблетки».
-
Разработка методов качественного и количественного анализа новых лекарственных препаратов «Зверобоя сироп» и «Зверобоя таблетки» на основе травы зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого.
-
Обоснование целесообразности использования травы зверобоя пятнистого в качестве сырьевого источника БАС с антидепрессантной активностью на основании фармакологических исследований.
Научная новизна. В результате морфолого-анатомического изучения плодов в траве зверобоя, заготовленного в разные фазы вегетации, выявлены новые диагностические признаки. Даны рекомендации по нормированию содержания плодов в доброкачественном сырье.
Впервые в Российской Федерации разработаны методики ВЭЖХ-анализа для стандартизации зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого, а также выявлены возможности использования ВЭЖХ в качестве метода для определения видовой принадлежности и проведения химической таксации. При исследовании химического состава травы зверобоя пятнистого идентифицированы 6 индивидуальных соединения: рутин, гиперозид, кверцетин, гиперицин, хлорогеновая кислота, гиперфорин, установление структуры которых проводилось с использованием УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии в сочетании с традиционными методами химического анализа.
Разработаны методики спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин для нового лекарственного препарата «Зверобоя сироп», предусматривающие предварительную ацетоновую экстракцию анализируемых БАС.
Основываясь на принципе унификации методики в ряду «ЛРС –лекарственная субстанция – лекарственный препарат» (Самылина И.А. и др.,1994 г.), разработана методика стандартизации сухого экстракта зверобоя для нового лекарственного препарата «Зверобоя таблетки», основанная на определении суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин.
Сравнительное изучение спектра и выраженности нейротропной активности препаратов изучаемых видов зверобоя показало преимущество антидепрессантной активности экстракционных препаратов зверобоя пятнистого в два раза по сравнению с подобными препаратами зверобоя продырявленного. Для фармакопейных видов зверобоя впервые выявлена анксиолитическая активность, а для антрахинона гиперицина – антидепрессантный эффект. Результаты этих исследований свидетельствуют о целесообразности использования травы зверобоя пятнистого в качестве источника антидепрессантных фитопрепаратов. Доказано наличие диуретической активности для экстракционных препаратов зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного.
Результаты исследования острой токсичности препаратов зверобоя, проведенные на белых нелинейных крысах на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, показали, что исследуемые препараты относятся к классу малотоксичных, не вызывают отсроченной гибели животных и нарушения жизненно важных функций организма.
На основе результатов фармакологического исследования обоснована целесообразность разработки импортозамещающих антидепрессантных лекарственных препаратов «Зверобоя сироп» и «Зверобоя таблетки», причем в качестве дополнительного сырьевого источника трава зверобоя пятнистого.
Практическая значимость. По результатам морфолого-анатомического анализа плодов и семян зверобоя продырявленного, зверобоя пятнистого и зверобоя изящного разработаны допонительные подходы к определению качества сырья и наличию в нем примесного вида. Показана целесообразность нормирования в сырье зверобоя числового показателя «Содержание плодов не более 5%» и включение данного параметра в ФС «Зверобоя трава».
Разработаны методики качественного и количественного анализа новых лекарственных препаратов «Зверобоя сироп» и «Зверобоя таблетки», которые включены в соответствующие проекты ФСП.
По результатам сравнительного исследования спектра нейротропной активности препаратов зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного доказана возможность применения травы зверобоя пятнистого в качестве источника импортозамещающих антидепрессантных лекарственных средств.
Результаты исследований используются в научных исследованиях и учебном процессе кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедры химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Минздравсоцразвития России (акты внедрения от 25.04.2011 г.). Также результаты исследований используются на ЗАО «Самаралектравы», в ГУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области».
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Результаты сравнительного морфолого-анатомического изучения плодов фармакопейных и примесного видов зверобоя.
-
Результаты изучения химического состава травы зверобоя пятнистого.
