Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. При менение в медицине, токсичность и методы анализа сложных лекарственных смесей, содержащих пропифеназон, парацетамол, кофеин и кодеин
1.1. Фармакодинамика и фармакокинетика пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина
1.2. Токсичность, противопоказания к применению и побочное действие препаратов «Каффетин» и «Саридон»
1.3. Методы анализа пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина в лекарственных препаратах
1.3.1. Обнаружение пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина в лекарственных препаратах
1.3.2. Количественное определение пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина в лекарственных препаратах
1.3.2.1. Титриметрические методы 23
1.3.2.2. УФ - спектрофотометрия 24
1.3.2.3. Хроматографические методы 28
1.4. Методы изолирования, обнаружения и определения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина в биологических жидкостях
1.4.1. Способы очистки и выделения из биологических объектов пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина
1.4.2. Анализ извлечений из биологических объектов на пропифеназон, з парацетамол, кофеин и кодеин экспериментальная часть
Глава 2. Разработка способов обнаружения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата в препаратах «каффетин» и «саридон»
2.1. Исследуемые вещества, их свойства 38
2.2. Идентификация пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата методом ТСХ
2.2.1. Выбор сорбента 3 8
2.2.2. Выбор подвижной фазы
2.2.2.1. Изучение хроматографической подвижности пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата в индивидуальных растворителях
2.2.2.2. Изучение хроматографической подвижности исследуемых веществ в двухкомпонентных подвижных фазах
2.2.2.3. Изучение хроматографической подвижности исследуемых веществ в трехкомпонентных подвижных фазах
2.2.2.4. Изучение хроматографической подвижности исследуемых веществ в четырехкомпонентных подвижных фазах
2.2.2.5. Выбор способа детектирования исследуемых веществ на пластинке и определение чувствительности методики
2.3. Идентификация пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата в таблетках «Каффетин» и «Саридон» методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.3.1. Выбор состава подвижной фазы, скорости расхода элюента и объема вводимой пробы
2.3.2. Обнаружение компонентов препарата «Саридон» с помощью ВЭЖХ 65
2.3.3. Обнаружение компонентов препарата «Каффетин» с помощью 65
ВЭЖХ
2.3.3.1. Методика обнаружения пропифеназона, парацетамола и кофеина в таблетках «Каффетин»
2.3.3.2 Методика обнаружения кодеина фосфата в таблетках «Каффетин» 66
Выводы 67
ГЛАВА 3. Разработка способов количественного определения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата в препаратах «каффетин» и «саридон»
3.1. Оптимизация условий спектрофотометрического анализа лекар- 69
ственных препаратов «Саридон» и «Каффетин»
3.1.1. Выбор оптимальных условий количественного спектрофотомет- 69 рического определения лекарственных форм
3.1.2. Выбор аналитических длин волн (АДВ) для анализа 74
3.1.3. Использование метода наименьших квадратов для спектрофото метрического анализа компонентов таблеток «Саридон»
3.1.4. Применение упрощённого метода расчётов при анализе 84
многокомпонентной лекарственной формы таблетки «Каффетин»
3.2. Разработка методики определения кодеина фосфата методом экстракционной фотометрии
3.2.1. Определение кодеина фосфата в препарате «Каффетин» с помощью экстракционной фотометрии
3.3. Разработка методики определения компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон» методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Выводы 109
ГЛАВА 4. Разработка условий экстракции пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина из водных растворов
4.1. Изучение оптимальных условий экстракции парацетамола из водных растворов
4.2. Изучение оптимальных условий экстракции пропифеназона из водных растворов
4.3. Изучение степени экстракции кофеина и кодеина в условиях, оптимальных для пропифеназона и парацетамола
4.4. Расчет основных констант, характеризующих процесс экстракции исследуемых соединений
Выводы 125
ГЛАВА 5. Изолирование, обнаружение и определение в моче пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина
5.1. Общая характеристика исследуемого объекта 126
5.2. Обоснование выбора необходимого объема мочи для проведения анализа
5.3. Подготовка мочи к экстракции пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина 129
5.4. Экстракция из мочи пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина
5.5. Выбор системы растворителей для анализа извлечений из мочи с помощью ТСХ на изучаемые вещества 5.5.1. Определение границ обнаружения исследуемых веществ 135 с помощью ТСХ в моче
5.5.2. Определение специфичности обнаружения компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон» с помощью ТСХ
5.6. Разработка способов очистки экстрактов из мочи 138
5.6.1. Использование сорбционной микроколоночной хроматографии
5.7. Методика обнаружения и определения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина с помощью ВЭЖХ в извлечениях из мочи
5.7.1. Анализ извлечений из мочи, содержащей пропифеназон, 144
парацетамол и кофеин
5.7.2. Обнаружение и определение кодеина с помощью ВЭЖХ в извлечениях из мочи
5.7.3. Обнаружение и определение с помощью ВЭЖХ кофеина в извлечениях хлороформом из мочи при рН=10
5.8. Определение пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина с использованием фотометрических методов в извлечениях из мочи
