Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1. Фармакогностическое описание. Химический состав черёмухи обыкновенной (Padus avium Mill.) 11
1.2. Методы анализа и перспективы использования в стандартизации плодов черёмухи обыкновенной растительных масел и различных групп биологически активных веществ гидрофобной природы 16
1.3. Методы идентификации и количественного определения действующих веществ гидрофильной природы в плодах черёмухи обыкновенной 24
1.4. Факторы влияющие на процесс экстракции 29
Глава 2 Материалы и методы 38
2.1. Материалы исследования 38
2.1.1. Изучаемые объекты 38
2.1.2. Вспомогательные материалы 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Подготовка плодов черёмухи обыкновенной к исследованию 39
2.2.2. Методы, применяемые для разработки характеристик подлинности и показателей качества 40
2.2.3. Методы применяемые для стандартизации липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной
2.2.3.1. Экстракция липидного комплекса плодов черёмухи 40
2.2.3.2. Определение физико-химических показателей качества липидного комплекса плодов черёмухи 41
2.2.3.3. Определение состава жирных кислот 43
2.2.3.4. Идентификация и количественное определение токоферолов.. 44
2.2.3.5. Разделение и количественное определение фосфолипидов 45
2.2.3.6. Идентификация и количественное определение каротиноидов 47
2.2.4. Методы применяемые для стандартизации водно-спиртового извлечения 49
2.2.4.1. Получение водно-спиртовых извлечений 49
2.2.4.2. Идентификация и количественное определение флавоноидов 50
2.2.4.3. Определение антиоксидантного потенциала
2.2.5. Оптимизация и моделирование процесса экстрагирования с использованием ультразвука математико-статисти-ческими методами 50
2.2.6. Методы математической и статистической обработки экспериментальных данных 52
Глава 3 Фармакогностическое изучение и разработка показателей качества измельчённых плодов черёмухи обыкновенной 53
3.1. Макроскопический анализ 54
3.1.1. Определение влажности з
3.1.2. Определение содержания золы общей и нерастворимой в 10% соляной кислоте 55
3.1.3. Изучение термических характеристик исследуемого сырья, а также показателей влагосодержания и золы общей методом дериватографии 56
3.2. Микроскопическое изучение измелчённых плодов черёмухи обыкновенной 61
3.3. Определение содержания липидного комплекса 67
Глава 4 Разработка и определение показателей качества липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной 73
4.1. Определение физико-химических характеристик липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной 73
4.2. Определение состава жирных кислот липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной 80
4.3. Идентификация и количественное определение каротиноидов 82
4.4. Идентификация и количественная оценка токоферолов 85
4.5. Качественный и количественный анализ фосфолипидов 89
Глава 5 Разработка и определение показателей качества водно спиртовой фракции плодов черёмухи обыкновенной 92
5.1. Ориентировочная фотохимическая оценка плодов черёмухи обыкновенной на присутствие основных классов биологически активных веществ 92
5.2. Хроматографическое определение фенольных соединений в тонком слое сорбента 95
5.3. Изучение фенольного комплекса плодов черёмухи обыкновенной методом ВЭЖХ
5.3. Подбор условий и разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной 101
5.4. Отработка условий фотометрической реакции комплексо-образования суммы флавоноидов плодов черёмухи обыкновенной со спиртовым раствором АІСІз 103
5.5. Определения антиоксидантной активности водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной ПО
Глава 6 Совершенствование процесса экстракции суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной
6.1. Изучение влияния ультразвука на выход, суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной 114
6.1.1. Влияние ультразвука на стабильность флавоноидов
6.1.2. Разработка математической модели процесса ультразвуковой экстракции из плодов черёмухи обыкновенной П6
6.1.3. Оптимизация процесса экстракции плодов черёмухи обыкновенной с использованием ультразвука 121
Общие выводы 127
Список литературы
- Методы идентификации и количественного определения действующих веществ гидрофильной природы в плодах черёмухи обыкновенной
- Методы применяемые для стандартизации липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной
- Определение содержания золы общей и нерастворимой в 10% соляной кислоте
- Изучение фенольного комплекса плодов черёмухи обыкновенной методом ВЭЖХ
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время происходит расширения фармацевтического рынка за счёт использования лекарственного растительного сырья в различных потребительских формах в том числе и измельчённого. Наряду с поиском новых лекарственных растений, проводится углублённое изучение сырья, издавна применяемого в медицине. Эти исследования направлены, прежде всего, на определение структуры биологически активных веществ и разработку объективных методик стандартизации растительного сырья. Предложения по использованию новых растений в фармацевтической и пищевой промышленности часто связаны с трудностями по обеспечению сырьевой базы. Проблема сертификации требует совершенствования методик стандартизации, т.к. на многие виды лекарственного растительного сырья отсутствуют необходимые разделы "Качественные реакции" и "Количественное определение" не только на измельчённое, но и на цельное сырьё. В связи с этим остро встаёт проблема совершенствования методов стандартизации и контроля качества измельчённого лекарственного растительного сырья и необходимость в пересмотре существующей нормативной документации.