-
Обоснование целесообразности применения метода ВЭЖХ-анализа длякачественной и количественной оценки содержания основных БАС в траве зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого.
-
Разработка показателей качества сырья и препаратов исследуемых видов зверобоя и обоснование их включения в НД.
-
Результаты исследований по обоснованию создания импортозамещающих препаратов на основе травы зверобоя.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по темам «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ Государственной регистрации 01200900658) и «Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов» (№ Государственной регистрации 01200405620), а также соответствует тематике Проблемной комиссии по химико-фармацевтическим наукам.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XI и XII Всероссийских конгрессах “Экология и здоровье человека” (Самара, 2007, 2010), на научно-практической конференции «Аспирантские чтения» (Самара, 2009, 2010), на VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2009). Выполнение фрагментов диссертационного исследования поддержаны по линии программы «У.М.Н.И.К-2008» (Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 28 научных работах, из них 9 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы, 55 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 177 источников, из которых 38 – на иностранных языках. В Приложения вынесены: материалы по разработке НД, акты внедрения, рационализаторские предложения.
Ботаническое описание. Распространение
Зверобой в народе называют Ивановская трава, хворобой, семибратная кровь, трава от 99 болезней и др. [26,44,49,119] Одно из названий Ивановская кровь связано с народным сказанием о смерти Иоанна Крестителя, на месте пролившейся крови которого выросло именно это растение [26]. По другой версии, название «зверобой» произошло от казахского «джерабай», обозначающего «целитель ран». Также существует сказание о том, что название растения связано со способностью вызывать заболевания овец [26,49].
Как описано в литературе, в старину это растение считалось волшебным. Его добавляли в солому, которой набивали детские матрасы, чтобы дети спокойно спали, считалось, что трава зверобоя защищала детей от испуга во сне. Также считалось, что данное растение отгоняет злых духов и защищает человека от нападения диких зверей [26,48].
О целебных свойствах этого растения писали такие известные ученые-мыслители, как Гиппократ, Диоскорид, Плиний старший и Авиценна [26].
Нами проанализировны источники литературы, касающиеся ботанического описания, распространения, химического состава, правил сбора и сушки травы зверобоя. 1.2.1. Ботаническое описание. Распространение По литературным данным к роду Зверобой (Hypericum L.) относятся около 200 видов трав и полукустарников, растущих преимущественно в умеренном и субтропическом поясе северного полушария и особенно многочисленных в Средиземноморье [7,47,98]. Многие виды растений рода Hypericum L. используются в народном хозяйстве, медицине, пищевой промышленности [5,13,18,26,28,30,31,34,41,42,54,63,64,65,66,84,85,102,113,114,119,138,141]. Особое внимание уделено фармакопейным видам зверобоя - зверобою продырявленному Hypericum perforatum L. (рис. 1) и зверобою пятнистому Hypericum maculatum Grantz. (рис. 2).
По литературным данным, зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) - многолетнее травянистое растение, 30-70 см высотой [20,68,98,124]. Корневище короткое, вертикальное, корни слабоветвистые, неглубоко погруженные в почву. Стебли голые, с двумя выступающими ребрами, в верхней части супротивно ветвистые, облиственные. Листья расположены супротивно, длиной 1-3 см, шириной 2-8 мм, имеют многочисленные, хорошо заметными на просвет железками. Цветки многочисленные, собраные на верхушке стеблей в широко метельчатые или почти щитковидные соцветия, чашечка пятираздельная, лопасти ее ланцетовидные, или линейно-ланцетовидные с редкими черными овальными точками [98,131,132]. Венчик пятилепестный, лепестки длиной 12-15 мм, золотисто-желтые, удлиненно-элиптические, тупые, обычно неравносторонние, с черными точками по краю. Многочисленные тычинки собранны в три пучка. Пестик один с верхней завязью, отогнутой кнаружи и тремя столбиками. Плод - многосеменная, трехгранная, трехгнездная коричневая, с железистыми желтыми продольными полосками и черточками коробочка длиной 6 мм и шириной 5 мм. Семена мелкие, цилиндрические, коричневого цвета. Растение цветет в июне-августе, созревание плодов происходит в сентябре [54,97,98]. При скашивании зверобоя в годы с влажной второй половиной лета в августе-сентябре наблюдается его повторное отрастание и вторичное цветение [98]. Зверобой продырявленный (рис. 1 А) размножается семенами, цветет со 2-3-го года жизни [54,88,98]. Произрастает по светлым лиственным и смешанным лесам, зараслям кустарников, полянам, луговым степям, лугам и как сорное среди посевов, по окраинам полей, насыпям и окраинам дорог [6,54,103,106] .