5.8.1. Определение пропифеназона, парацетамола, кофеина с помощью 149 УФ - спектрофотометрии в извлечениях из мочи
5.8.2. Определение кодеина с помощью экстракционной фотометрии в извлечениях из мочи
Выводы 154
Основные выводы 156
Литература
- Методы анализа пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина в лекарственных препаратах
- Идентификация пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата методом ТСХ
- Изучение оптимальных условий экстракции пропифеназона из водных растворов
- Методика обнаружения и определения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина с помощью ВЭЖХ в извлечениях из мочи
Введение к работе
з
Актуальность темы. В современной фармакотерапии все больше используются многокомпонентные лекарственные формы. Создание таких средств оправдано с точки зрения фармакологии, так как действие многих лекарственных веществ на организм человека дополняет друг друга. В настоящее время наиболее типичные сочетания включают, как правило, парацетамол, из анальгетиков - анальгин (метамизол) и сравнительно новое вещество - пропифеназон. Усиление фармакологического действия сложных лекарственных средств одновременно приводит к повышению их токсичности. Это связано с целым рядом явлений. С одной стороны следует отметить одновременное воздействие входящих в препарат компонентов на одни и те же органы человека (сердце, печень,почки, легкие и др.), с другой - возможное изменение пути метаболизма под действием веществ друг на друга. Немалую роль в росте числа отравлений комбинированными препаратами играет широко распространенная в настоящее время рекламная компания в средствах массовой информации, приводящая к бесконтрольному использованию лекарственных веществ и самолечению. По отчетам наркологических диспансеров, токсикологических центров и химию - токсикологических лабораторий острые отравления комбинированными лекарственными веществами составляют от 16,5% до 33,4% .
Наибольшую информацию о причине отравления можно получить при исследовании мочи на токсические вещества и их метаболиты. Однако, анализ многокомпонентных смесей и биологических объектов на них представляет определенные трудности, так как совместное присутствие нескольких веществ, их метаболитов и эндогенных соединений в анализируемой пробе требует большой предварительной подготовки. Поэтому изыскание новых, совершенствование и унификация существующих методов анализа многокомпонентных лекарственных смесей является актуальной проблемой.
В качестве объектов исследования были выбраны препараты «Каффетин», содержащий пропифеназона - 0,21 г, парацетамола - 0,25 г, кофеина - 0,05 г, кодеина фосфата сеск-вигидрата 0,01 г и «Саридон», содержащий пропифеназона - 0,15 г, парацетамола - 0,25 г и кофеина 0,05 г.
Цели и задачи исследования:
- разработать методику разделения и обнаружения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата с помощью ТСХ и ВЭЖХ;
обосновать возможность и выбрать оптимальные условия использования модифицированного метода Фирордта, ВЭЖХ и фотометрии для количественного определения веществ, входящих в препараты «Каффетин» и «Саридон»;
изучить оптимальные условия экстракции исследуемых веществ из водных растворов органическими растворителями в зависимости от различных факторов;
обосновать и предложить способы очистки экстрактов из мочи от эндогенных примесей;
изучить возможность использования при анализе извлечений из мочи на исследуемые вещества методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрии и экстракционной фотометрии;
предложить схему и методологический подход к анализу биологической жидкости - мочи на компоненты таблеток «Каффетин» и «Саридон».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственный фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01990011495) и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 47 РАМН.
Научная новизна работы. Разработана методика разделения с помощью ТСХ и предложена схема детектирования пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата, входящих в состав таблеток «Каффетин» и «Саридон». Разработаны условия разделения и обнаружения изучаемых препаратов с помощью ВЭЖХ на отечественном хроматографе «Милихром - 4». Впервые изучены оптимальные условия экстракции из водных растворов органическими растворителями пропифеназона и парацетамола и определена возможность извлечения в выбранных условиях кофеина и кодеина. Предложены методы количественного определения парацетамола, пропифеназона, кофеина и кодеина в лекарственных формах и биологической жидкости - моче с использованием УФ - спектрофото-метрии (модифицированный метод Фирордта), ВЭЖХ, экстракционной фотометрии. Научно обоснована и разработана методика изолирования из мочи компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон». Предложен способ очистки извлечений с помощью сорбционной хроматографии на полисорбе - 1. Разработана схема обнаружения в извлечениях из мочи парацетамола, пропифеназона, кофеина и кодеина с помощью ТСХ, ВЭЖХ, УФ - спектро-фотометрии, экстракционной фотометрии.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Разработанные методики анализа лекарственных препаратов «Каффетин» и «Саридон» рекомендованы для использования в центрах контроля качества лекарственных средств и лабораториях по сертификации лекарственных препаратов, в химико-токсикологических и криминалистических лабораториях с целью определения их подлинности и диагностики отравлений.