Плоды черёмухи обыкновенной давно известны как ценное пищевое и лекарственное средство. Наличие огромной сырьевой базы на территории РФ ставит черёмуху в ряд самых перспективных объектов для изучения. Несмотря на это, сырьё черёмухи практически не изучалось с конца 50-х годов, хотя постоянно повышающиеся требования к качеству растительного сырья показывают необходимость количественной оценки содержания основных действующих веществ, а использование современных методов анализа позволяет проводить её с максимальной точностью и надёжностью.
Цели и задачи исследования
Целью диссертационной работы явилось изучение фармакогностических и физико-химических характеристик плодов черёмухи обыкновенной с целью обоснования методов контроля и показателей качества нормируемых при стандартизации.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Провести фармакогностический анализ измельчённых плодов черёмухи обыкновенной, как перспективного источника липидного комплекса с целью расширения ассортимента промышленного масличного сырья, богатого ненасыщенными жирными кислотами, токоферолами, каротиноидами, фосфолипидами, что позволит рассматривать его в качестве источника получения этих веществ и создании на их основе лекарственных препаратов
Определить оптимальные условия экстрагирования, позволяющие добиться максимального выхода липидного комплекса из плодов черёмухи обыкновенной
и провести сравнительный анализ физико-химических характеристик и числовых показателей липидных комплексов из плодов черёмухи обыкновенной, полученных с использованием различных экстрагентов.
Определить в липидных комплексах, полученных с использованием различных экстрагентов, наличие и количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) с известной фармакологической активностью (жирных кислот, токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов).
На основании полученных данных обосновать необходимые показатели и методы их стандартизации для исходного сырья (плоды черёмухи) и продуктов его переработки (липидный комплекс).
Провести качественный анализ водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи
обыкновенной на наличие основных групп БАВ обладающих антиоксидантной
активностью и определить их количественное содержание.
Провести оценку антиоксидантного потенциала водно-спиртового извлечения.
Исследовать возможность использования ультразвука для совершенствования
процесса экстракции водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной.
Научная новизна
Проведено микроскопическое исследование и определены основные диагностические признаки порошка плодов черёмухи обыкновенной, разработаны показатели качества плодов.
На основании результатов оценки масличности по методам Сокслета, Фолча и Блая предложен показатель количественного содержания липидного комплекса. Разработаны оптимальные условия получения липидного комплекса с использованием различных условий экстрагирования и различных экстрагентов.
Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной и проведена его количественная оценка.
Проведен сравнительный анализ физико-химических характеристик и числовых показателей липидных комплексов полученных различными методами экстрагирования, а также идентификация и количественное определение токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов.
Разработаны оптимальные условия экстрагирования водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной, проведён его качественный анализ и определено значение антиоксидантной активности. На базе полученных данных разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной методом дифференциальной спектрофотометрии.