Вторым фармакопейным видом является зверобой пятнистый {Hypericum maculatum Granz.) (рис. 1 Б). Цветение растения наблюдается в июне - июле. Зверобой пятнистый произрастает по лесам, опушкам, кустарникам, лугам, берегам водоемов, склонам, полям и огородам. Растение встречается во всех областях, особенно в более северных, где встречается чаще, чем Hypericum perforatum L. [128].
По литературным источникам, близкородственными (примесными) видами, недопустимыми к сбору, являются зверобой изящный - Hypericum elegans Steph. Рисунок 2 - Ареал зверобоя изящного Hypericum elegans Steph.
(рис. 1 В) [90], зверобой горный - Hypericum monianum L., зверобой жестковолосый (волосистый) - Hypericum hirsiitum L.[39,40,43,120]. Некоторые из них даже занесены в красную книгу Самарской области [43], например зверобой изящный Hypericum elegans Steph. (рис. 3 и 4).
В этой связи приведены основные отличительные признаки некоторых видов зверобоя приведены в таблице 1 в соответствии с литературным источником [98]. Таблица 1 - Отличительные признаки различных видов зверобоя Название Морфологические признаки растения Стебли Листья Соцветия Цветки Зверобой Голые, высотой Овальные, Почти Лепестки обыковенный 30-80 см, с удиненно- щитковидн золотисто - Hypericum двумя ребрами эллиптические ые желтые, perforatum L. , длиной 1-3 чашелистики (допущен к см, голые цельнокраиние, заготовке) тонкозаостренн ые Зверобой пятнистый - Н. maculatum Grantz. (Я. quadrangulum L.) (допущен к заготовке самостоятельн о) Голые, высотой30-70 см, четырехгранные Эллиптические илиовальные,длиной 0,5-3,5см, голые Кистевидные Лепестки золотисто-желтые, чашелистики цельнокрайние, тупые
Зверобой изящный - Н. degans Steph. Голые, высотой20-80 см с двумя ребрами Ланцетовидны е, длиной 1,5-2,5 см, голые Широкая метелка Лепестки светло-желтые, чашелистики покраютонкозубчатые счернымижелезками
Зверобой горный - Н. montanum L. Слабоопушенн ые, высотой 30-60 см, цилиндрические Голые, яйцевидно-продолговаты е, длиной 1,5-5 см Редкая,короткая,овальнаякисть Лепесткибледно-желтые,чашелистики покраю черно-железисто-зубчатые
Зверобой жестковолосы й(волосистый) -Н. hirsutum L. Волосистые, высотой 50-100см, цилиндрические Волосистые,эллиптические, длиной 1,5-5см Длиннаяредкаякисть Лепестки золотисто-желтые, чашелистики по краю черно-железисто-зубчатые 1.2.2. Химический состав представителей фармакопейных видов зверобоя
В сравнительном плане нами проанализированы данные обширной литературной базы о химическом составе травы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного [54,163,164,165]. За рубежом трава зверобоя представляет интерес как сырье для получения таких антидепрессантных препаратов, как «Деприм», «Негрустин», «Гелариум Гиперикум» [22,23,29,31,38,52,53,55,58,91,92,93,94,154,160,166]. В Российской Федерации трава зверобоя применяется как антисептическое, противовоспалительное, ранозаживляющее средство [5,41,60,61,89,100,122,123].