Составлены методические рекомендации «Обнаружение и определение пропифена-зона, парацетамола, кофеина и кодеина в таблетках «Каффетин» и апробированы на фармацевтическом заводе ОАО «АЙ СИ ЭН Лексредства» ЦЛК. Методики анализа включены в проект информационного письма «Обнаружение и определение компонентов таблеток «Каффетин» в моче», апробированы и внедрены в практику работы Областного наркологического диспансера г. Ростов - на - Дону, Краевого клинического наркологического центра г. Ставрополь, Республиканского наркологического диспансера и Бюро судебно - медицинской экспертизы г. Владикавказ, в учебный процесс на занятиях интернов - аналитиков, на цикле общего усовершенствования врачей - лаборантов и элективных курсах для студентов на кафедре токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической академии.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 54
- 57 региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пяти
горск, 1999-2002 гг.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ. Основные положения выносимые на защиту.
методики обнаружения и количественного определения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата в лекарственных формах «Каффетин» и «Саридон»;
методики пробоподготовки, изолирования и очистки извлечений из мочи при анализе на компоненты таблеток «Каффетин» и «Саридон»;
методики обнаружения и количественного определения в извлечениях из мочи пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина;
схема и общий методологический подход к анализу мочи на сложные лекарственные препараты «Каффетин» и «Саридон».
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов и списка
6 литературы, включающего 138 источников, 56 из них на иностранных языках и приложений. Материалы диссертации изложены на 173 страницах печатного текста, содержат 58 таблиц, 17 рисунков.
Методы анализа пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина в лекарственных препаратах
Пропифеназон выделяют из таблетки спиртом, после выпаривания которого добавляют раствор нитрата серебра - получают фиолетовое окрашивание переходящее в серовато-коричневый осадок.
В таблетках «Саридон» по НД 42-7087-97 [27] для определения подлинности активных веществ предлагается метод ВЭЖХ: сорбент - октадецилсилил на силикагеле, длина колонки 12,5см, диаметр 4мм, изготовитель Merck Lichro-spher С 18. Обнаружение проводят по времени удерживания при длине волны 273нм. Рекомендуется также проводить обнаружение, используя ТСХ на силикагеле 60 F254 пластинки фирмы Merck 0,25мм. В качестве подвижных фаз рекомендованы циклогексан - ацетон (40:50) и ацетон - хлороформ - муравьиная кислота (60:60:2). Детекция - УФ-свет. В этих условиях после обработки пластинки фенольным реактивом при нагревание возможно обнаружить примесь п-аминофенола по голубой окраске пятна.
Для обнаружения анальгетиков - антипиретиков комбинированного состава используют различные виды хроматографии (в тонком слое сорбента, высокоэффективную жидкостную и газожидкостную).
Шаршунова М. и Шварц В. [28] изучали хроматографическую подвижность в 10 различных растворителях на незакрепленных слоях оксида алюминия соединений, оказывающих жаропонижающее и болеутоляющее действие, а именно: ацетилсалициловой кислоты, амидопирина, антипирина, кодеина, хинина, папаверина и фенацетина.
Эммерсон и Андерсон [28] применяли слои силикагеля в комбинации с нейтральными растворителями, помещая в хроматографическую камеру стаканчик с 28% - ным раствором аммиака. По мнению авторов, в этих условиях анальгетики можно разделять как в виде свободных оснований, так и в виде солей. Наилучшие результаты получены при использовании в качестве подвижной фазы бензола или дихлорметана.
Раймерс проводил разделение смеси антипирина и кофеина на слоях силикагеля в 93% - ном этаноле. Некоторые смеси анальгетиков подвергали разделению на пленках с силикагелем. Печенников, Книжник и Сенов разделяли пуриновые и пиразолоновые производные на незакрепленных слоях окиси алюминия [29].
Перспективным для обнаружения сложных лекарственных форм является метод ВЭЖХ, так как объединяет в одном эксперименте разделение и анализ.
Для лекарственных препаратов близкой химической природы предложен ряд методик контроля их качества, основанных также на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии [30,31,32].
С целью контроля качества пропифеназона Тулагановым А.А. с соавторами предложена методика, основанная на высокоэффективной жидкостной хроматографии [33,34]. В качестве подвижной фазы использована смесь воды с метанолом в соотношении 40:60. Разработанные условия позволяют идентифицировать примеси (1-фенил-3-метил-4-изопропилиденпиразолон-5; 4-изопропилфенил - метилпиразолон-5 и антипирин) в пропифеназоне.