Проведена оценка влияния ультразвука на качественный и количественный выход БАВ из плодов черёмухи обыкновенной с последующей разработкой
математической модели процесса ультразвукового экстрагирования суммы флавоноидов из исследуемого сырья.
На основании данных исследования качественного и количественного состава водно-спиртовой фракции плодов черёмухи обыкновенной рекомендовано включение водно-спиртового экстракта из данного сырья в комплексное профилактическое средство применяемое в стоматологической практике при заболеваниях пародонта принятое на рассмотрение ВНИИГПЭ (заявка на изобретение №110.390 от 07.04.04)
Связь выполненной работы с проблемным планом фармацевтических наук и производства.
Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ММА им. И.М. Сеченова «Разработка и совершенствование технологии подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием» (шифр, 16 утвержденный МЗ РФ); в соответствии с комплексной темой кафедры общей химии стоматологического факультета ММА им. И.М. Сеченова: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.200.118796).
Практическая значимость
Разработан опытно-промышленный регламент на производство липидного комплекса черёмухи обыкновенной, утверждённый АО «Фармхим», г. Воронеж, (6 октября 2004 г.).
Разработаны показатели качества порошка плодов черёмухи обыкновенной включённые в проект ТУ для использования в качестве сырьевого источника при производстве эликсира зубного.
Результаты исследований внедрены в процесс контроля качества измельчённых плодов черёмухи в производстве фирмы «Фито-ЭМ» (10.10.2004)
Проведено внедрение способа «Получение водно-спиртового экстракта плодов черёмухи обыкновенной с использование ультразвука» в ГУЗ г.Москвы «Центр сертификации и контроля качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (15.12.2004)
Методы идентификации и количественного определения действующих веществ гидрофильной природы в плодах черёмухи обыкновенной
В 1998 году были получены и переданы в Госсортоиспытание 12 сортообразцов черемухи. Десять из них - гибриды P. virginiana х P. avium Fi и F2, и два - сорта черемухи кистевой, используемые в качестве сортов -опылителей. [68]
В плодах разных видов черемухи содержится (%): сухих веществ 23-27, Сахаров (глюкозы, сахарозы) 8,7-11,3, пектиновых веществ до 0,22, кислот (яблочная и лимонная) до 2,3, дубильных и красящих веществ до 2; витамина С в плодах мало - до 4 мг%, катехинов до ПО, оксикоричных кислот до 95, антацианидинов до 1420 мг%. [18, 26]
В плодах обнаружены соединения: железа до 0,2 мг %, марганца до 1, цинка до 0,3, меди до 0,1, кобальта до 10, магния до 0,9 мг %. Свежие плоды выделяют фитанциды, которые губительно действуют на плесневые грибы и отпугивают мух, слепней и других насекомых. [62]
Наиболее широко в плодах рода черёмуха представлены фенольные соединения. Из них обнаружены и идентифицированы флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества. [71, 110, 114]
Флавоноиды обнаружены в плодах черёмухи Маака и черёмухи пенсильванской. Среди флавоноидных соединений наиболее часто встречается рутин. Он содержится во всех перечисленных растениях, его содержание составляет от 0,05 до 2,3%. [165]
Наряду с рутинном, из плодов черёмухи Маака выделен комплекс веществ антоциановой природы. [169] Фенолкарбоновые кислоты черёмухи пенсильванской представлены: кофейной, салициловой, феруловой кислотами. [110, 156] — Другим, не менее важным классом биологически активных соединений, содержащихся в плодах черёмухи являются тритерпеновые соединения. Во всех видах черёмухи содержится эфирное масло. Данные химического анализа показывают, что содержание эфирного масла колеблется от 0,002 до 0,04%. [23, 62,67,116]
При изучении плодов черёмухи виргинской исследователи идентифицировали ряд витаминов. Присутствие аскорбиновой кислоты отмечали ряд учёных. [62, 68]