Известно, что в траве зверобоя продырявленного содержатся флавоноиды (до 2,0%), которые являются ведущей группой соединений [54,57,148]. Доминирующими соединениями среди флавоноидов являются флавонолы гиперозид и рутин [54], а также содержатся кверцетин и его производные (кверцитрин, изокверцитрин) [8,12,14,17,32,37,41,55,56,58,59], апигенин и димеры апигенина (3,8- и 3 ,8-бисапигенин) [126,133,135,145,149,162], кемпферол, антоцианы, лейкоантоцианы, (+)-катехин, (-)-эпикатехин [62,69,72-74,92,96,99].
Вторая группа БАС представлена антраценпроизводными [94,95,150] (гиперицин, псевдогиперицин), протопсевдогиперицин, гиперкодегидродиантрон, франгулаэмодинантронол (последние три считаются предшественниками первых двух названных антраценпроизводных и содержатся в незначительных количествах) [9,41,58,137]
В сырье содержатся дубильные вещества конденсированной природы. Некоторые из авторов отмечают также содержание в траве зверобоя ксантонов и ксантонолигнанов [41,51,54]. Производные флороглюцинов представлены гиперфорином [54,57,101]
Метод тонкослойной хроматографии
Эпидермальные клетки округлой формы с выраженной кутикулой. С поверхности (рис. 26) клетки эпидермы вытянутой многоугольной формы. Поровые каналы стенок незаметны. Изредка встречаются вместилища мелкие с желтым содержимым.
Предыдущие объекты, проанализированные в настоящей главе, как известно, являются лекарственным растительным сырьём и по современной трактовке ФС могут быть взаимозаменяемыми растениями при заготовке травы зверобоя. Однако известно, что в средней полосе РФ произрастают пять видов зверобоя, из них в Самарской области известно четыре: зверобой волосистый, зверобой изящный, зверобой продырявленный, зверобой пятнистый [57,128]. При этом виды зверобой волосистый и зверобой изящный являются вероятными примесями к целевому сырью.
В настоящей работе нами дополнительно к лекарственным видам проанализированы плоды вероятного примесного объекта - зверобоя изящного. Аналогично сравниваемым видам плод зверобоя изящного - коническая коробочка продолговато-яйцевидной формы, коричневого цвета. Зрелый плод достигает в длину 7-8 мм, в ширину до 5мм. Коробочка мелкобороздчатая (рис. 27). Зрелые семена плодов мелкие до 1 мм в длину (рис.28), продолговато-цилиндрические, иногда загнутые, тупые. Цвет зрелых семян буроватый, поверхность - ячеисто-точечная. Необходимо отметить, что в незрелых плодах семена уплощенные и имеют более светлую окраску.
Морфологически плод зверобоя изящного мало отличим от плодов сравниваемых видов зверобоя. Однако упомянутая коническая форма его может служить диагностикой, дополняющей основные признаки, присущие траве зверобоя (стебель, лист, цветок).
Изучение анатомо-гистологических особенностей плодов Hypericum elegans Steph. Анализ анатомии плодов зверобоя изящного показал схожесть их строения со строением плодов фармакопейных видов зверобоя (рис. 29). В частности, выявлена идентичность строения и расположения тканей перикарпа (рис. 30-33).
Отличительными признаками таких составляющих элементов оболочки плода как экзо-, мезо- и эндокарпий явились: размерность клеток, толщина оболочек, что весьма часто зависит от экологических факторов и мест произрастания анализируемого растительного объекта.
Так, эндокарпий плодов зверобоя изящного представлен также как и у двух сравниваемых фармакопейных видов склерифицированными клетками с утолщенными оболочками, окрашивающимися в желтый цвет при обработке раствором сернокислого анилина (рис. 31). Однако клетки эндокарпа зверобоя изящного крупнее в поперечном сечении, чем клетки той же ткани у зверобоя пятнистого. Они широко-просветные, что отличает их от клеток эндокарпия зверобоя продырявленного. В стенках клеток эндокарпа Hypericum elegans Steph. отчетливо видны поровые каналы, не обнаруживаемые в клетках эндокарпия сравниваемых видов.