Показана возможность определения сложных лекарственных препаратов, содержащих пропифеназон и кетопрофен [35]. В качестве подвижной фазы используют смесь МеОН-МеСЫ-НгО в соотношении (10:20:30), а в качестве внутреннего стандарта - фенобарбитал.
В таблетках «Каффетин» проводят определение каждого компонента в отдельной навеске препарата (НД 42-1749-98) [26].
Для определения парацетамола предлагают УФ - спектрофотометрию в 0,1 моль/л растворе гидроксида натрия при длине волны 257 нм.
Пропифеназон определяют титриметрически - навеску растертых таблеток растворяют в диоксане и титруют хлорной кислотой. В качестве индикатора используют кристаллический фиолетовый, приготовленный с добавлением уксусного ангидрида в ледяной уксусной кислоте. Наблюдают переход окраски от фиолетовой к синей. Определение кофеина проводят методом йодиметрии: отдельную навеску порошка растертых таблеток растворяют в воде, добавляют тетрайодмеркуриат калия (II), серную кислоту, раствор йода и титруют тиосульфатом натрия в присутствии индикатора - крахмала. Определение проводят параллельно со стандартным раствором смеси компонентов таблеток.
Сочетанием УФ-спектрофотометрии с тонкослойной хроматографией определяют кодеин фосфат сесквигидрат. Для этого отдельную навеску растертых таблеток растворяют в мерной колбе в небольшом объеме теплой воды, объем до метки доводят этанолом. Отбирают аликвоту и наносят на пластинку с тонким слоем силикагеля. Пластинку пропускают в системе растворителей хлороформ - этанол (80:20) и после высушивания детектируют в УФ - свете при длине волны 254 нм. Параллельно проводят хроматографирование стандартного раствора кодеина фосфата сесквигидрата. Обнаруженные пятна соскабливают и элюируют раствором кислоты хлористоводородной. В полученном элюате определяют степень поглощения при длине волны 285 нм.
В качестве основного метода для количественного определения в таблетках «Каффетин» пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата рекомендована тонкослойная хроматография высокого давления с детектором CamaG TLC Scanner II, интегратором CamaG Lab Data System, неподвижной фазой: пластинки силикагеля 60 F254, толщиной слоя 250шп и размером 20x20см (Тип. Merck № 5715) и подвижной фазой хлороформ - этанол (80:20).
Количественное определение действующих веществ в препарате «Сари-дон» по НД 42-7087-97 [27] рекомендовано проводить с помощью ВЭЖХ в условиях описанных ранее (стр. 20). Расчет содержания парацетамола, пропифеназона и кофеина проводят по площади пиков на хроматограмме.
Поскольку, в доступной литературе нами не найдены дополнительные разработки по методам обнаружения и количественного определения компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон» в смеси, мы изучали данные по ана 23 лизу индивидуальных препаратов и их сочетаний с другими лекарственными веществами.
В работах [36,37] показано, что кофеин в присутствии кислоты ацетилсалициловой можно титровать хлорной кислотой, используя в качестве растворителя хлороформ, уксусный ангидрид, бензол. Растворителем для парацетамола является безводный ацетон, а титрантом - гидроксид калия в изопропиловом спирте. Эквивалентную точку устанавливают потенциометрическим методом в электрохимической ячейке со стеклянным электродом сравнения и сурьмяным индикаторным электродом [38].
Кодеин фосфат в лекарственных препаратах титруют в среде безводной уксусной кислоты 0,1 моль/л раствором хлорной кислоты [39,40].
Из-за высокой токсичности применяемых растворителей метод неводного титрования используют редко.
Наряду с методами титрования в неводных растворителях для кофеина, кодеина и парацетамола предложено использовать титрование в водных средах.
Описано цериметрическое титрование кофеина и парацетамола. Точку эквивалентности устанавливают йодиметрически [38,41].
Способность парацетамола подвергаться кислотному гидролизу с образованием - п-аминофенола позволила использовать нитритометрию. Эквивалентную точку устанавливают потенциометрически или с помощью йодкрахмаль-ной бумаги, которая синеет от выделившегося йода [42,43]. Известен способ определения точки конца титрования в присутствии смешанного индикатора, содержащего 0,1% раствор тропеолина 00 и 0,15%-ный раствор метиленового синего.
Идентификация пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина фосфата методом ТСХ
Идентификацию парацетамола, пропифеназона и кофеина, входящих в состав таблеток «Саридон» проводили по следующей методике: 20 таблеток растирали в ступке в мелкий однородный порошок, отвешивали около 0,01 г (точная навеска) порошка растертых таблеток, помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл ацетонитрила и тщательно перемешивали и доводили до метки тем же растворителем, фильтровали. Фильтрат вводили в колонку хроматографа в объеме 3,0 мкл.