Кроме аскорбиновой кислоты плоды черёмухи содержат каротиноиды. Наличие каротиноидов в плодах черёмухи Маака установлено только качественно. Каротиноидныи комплекс представлен лютеином, каротином и их производными. [51]
Среди других классов природных соединений в плодах черёмухи обыкновенной найдены органические кислоты, жирное масло. [23, 67, 117]
В листьях, цветках, коре, косточках и мякоти плодов содержатся различные гликозиды. Например, аромат цветков обусловлен гликозидом пруназином, а в плодах содержится гликозид амигдалин, стимулирующий сердечную деятельность. Расщепляясь, он образует среди прочих веществ и синильную кислоту, однако, ее в плодах не больше, чем у вишни. [114, 115]
Для лекарственных целей в сухую погоду утром после росы или в конце дня собирают зрелые, черные плоды, складывая их в ведра или корзины; затем очищают от примеси и листьев, веточек и плодоножек и сушат в духовках или русских печах при t не выше 40-50С. Можно сушить в хорошую погоду на солнце, периодически помешивая, на сетках или подстилках из ткани, бумаги, слоем до 2 см. После сушки плоды перетирают и просеивают через сито, отделяя от плодоножек. Цвет сухих плодов черный, матовый, складки иногда покрыты беловато-серым или красноватым налетом выкристаллизовавшегося сахара. Запах сырья слабый, свойственный плодам черемухи, вкус сладковатый, слегка вяжущий. Влажность плодов должна быть не более 14 %. [160]
Черемуха обыкновенная Padus avium Mill, является перспективной лекарственно-технической культурой при производстве БАВ. Плоды этого растения очень питательны и благодаря наличию полифенолов обладают целебными свойствами. Издавна их собирают и используют как в свежем, так и в сушеном виде. В настоящее время они употребляются в виде муки для выпечки разнообразных кондитерских изделий, а целые плоды - при изготовлении вин и ликеров. Характерной особенностью черемухи обыкновенной является наличие бензальдегида и бензойной кислоты, обладающих ароматическими и консервирующими свойствами. Бензальдегид, присутствующий во всех частях черемухи обыкновенной, в настоящее время применяется в пищевой промышленности как отдушка. Введение бензальдегида в рецептуру пищевых продуктов и напитков осуществляется как в виде чистого препарата, так и в составе горько-миндального масла и экстрактов, что позволяет придать насыщенный миндальный вкус и аромат готовому продукту. Однако, древесная зелень черемухи обыкновенной вследствие малой изученности ее химического состава и отсутствия технологии переработки до сих пор не находит широкого применения. [122]
Почти все части растения обладают бактерицидными, фунгицидными и инсектицидными свойствами. В народной медицине черемуху издавна используют как вяжущее, закрепляющее, противовоспалительное и противоцинготное средство. Фитонцидная активность растения настолько высокая, что его летучие вещества убивают не только микробов, но и насекомых. [113]
Наличие в плодах дубильных веществ и эфирного масла оказывает противовоспалительное действие, которое используют для лечения воспалительных процессов в желудочно-кишечном тракте и дизентерии. [109]
Настой плодов черёмухи оказывает губительное действие на микроогранизмы. Препараты плодов черёмухи обыкновенной оказывают антисептическое действие. Применяются в стоматологической практике при лечении воспалительных процессов слизистой полости рта, при парадонтозе, зубной боли и гиповитаминозе С. [69]
Методы применяемые для стандартизации липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной
Стандартизация плодов черёмухи проводилась согласно статьям ГФ XI «Плоды», а также учитывали требования к исходному сырью (плоды черёмухи обыкновенной), регламентируемые статьей № 36 ГФ XI.
Определение подлинности, измельчённости, содержание примесей проводили согласно указаниям соответствующих статей ГФ XI. При микроскопическом исследовании и разработке диагностических признаков плодов черёмухи анализировали объект, учитывая требования, предъявляемые к технике микроскопического исследования порошков плодов.