При рассмотрении с поверхности клетки эндокарпа плотносомкнутые друг с другом образуют покров с характерным рисунком (рис. 32) аналогично эндокарпиям плодов зверобоя продырявленного и пятнистого. Рисунок 31 - Эндокарпий плода зверобоя изящного. Поперечный срез (х400).
Стенки клеток экзокарпа нативно окрашены в светлокоричневый цвет (рис. 33). Причем наибольшая пигментация наблюдается у смежных стенок клеток экзокарпа (рис. 33).
При рассмотрении с поверхности экзокарпий представлен крупными клетками (до 150 мкм в длину и 50 мкм в ширину) продолговато-эллиптической формы. В стенках клеток видны поровые каналы (рис. 33).
На поверхности эпидермиса встречаются устьица окруженные клетками, заметно отличающимися по форме от клеток эпидермы, их количество варьирует от 4 до 5 (анамоцитный тип устьичного аппарата).
Микроскопия измельченного сырья зверобоя Hypericum perforatum L., Hypericum maculatum Grantz., Hypericum elegans Steph.
Изученные особенности морфологического и анатомо-гистологического строения плодов зверобоя продырявленного безусловно являются диагностичными при определении вида, указанного растения, в природе и при его заготовке. Однако трава зверобоя, перерабатываемая на фармацевтических предприятиях, подлежит измельчению, что значительно уменьшает возможность диагностики растительного объекта по морфологическим характеристикам. В виду чего, нами проанализирована возможность использования изученных анатомических особенностей плода при диагностике измельченного сырья зверобоя.
Изучение анатомо-гистологических особенностей плодов Hypericum perforatum L
С целью разработки способа получения препарата «Зверобоя сироп» было подготовлено по две партии препаратов сиропа на основе сахара-рафинада с 5% и 10% концентрацией жидкого экстракта зверобоя и сиропа на основе сорбита с 5% и 10% концентрацией данной субстанции. Данные виды сиропа изготавливались как без добавления стабилизатора, так и со стабилизатором - лимонной кислотой, в количестве 1 % от массы экстракта. 6.1.1. Методика качественного анализа препарата «Зверобоя сироп"
Качественное определение лекарственного препарата «Зверобоя сироп» производят методом ТСХ, для разделения веществ использовалась система бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2) (рис. 54). БУВ (4 і :j
ТСХ-схема лекарственного препарата «Зверобоя сироп». Обозначения: 1 - жидкий экстракт зверобоя продырявленного; 2 - жидкий экстракт зверобоя пятнистого; 3 - 5% сироп на основе экстракта зверобоя продырявленного без стабилизатора; 4 - 5% сироп на основе экстракта зверобоя продырявленного со стабилизатором; 5 - 5% сироп на основе экстракта зверобоя пятнистого без стабилизатора; 6 - 5% сироп на основе экстракта зверобоя пятнистого со стабилизатором; 7 -РСО рутина; 8 - РСО гиперозида; 9 - РСО кверцетина; 10 - РСО бисапигенина.
В результате многократного анализа методом ТСХ существенных отличий между сиропом без стабилизатора и сиропом со стабилизатором не наблюдалось.
Определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин 10,0 г сиропа (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл. Добавляется 10 мл ацетона (ЧДА), перемешивают (стеклянной палочкой), экстрагирют при постоянном перемешивании в течение 15 минут. Верхний ацетоновый слой декантируют пипеткой в колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют 3-4 раза. Полученный экстракт фильтруют через бумажный складчатый фильтр красного цвета. Экстракт упаривают досуха на водяной бане. К сухому остатку добавляют 10 мл спирта этилового 95%, нагревают до растворения осадка. Раствор количественно переливают в мерную колбу вместимостью 50 мл, остужают и доводят спиртом до метки. 1 мл раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем спиртом этиловым колбы до метки (раствор сравнения Б).
Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина).
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в препарате в пересчете на рутин в процентах (X) вычисляют по формуле: 5,0 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки спиртом этиловым 95%. Полученный раствор фильтруют через складчатый фильтр. Полученый раствор анализируют методом УФ-спектроскопии. Расчет содержания суммы антраценпроизводных в препарате в пересчете на гиперицин ведется по формуле: D x25 Все полученные партии препарата были проанализированы с помощью разработанных методик. Результаты количественного определения полученных и исследуемых образцов представлены в таблице 9 и 10.
Из результатов количественного определения следует, что сироп зверобоя как на основе сахара, так и на основе сорбита не требует стабилизации.
Определены числовые показатели содержания основных действующих веществ препарата «Зверобоя сироп» (сумма флавоноидов в пересчете на рутин не менее 0,020%, сумма антраценпроизводных в пересчете на гиперицин не менее 0,0015%)
С использованием разработанной методик проанализирован ряд образцов сиропа зверобоя в 11 повторностях и на этой основе приводятся метрологические характеристики (таблица 11-14). Таблица 11 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в препарате «Зверобоя сироп» с концентрацией
1-й день 300,0 г измельченной травы зверобоя пятнистого (зверобоя продырявленного) до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, распределяют по 100,0 г в три экстрактора. В 1-й экстрактор заливают двухкратное количество 70% этилового спирта (200 мл) для смачивания сырья и оставляют на 3 часа. В 1-й экстрактор заливают 1 объем экстрагента (100 мл) для экстракции сырья в течение 24 часов.
Через 24 ч (2-й день) Во 2-й экстрактор помещают двухкратное количество экстрагента (смачивание сырья), оставляют на 3 часа. Из 1-го экстрактора переливают 100 мл извлечения во 2-ой экстрактор и оставляют на 24 ч при комнатной температуре. В данную мацерационную паузу в 1-й экстрактор заливают 100 мл свежего экстрагента и оставляют до начала 3-го дня.
Через 24 ч (3-й день) В 3-й экстрактор помещают 200 мл 70 % этилового спирта для замачивания и оставляют на 3 ч. Из 2-го экстрактора переливают 100 мл извлечения в 3-й экстрактор и оставляют на 24 ч для экстракции при комнатной температуре. Из 1-го экстрактора переливают 100 мл извлечения во 2-ой экстрактор и оставляют на 24 ч для экстракции при комнатной температуре. В данную мацерационную паузу в 1-й экстрактор заливают 100 мл свежего экстрагента и осуществляют термическую экстракцию в 1-ом экстракторе с обратным холодильником в течение 30 мин.
Через 24 ч (4-й день) осуществляют слив извлечения из 3-го экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Из 2-го экстрактора переливают 100 мл извлечения в 3-й экстрактор и оставляют на 24 ч для экстракции при комнатной температуре. Извлечение из приемника 1 переливают во 2-й экстрактор и осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником в течение 30 мин. 100 мл полученного извлечения переливают в приемник 2 и используют на последующих стадиях для термической экстракции сырья в 3-ем экстракторе.
Через 24 ч (5-й день) осуществляют слив извлечения из 3-го экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Извлечение из приемника 2 переливают в 3-й экстрактор и осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником в течение 30 мин и сливают в со
Затем жидкий экстракт упаривали под вакуумом и сушили с добавлением лактозы. Из полученного экстракта была сформирована таблеточная масса, состав которой представлен в таблице 16.суд с готовой продукцией. Через 24 часа (6-й день) осуществляют слив извлечения из 3-го экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). При этом получают в общей сложности 300 мл готового продукта. Затем жидкий экстракт упаривали под вакуумом и сушили с добавлением лактозы. Из полученного экстракта была сформирована таблеточная масса, состав которой представлен в таблице 16.