Измерение проводили в выбранных условиях, (стр. 64). Параллельно хроматографировали растворы стандартных веществ в ацетонитриле в концентрациях: парацетамола - 0,16 мг/мл, пропифеназона - 0,09 мг/мл и кофеина -0,03 мг/мл, соотношение которых соответствует содержанию в препарате «Саридон». Идентификацию полученных пиков проводили по соответствию времени удержания компонентов препарата и стандартных растворов. Установлено, что для парацетамола время удерживания составило 3,08, для кофеина и пропифеназона 4,0 и 5,73 мин соответственно.
Метод ВЭЖХ имеет ограничения при использовании его в анализе сложных смесей, содержащих макро- и микроколичества веществ. При этом возникает перегруз колонки, что оказывает влияние на качество разделения и форму выходящих пиков. В таблетках «Каффетин» содержание кодеина фосфата по отношению к парацетамолу и пропифеназону в 21-25 раз меньше (стр. 13). Поэтому при таком соотношении компонентов разделить смесь полностью практически невозможно. В этом случае нами был использован экстракционный способ для отделения кодеина от компонентов, содержащихся в препарате «Каффетин» в макроколичествах, (пропифеназона и парацетамола). Предвари 66 тельно было установлено, что парацетамол, пропифеназон и кофеин экстрагируются этилацетатом из водных растворов с рН 2, при этом кодеин полностью остается в водном растворе. Для выделения кодеина рекомендовано использовать хлороформные извлечения из раствора с рН 9-Ю. (гл. 4., раздел 4.3., стр. 123).
Методика обнаружения парацетамола, пропифеназона и кофеина в таблетках «Каффетин» 20 таблеток растирали в ступке в мелкий порошок, отвешивали около 0,01 г (точная навеска) и далее поступали по методике предложенной для идентификации компонентов таблеток «Саридон» (стр. 65).
Параллельно хроматографировали растворы стандартных веществ в аце-тонитриле в концентрациях: парацетамола - 0,16 мг/мл, пропифеназона - 0,13 мг/мл и кофеина - 0,03 мг/мл, соотношение которых соответствует содержанию в препарате «Каффетин». Измерение проводили в выбранных условиях.
Методика обнаружения кодеина в таблетках «Каффетин» Около 0,2 г растертых таблеток (точная навеска) растворяли в 20 мл воды, перемешивали, фильтровали. Фильтр промывали 10 мл воды очищенной. Фильтрат подкисляли 10% раствором серной кислоты до значения рН = 2. Экстракцию проводили этилацетатом трижды, порциями по 10 мл. Полученные экстракты отбрасывали. К водному раствору добавляли 25% раствор аммиака до значения рН 9-10. Экстрагировали трижды хлороформом порциями по 10мл. Объединенные хлороформные вытяжки помещали в фарфоровые чашки и испаряли при комнатной температуре. Сухие остатки растворяли в ацетонитриле, переносили в мерные колбы объемом 25 мл и доводили до метки тем же растворителем. 3 мкл полученного раствора вводили в колонку хроматографа. Параллельно хроматографировали стандартный раствор кодеина в концентрации 0,09 мг/мл. Измерение проводили в выбранных условиях. Использованная жидкость - жидкостная экстракция, позволила повысить концентрацию кодеина в анализируемом растворе, полностью отделить парацетамол, пропифеназон и большую часть кофеина от кодеина. За счет оставшейся в растворе небольшой части кофеина возникает «перегруз», который осложняет анализ и кодеин обнаруживается на «хвосте» его пика. Использование систем с диэтиламином позволило снизить «перегруз» и разделить экстрагированные кофеин и кодеин (рис.7).
По полученным результатам рассчитаны времена удерживания парацетамола, пропифеназона, кофеина и кодеина, которые соответственно равны 3,08, 5,73, 4,0 и 4,67 мин. ВЫВОДЫ:
1. Изучена возможность разделения с помощью ТСХ компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон» в индивидуальных растворителях, двух-, трех-, и четырехкомпонентных системах растворителей. Рекомендовано для контроля качества препаратов использовать системы: диоксан -хлороформ - ацетон - 25% аммиак (50:45:3:2) или толуол - ацетон -этанол - 25% аммиак (45:45:7,5:2,5).
2. Предложена схема обнаружения с помощью ТСХ парацетамола, про-пифеназона, кофеина и кодеина, которая включает определенную последовательность использования реагентов-проявителей: облучение хроматографической пластинки УФ - лучами без светофильтра в течение 15 минут, просматривание ее в УФ - свете при длине волны 254нм, обработку парами йода и проявление 0,05% - ным раствором родамина С. Определена чувствительность каждого реагента по отношению к изучаемым веществам.