Для получения липидных комплексов плодов черемухи в лабораторных условиях были выбраны 4 экстрагента: хлороформ, смесь хлороформ:метанол (1:1), петролейный эфир, гексан. Экстракцию осуществляли многократной обработкой сырья растворителем в аппарате Сокслета при нагревании. Для разработки оптимальных условий экстракции были изучены зависимости выхода липидного комплекса плодов черёмухи от используемого экстрагента, измельчённости сырья и времени экстракции.
Измельченные плоды помещали в предварительно взвешенные до постоянной массы, обезжиренные патроны из фильтровальной бумаги. Определяли точную массу каждой навески. Патроны с навесками помещали в рабочую часть аппарата Сокслета, заливали 250 мл экстрагента и проводили экстракцию. Затем патроны вынимали, высушивали до постоянной массы и определяли выход липидного комплекса в-% в пересчете на абсолютно сухое сырье по формуле: М2-М3 100 Х% = х 100, (M2-M1) (100-W) где: Mi - масса бумажного патрона, г.; Мг- масса патрона с сырьем до обезжиривания, г. М3- масса патрона с обезжиренным сырьем, г.; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Определение физико-химических показателей качества липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной Определение запаха, цвета, прозрачности липидного комплекса. Определение запаха, цвета и прозрачности проводили по ГОСТ 5472-50 [35] при температуре 20С. Определение числа омыления. Определение числа омыления проводили по ГФ XI и ГОСТ 5478-90 [40]. Определение кислотного числа. Определение кислотного числа проводили по ГФ XI и ГОСТ 50457-92 [39] титриметрическим методом с потенциометрической индикацией. За результат испытания принимали среднее арифметическое двух параллельных определений. Определение эфирного числа. Эфирное число, свидетельствующее о количестве жирных кислот, входящих в состав сложных эфиров, определяли по разнице между числом омыления и кислотным числом. Определение йодного числа. Определение йодного числа проводили по ГОСТ 5475-69 [38] Определение плотности липидного комплекса плодов черемухи. Определение плотности проводили с помощью пикнометра.
Метод применяют в случае определения плотности жидкостей с точностью до 0,001. Чистый сухой пикнометр взвешивали с точностью до 0,0002 г, заполняли с помощью маленькой воронки дистиллированной водой немного выше метки, закрывали пробкой и выдерживали в течение 20 мин в термостате, в котором поддерживали постоянную температуру воды 20С с точностью до 0,1 С. При этой температуре уровень воды в пикнометре доводили до метки, быстро отбирая излишек воды при помощи пипетки или фильтровальной бумаги. Пикнометр снова закрывали пробкой и выдерживали в термостате еще 10 мин, проверяя положение мениска по отношению к метке. Затем пикнометр вынимали из термостата, фильтровальной бумагой вытирали внутреннюю поверхность горлышка пикнометра, а также весь пикнометр снаружи, оставляли под стеклом аналитических весов в течение 10 мин и взвешивали с той же точностью.
Пикнометр освобождали от воды, высушивали, споласкивали последовательно спиртом и эфиром, удаляли остатки эфира продуванием воздуха, заполняли пикнометр испытуемой жидкостью и затем производят те же операции, что и с дистиллированной водой. Плотность р2о (г/см ) вычисляют по формуле: (т2 - т) 0,99703 р2о= +0,0012, (т, - т) где т - масса пустого пикнометра в граммах; nil - масса пикнометра с дистиллированной водой в граммах; ліг - масса пикнометра с испытуемой жидкостью в граммах; 0,99703 - значение плотности воды при 20С (в г/см с учетом плотности воздуха); 0,0012 - плотность воздуха при 20С и барометрическом давлении 760 мм рт. ст. Определение показателя преломления.
Определение показателя преломления производили с помощью рефрактометров различных систем, согласно Государственной Фармакопеи СССР XI издания (выпуск 1, с.29). [34], обеспечивающих точность измерения до 0,0005, при температуре 20С и длине волны линии D спектра натрия (589,3 нм). На каждый градус температуры выше или ниже 20С вносили поправку для масла + 0,00035, для воды + 0,00007.