Методика качественного анализа препарата «Зверобоя сироп"
20 таблеток измельчают в ступке. Из полученной массы берут около 0,5 г (точная навеска), помещают в мерную колбу на 50 мл, заливают 30 мл 95% этилового спирта и растворяют при нагревании на водяной бане (раствор А). Затем раствор охлаждают и доводят 95% спиртом до метки. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой. 1 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл прибавляют и прибавляли 1 мл 3% раствора алюминия хлорида (испытуемый раствор Б). Параллельно готовят раствор сравнения: для этого 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл доводят этиловым спиртом до метки (раствор сравнения Б).
Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенных в мерную колбу на 25 мл и доведенный 95 % спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина). Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в препарате в пересчете на рутин в процентах (X) вычисляют по формуле:
Для анализа антраценпроизводных в качестве испытуемого раствора использовали раствор сравнения А, полученный в методике количественного определения флавоноидов. Раствором сравнения служил 70% этиловый спирт. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 591 нм.
Содержание суммы антраценпроизводных в препарате в пересчете на гиперицин в процентах (X) вычисляют по формуле: Определены числовые показатели содержания основных действующих веществ препарата «Зверобоя таблетки» (сумма флавоноидов в пересчете на рутин от 0,012 г до 0,017 г, сумма антраценпроизводных в пересчете на гиперицин от 0,0011 г до 0,0015 г).
Определение фармакологической активности препаратов фармакопейных видов зверобоя С целью обоснования целесообразности создания антидепрессантных лекарственных препаратов на основе травы зверобоя пятнистого и зверобоя продырявленного изучена антидепрессантная активность исследуемых образцов с использованием теста «Отчаяние» и анксиолитическая активность с использованием теста «Приподнятый крестообразный лабиринт». Изучению подвергали спирто-водные извлечения на основе 70% спирта обоих растений.
Так, из результатов, полученных в тесте «Отчаяние», следует, что время движения в группе животных, получаемых препарат зверобоя пятнистого, в два раза превышает таковой показатель в группе животных, получающих препарат зверобоя продырявленного. Из полученных данных следует вывод, что антидепрессантная активность препарата зверобоя пятнистого в два раза выше чем у препарата зверобоя продырявленного (табл. 20). Этот факт, на наш взгляд, связан с содержанием флавоноида гиперозида, принимая во внимание то обстоятельство, что ранее для данного вещества определена антидепрессантная активность.
Из результатов теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» следует, что препараты обоих видов зверобоя обладают анксиолитической активностью (табл. 21). Нами также была исследована анксиолитическая активность гиперицина, выделенного из травы зверобоя пятнистого. По результатам теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» впервые обнаружено наличие анксиолитической активности для гиперицина (табл. 22). Причем, данный эффект впервые выявлен для гиперицина, выделенного из сырья зверобоя российского происхождения. 100 зверобоя Препарат Л а гсіп Ш.ІІІ период, секунды Пребывание воткрытыхрукавах,секунды Пребываниев закрытыхрукавах,секунды Пребываниенацентральнойплощадке,секунды Число заходов в открытыерукана Число заходов в закры і ыерукава
Параллельно с изучением спектра нейротропной активности была исследована диуретическая активность препаратов зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого. В результате исследований обнаружено наличие диуретической активности для препаратов зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого, характерной в равной степени для препаратов обоих видов (табл. 24). Таблица 24 - Результаты исследования диуретической активности
Проведены исследования по определению класса токсичности препаратов зверобоя. В качестве исследуемого препарата использовали сухой экстракт зверобоя продырявленного. В результате опыта все животные выжили. Каких либо изменений в их поведении не наблюдалось. Нарушение работы ЖКТ, выпадение шерсти и прочих проявлений не выявлено. По результатам опыта следует относить препараты зверобоя к IV классу токсичности - малоопасные.