3. Разработаны условия разделения компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон» с помощью ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил - вода -диэтиламин (60:40:4), масштаб регистрации 2,0, время измерения 0,8сек, скорость расхода элюента - 50 мкл/мин, объем вводимой пробы Змкл, детекция при 238 и 276 нм. Время удерживания составило для парацетамола 3,08 мин, пропифеназона 5,73 мин, кофеина 4,0 мин и кодеина 4,67 мин.
4. Предложена методика обнаружения компонентов таблеток «Каффетин» и «Саридон» с помощью ВЭЖХ. Чувствительность методики для пропифеназона 0,03 мкг, парацетамола и кофеина по 0,02 мкг каждого, кодеина 0,20 мкг в вводимой пробе.
Изучение оптимальных условий экстракции пропифеназона из водных растворов
Так как методом спектрофотометрии нам не удалось рассчитать содержание кодеина фосфата в таблетках «Каффетин», мы попытались определить его методом экстракционной фотометрии.
Фотометрический метод анализа применяется в различных отраслях науки и техники. Особенно широко он используется в фармацевтическом и химико-токсикологическом анализах для количественного определения многих лекарственных веществ и отличается высокой чувствительностью, избирательностью, простотой, надёжностью. Исследуемое вещество переводят в окрашенное соединение и измеряют светопоглощение полученного раствора. Среди фотометрических методов большое распространение получил его экстракционно-фотометрический вариант. Он основан на образовании ионного ассоциата между кислотным красителем и веществом основного характера. Этот метод предложен для многих алкалоидов: тебаина, наркотина, атропина, кодеина [133] и ДР 95 3.2.1. Определение кодеина фосфата в препарате «Каффетин» с помощью экстракционной фотометрии Для анализа была выбрана известная методика, основанная на образовании ионного ассоциата между кодеином и тропеолином 00 [133].
Предварительно было установлено, что в условиях проведения реакции парацетамол, пропифеназон, кофеин и фосфаты не образуют окрашенных соединений с тропеолином 00. С целью изучения возможности использования экстракционной фотометрии для определения кодеина фосфата были проанализированы модельные смеси, соответствующие по составу препарату «Каффетин».
Методика определения. Около 0,08 г (точная навеска) парацетамола, около 0,07 г (точная навеска) пропифеназона, около 0,016 г (точная навеска) кофеина и около 0,003 г (точная навеска) кодеина фосфата вносили в делительную воронку, прибавляли 10 мл ацетатной буферной смеси (рН 4,6), 5 мл ОД % - ного водного раствора тропеолина 00 и 5 мл хлороформа. Содержимое делительной воронки взбалтывали в течение 5 мин. Через 3 мин от водной фазы отделяли хлороформную вытяжку. Взбалтывание водного слоя с новыми порциями хлороформа (по 5 мл) проводили до тех пор, пока . 1-4 капли последней хлороформной вытяжки перестанут давать окраску с 1-2 кдплями кислоты серной в спирте этиловом. Объединённые вытяжки доводили хлороформом до 50 мл. 5мл полученного хлороформного раствора смешивали с 20 мл хлороформа, 2,5 мл 1% раствора кислоты серной концентрированной в спирте этиловом и измеряли оптическую плотность окрашенного в фиолетово-красный цвет раствора (?Чпах=550 нм) с помощью фотоколориметра КФК-2 (светофильтр зелёный, кювета 10 мм). Раствором сравнения служило хлороформное извлечение из смеси, состоящей из 5 мл 0,1% водного раствора тропеолина 00, 9 мл ацетатного буферного раствора (рН 4,6) и 1 мл воды. К полученной хлороформной вытяжке прибавляли 2,5 мл 1% раствора кислоты серной концентрированной в спирте этиловом. Расчёт проводили по заранее построенному калибровочному графику.
Поскольку фосфаты не реагируют с тропеолином 00, зависимость оптической плотности от концентрации препарата изучали, используя кодеин основание. Для построения калибровочного графика готовили 0,2% раствор кодеина. Затем отбирали 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1 мл полученного раствора кодеина в 6 делительных воронок, доводили объём до 1 мл водой очищенной, добавляли по 9 мл ацетатной буферной смеси (рН 4,6), 5 мл 0,1% раствора тропеолина 00 и далее вели анализ как описано выше. Затем строили графическую зависимость оптической плотности от концентрации кодеина (рис. 11). График зависимости оптической плотности от концентрации кодеина
Полученные данные (табл. 24) свидетельствуют, что на анализ оказывают влияние компоненты таблеток «Каффетин», поэтому определяемый % кодеина составляет 86,10±3,03%. Чтобы исключить это влияние, нами использован экстракционный способ отделения кодеина в виде основания от остальных компонентов таблеток «Каффетин» по методике разработанной нами ранее.
