Введение к работе
Прогресс в детской онкологии связан в первую очередь с развитием химиотерапии. )спехи которой определили новые возможности лечения гемобластозов у детей. Химиотерапия превратилась из вида вспомогательной помощи в метод лечения, в большинстве случаев определяющий исход заболевания. Путь к улучшению результатов лечения лежит в интенсификации химиотерапии, «по увеличивает риск, связанный с её проведением. Это потребовало создания комплекса мер, направленных на профилактику и лечение осложнений, возникающих в процессе проведения химиотерапии, что является не менее важной и не менее сложной задачей, чем лечение рака (Л.А. Дурное, 2002,2004). Следовательно, искусство проведения высокодозной химиотерапии (ВДХТ), в первую очередь, связано не с формальным соблюдением режима введения питостагиков в организм больного, а нрофилак такой и лечением острых и отсроченных осложнений химиотерапии.
Метогрексат (Mtx) является одним из самых эффективных циюстатических препаратов, относящихся к антиметаболитам фолиевой кислоты. Как лекарственное средство он известен с 1948 года (А.Альберт,1989). В России для использования в онкологической практике зарегистрировано десять его торговых марок. Выбор наиболее качественного из них. безусловно, является актуальной и важной задачей, ранение которой позволит сделать более безопасным и эффективным проведение ВДХТ. Проведение химико-фзрмацевшческого анализа Mtx, а лакже разработка экспресс-метода для его количественного определения в лекарственной форме (ЛФ) непосредственно перед началом лечения позволит полностью исключить введение'больным недоброкачественного препарата.
Mtx конкурентно ингибирует дигидрофолатредуктиу, превращающую фолиевую кислоту в тєтрагидрофолат, в результате чего косвенно тормозится синтез нуклеиновых кислот и клеточное деление в S-фазе клеточного цикла (J.Holland et aJ., 1997; FLBast et a!., 2000) В связи со способностью Mtx проникать через гистогематические барьеры использование высоких и сверхвысоких лоз (1,0-12,0 г-'м) этого препарата является ключевым фактором, позволяющим добиться излечения детей» страдающих гемобластозами. Однако наряду с высокой противоопухолевой активностью Mtx проявляет серьезные побочные -эффекты, главными из которых являются нейро-. нефро-,гепатотоксичность,миелодепрессия, поражения ЖКТ (И.Копосов, 2002). Фармакокинетп-ка Mtx гаклее является принципиальным аспектом в развитии системной Mix токсичности и «.вязанной с ней смертностью. Именно потгому ВДХТ Mtx представляет собой именно тот случай, когда необходим тщательный терапевтический лекарственный мониторинг (ГЛМ) препарата и биохимических показателей токсичности в крови. Нейрогоксичносгь может быть дозолимши-рующим фактором, ограничивающим возможности противоопухолевого лечения Mtx. Известно, что в основе механизма иейротоксичности лежат различные поражения структур нервной ткани.
вызывающие нейрональную и аксональную десгруктуризацию и демислииизацшо. Разработка
методологических подходов к диагностике и мониторингу нейротоксичности Mtx на основе комплекса биохимических методов исследования является одной из важных задач. Следует отме-' тить, что в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению биохимических маркеров нейротоксичности - N -ацетилнейраминовой (N-AHK) и ванилминдальной кислот (ВМК) в крови больных гемобластозами детей. В этом аспекте очевидна актуальность проведенного комплексного исследования.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является разработка современных методов количественного определения метотрексата в инъекционных лекарственных формах различных фирм-производителей и сыворотке крови больных детей, страдающих гемобластозами, а также изучение его токсичности при новых высокодозных режимах применения.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать метод количественного определения Mtx и его основного метаболита (7-ОН-Mtx) в сыворотке крови больных при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Установить возможность применения флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа (ФПИА) для проведения количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ и разработать новый экспресс-метод его количественного определения.
Провести сравнительную оценку качества лекарственных препаратов Mtx, применяемых в детской онкологии.
Провести сравнительную оценку методов количественного определения Mtx в сыворотке крови и выбрать наиболее оптимальный для проведения ТЛМ Mtx.
Изучить взаимосвязь между нарушением элиминации Mtx и его метаболизмом у детей, страдающих гемобластозами.
У детей, страдающих гемобластозами, изучить динамику изменения биохимических показателей: нейротоксичности - N-AHK и ВМК; общей токсичности - молекулы средних масс (МСМ); продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА); антиоксидантного статуса - ретинол, токоферол и каталаза.
С помощью корреляционного анализа у детей, страдающих гемобластозами, изучить взаимосвязь биохимических показателей с ЭЭГ исследованиями и данными мониторинга Mtx.
Научная новизна исследования
Впервые разработан экспресс-метод количественного определения Mtx в инъекционных ЛФ с помощью ФПИА.
Впервые разработан метод количественного определения Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови больных с помощью ВЭЖХ.
Впервые изучен вклад Mtx в развитие нейротоксичности и общей токсичности у детей с гемо-бластозами. Выявлены биохимические маркеры: N-AHK, ВМК, МДА, каталазы, МСМ, позволяющие проводить оценку побочных действий при химиотерапии до их клинического проявления.
Впервые с помощью корреляционного анализа обнаружены взаимосвязи между метаболическими изменениями (показателями нейротоксичности, общей токсичности и СПОЛ), значением Mtx в сыворотке крови и ЭЭГ-данными удетей, страдающих гемобластозами. Научно-практическая значимость исследования
Разработанный экспресс-метод количественного определения Mtx в ЛФ с использованием флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа позволяет в короткие сроки (20 минут) провести количественное определение, что исключает применение недоброкачественного препарата.
ВЭЖХ метод количественного определения соотношения концентраций Mtx и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке крови рекомендован для оценки и коррекции токсических проявлений метотрексата.
Разработанные методики биохимической диагностики общей токсичности и нейротоксичности
предлагаются для выявления и корректирования побочных действий при химиотерапии Mtx. ',
Внедрение в практику Экспресс-метод количественного определения Mtx в ЛФ методом ФПИА применяется в ГУ РОНЦим. Н.Н. БлохинаРАМН.
Методика определения метотрексата и его основного метаболита 7-OH-Mtx в сыворотке! крови с помощью ВЭЖХ используется в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
По результатам выполненных работ составлены отчеты в РФФИ (грант РФФИ № 01-04-49828; № 00-15-97909 и НШ-1110.2003.01), подготовлены к изданию методические рекомендации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены: на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г.); Н-ом и Ш-ем Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва 2003,2004 гг.); на Ш Съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Беларусь, Минск, 2004 г.); на XII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2004 г.).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. мшпинописного текстаи состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего источников. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.