Результаты количественного определения кодеина в модельной смеси экстракционно-фотометрическим методом Оптическая плотность Взято на анализ, мг Найдено кодеина (основания) П ПР К кодеин (основание) мг % Метрологические характеристики 0,440 80,35 70,65 16,05 1,95 1,65 84,62 Х= 86,10% S= 30,8537 S. = 1,0141XАх= 2,6063 єа = ± 3,03% 0,460 80,25 70,15 16,25 2,00 1,70 85,00 0,440 80,55 70,35 15,90 1,90 1,65 86,84 0,400 80,30 70,15 16,25 1,80 1,50 83,33 0,520 80,45 70,05 16,15 2,10 1,90 90,48 0,438 80,10 70,45 16,00 1,90 1,64 86,32 Методика определения. Точные навески парацетамола, пропифеназона, кофеина и кодеина фосфата соответственно около 0,08 г, 0,07 г, 0,016 г и 0,003 г переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 20 мл универсальной буферной смеси с рН 2. Затем доводили объём раствора до метки тем же растворителем и перемешивали. Содержимое колбы переносили в делительную воронку и экстрагировали этилацетатом трижды порциями по 15 мл, 15 мл и 20 мл. Экстракты отбрасывали, к водному раствору прибавляли раствор 25% аммиака до рН 9 и экстрагировали хлороформом по 15 мл, 15 мл и 20 мл.
К хлороформным экстрактам, упаренным до объёма 5 мл, добавляли 10мл ацетатной буферной смеси (рН 4,6), 5 мл 0,1% водного раствора тропеолина 00 и смесь взбалтывали в делительной воронке в течение 5 мин. Отделяли хлороформный слой, добавляли 5 мл хлороформа и вновь экстрагировали. Повторную экстракцию проводили до тех пор, пока 3-4 капли последней хлороформной вытяжки переставали давать окраску с 1-2 каплями серной кислоты в этиловом спирте. Общий объём хлороформных извлечений доводили до 50 мл хлороформом. Далее поступали как описано ранее (стр. 95). Расчёт содержания кодеина вели по калибровочному графику. Полученные результаты представлены в табл. 25.
Результаты количественного определения кодеина фосфата в модельной смеси после отделения его в виде основания экстракционным способом № Оптическая плотность Взято на анализ, мг Найдено кодеина П ПР К кодеин мг % Метрологические характеристики 1. 0,590 82,50 70,60 15,55 2,25 2,09 92,89 Х= 92,76% 5= 44,5440 5..= 1,2185XАх= 3,1315 „ = ±3,38% 2. 0,545 80,95 70,15 16,00 2,15 1,94 90,23 3. 0,560 81,05 72,20 16,30 2,30 2,09 90,87 4. 0,600 83,95 76,30 15,95 2,25 2,19 97,33 5. 0,545 83,60 72,20 16,20 2,10 1,89 90,00 6. 0,625 86,35 72,50 16,25 2,30 2,19 95,22 Поскольку было установлено, что оставшийся в извлечении кофеин не даёт окрашенного ассоциата с тропеолином 00, нами сделан вывод, что в таком варианте методика может быть рекомендована для определения кодеина в таблетках «Каффетин». Ошибка определения составляет ± 3,38%.
С этой целью мы проверили методику на четырёх сериях таблеток «Каффетин». Для анализа помещали около 0,2 г (точная навеска) лекарственной формы в мерную колбу вместимостью 50 мл и далее поступали как при анализе модельных смесей (стр. 97-98). Полученные результаты представлены в табл.
Методика обнаружения и определения пропифеназона, парацетамола, кофеина и кодеина с помощью ВЭЖХ в извлечениях из мочи
Преданалитическая обработка мочи обычно включает: - разрушение связи исследуемых веществ и их метаболитов с глюкуроновой и серной кислотами путем гидролиза; - хроматографическое разделение или сорбция на твердом сорбенте изучаемых соединений; - экстракцию органическим растворителем; - концентрирование путем упаривания мочи Поскольку парацетамол, пропифеназон, кофеин и кодеин в моче находятся в виде водорастворимых коньюгатов с глюкуроновой и серной кислотами и в процессе пробоподготовки их нужно разрушить, мы проверили как будут вести себя в процессе гидролиза сами исследуемые вещества.
Методика гидролиза: в отдельные герметично закрывающиеся колбы помещали 250 мг парацетамола, 210 мг пропифеназона, 50 мг кофеина, 10 мг кодеина фосфата, добавляли 10 мл 20% кислоты хлористоводородной и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Гидролизат охлаждали. Раствор парацетамола при этом приобрел слабо-фиолетовую окраску, остальные растворы остались бесцветными. Растворы переносили в делительные воронки и экстрагировали продукты гидролиза парацетамола, пропифеназона, кофеина равным объемом этилацетата из раствора с рН=2, а кодеина хлороформом из раствора с рН = 10. Органическую фазу отделяли и в количестве 0,2 мл наносили на хроматографические пластинки «Сорбфил» в виде пятен. Одновременно наносили «свидетели»-растворы негидролизованных веществ. На пластинку при анализе гидролизата парацетамола наносили два свидетеля - негидролизо-ванный парацетамол и п-аминофенол. Пластинку помещали в камеру с системой растворителей толуол-ацетон-этанол-25% аммиак (45:45:7,5:2,5), предложенную нами ранее (стр. 50).
Для обнаружения исследуемых веществ пластинки просматривали в УФ-свете (А,=254 нм). Детекцию п-аминофенола проводили, используя фенольный реактив [27]. Нами установлено, что пропифеназон, кофеин и кодеин на пластинках обнаруживаются в виде одного пятна и по значению Rf соответствуют нанесенным «свидетелям». В экстракте гидролизованного парацетамола на хроматограмме обнаружены 2 пятна: парацетамола и следы п-аминофенола, которые совпали по значению Rf с пятнами обоих "свидетелей". Для подтверждения гидролиза парацетамола до п-аминофенола экстракт из гидролизата парацетамола и "свидетели" наносили на пластинки "Сорбфил" и исследовали дополнительно в 2-х системах растворителей: этилацетат-этанол-25% аммиак (17:2:1) и этилацетат.
После высушивания пластинки обрабатывали по предложенной схеме детектирования (стр. 53). В обоих случаях нами обнаружены также по 2 пятна: парацетамола (Rf 0,4 и 0,57 соответственно) и п-аминофенола (Rf 0,88 и 0,84 соответственно). Таким образом, при солянокислом гидролизе препараты пропифеназон, кофеин и кодеин не разрушаются, а парацетамол частично образует п-аминофенол.
Как было нами показано ранее, для максимального извлечения исследуемых веществ из водных растворов (гл. 4, раздел 4.4. стр. 123) необходимо про — — 13i водить экстракцию парацетамола, пропифеназона и кофеина из растворов с рН=2 этилацетатом, а кодеина - хлороформом при значении рН=10 трехкратно в течение 5 минут в присутствии электролита (хлорида натрия или сульфата аммония) добавленного до насыщения. Основываясь на этом, первоначально методика изолирования из мочи компонентов таблеток «Каффетин» и «Сари-дон» сводилась к следующему: к 50 мл мочи, не содержащей исследуемых веществ (контрольные опыты) и к 50 мл мочи, содержащей исследуемые вещества (состав модельных смесей представлен в табл. 46) добавляли по 10 мл 20% кислоты хлористоводородной, смесь нагревали на кипящей водяной бане 30 минут. Затем, после охлаждения, добавляли сульфат аммония до насыщения,
Состав модельных смесей исследуемых таблеток с мочой Модельная смесь «Каффетин» Модельная смесь «Саридон» парацетамола 0,08 г парацетамола 0,08 г пропифеназона 0,07 г пропифеназона 0,05 г кофеина 0,016 г кофеина 0,016 г кодеина 0,002 г снижали значение рН до 2 и экстрагировали этилацетатом 3 раза порциями по 20мл. К водному раствору добавляли 25% аммиак до рН=10 и раствор трижды экстрагировали хлороформом порциями по 20мл. Извлечение этилацетатом из мочи с рН=2 представляло собой стойкую эмульсию, окрашенную в желтый цвет. Для отделения воды и разрушения эмульсии растворы центрифугировали в течение 15 минут при 3 тысячах оборотах в минуту. Извлечение хлороформом из раствора с рН=10 было бесцветное, образовавшаяся небольшая эмульсия белого цвета легко расслаивалась при стоянии. Экстракты из мочи (этилацетат-ные и хлороформные) отделяли от водной фазы с помощью делительной воронки и доводили до объема 50 мл в мерной колбе тем же растворителем.
Поскольку в полученных в процессе экстракции извлечениях наряду с исследуемыми веществами будут содержаться примеси эндогенных соединений, мы проверили как они ведут себя в испытанных нами ранее системах растворителей. С этой целью 1/10 часть полученного извлечения из мочи этилацетатом при значении рН=2 упаривали почти досуха в фарфоровой чашке и наносили в виде точек на хроматографические пластинки «Сорбфил», после подсушивания помещали в камеры с изучаемыми ранее системами растворителей (гл.2.,стр.49). Для обнаружения места расположения эндогенных соединений на пластинках использовали просматривание в Уф- лучах (X = 254 нм). Нами установлено, что подвижные фазы, в состав которых входят этилацетат, этилацетат с этанолом, хлороформ с этанолом, не пригодны для анализа извлечений из биологических объектов, так как в этих системах эндогенные примеси не отделяются от исследуемых соединений и образуют сплошное пятно на пластинке от линии старта почти до линии финиша и обнаруживаются в виде темных полос в УФ-лучах (Аг= 254 нм).