Определение содержания золы общей и нерастворимой в 10% соляной кислоте
Около 5 г (точная навеска) плодов анализируемых плодов помещали, равномерно распределяя, в предварительно прокаленный фарфоровый тигель. Затем тигель осторожно нагревали, давая сначала веществу сгореть при возможно более низкой температуре. После почти полного сгорания угля пламя увеличивали и вели прокаливание при температуре около 500 С до постоянной массы. По окончании прокаливания тигель охлаждали в эксикаторе и взвешивали (разница между двумя последующими взвешиваниями не превышает 0.0005 г).
Содержание золы общей (X %) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по формуле: т, 100 100 m (100-w) , где т — масса золы, в граммах; ті — масса навески сырья, в граммах; w — потеря в массе при высушивании сырья, в процентах. Для определения содержания золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте, к остатку в тигле, полученному после определения золы общей, прибавляли 15 мл 10% НС1, тигель накрывали часовым стеклом и нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут. К содержимому тигля добавляли 5 мл горячей воды, омывая екг часовое" стекла Содержимое" фижтровали через беззольный фильтр. Фильтр с остатком промывали горячей водой до прекращения появления мути в промывных водах от капли 2%-ного раствора нитрата серебра (хлориды), переносили его в тот же тигель, высушивали, сжигали и прокаливали до постоянной массы.
Государственная фармакопея XI издания для определения влагосодержания и общей золы рекомендует высушивание образца до постоянной массы в изотермическом режиме. Однако, из литературных данных известно, что "постоянство" массы, достигаемое при рекомендуемой ГФ XI температуре, не является гарантией конечного удаления сорбционной воды из анализируемого сырья. Это связано с тем, что высушивание лекарственного растительного сырья наряду с испарением гигроскопической влаги, с одной стороны, сопровождается потерей
летучих веществ. Сушка сырья на воздухе может сопровождаться поглощением кислорода с окислением лабильных соединений. То есть, прекращение сушки (достижение постоянной массы при данной температуре) соответствует не полному удалению воды, а лишь установлению определенного равновесия между водяными парами в воздухе и сорбционной водой в лекарственном растительном сырье.
Кроме того, метод изотермической сушки обладает целым рядом недостатков: длительность проведения анализа, подбор индивидуального режима для многих видов лекарственного растительного сырья, учет возможных процессов термической деструкции в образце и т.д. Таким образом, высушивание в изотермическом режиме, как следует из анализа литературных данных, является чисто эмпирическим методом, которым определяется не истинное значение влажности, а величина лишь более или менее близкая к ней.
Решение задачи оптимизации метода анализа доброкачественности лекарственного растительного сырья по такому показателю, как влагосодержание, возможно при неизотермическом варианте определения влагосодержания, с одновременной регистрацией и количественной оценкой процессов, протекающих при постоянном повышении температуры.
Реализация указанных условий возможна при использовании метода дериватографии. Данный метод обладает рядом преимуществ: — протекание физико-химических процессов непрерывно регистрируется (кривая ДТА) и количественно оценивается (кривая TG); — внешние условия (состав атмосферы, скорость повышения температуры, давления газа в камере) можно изменять; — увеличение скорости анализа по сравнению с методом ГФ XI; — высокая информативность метода, позволяющая для одной навески образца определить влагосодержание, общую золу, температуру практически полного удаления влаги, термической деструкции образца и т.д. Исходя из вышеизложенного, нами проведена оценка доброкачественности сырья по показателям влагосодержания и общая зола методом ГФ XI издания и дериватографически. Данные по определению влаги и золы общей в плодах черёмухи обыкновенной Padus Avium Mill, табл. 3.2.
Для получения дериватограмм были подобраны следующие условия: навеска — 100+0,5 мг, скорость нагрева 2,5С/мин, эталон А1203, динамическая атмосфера воздуха, чувствительность потери массы — 0,5%, нагрев до 800С, тигли платиновые тарельчатые. Характерный вид дериватограммы сырья плодов черёмухи представлен на рис.3.1. Удаление влаги, составляющей 6.3%, происходит в интервале температур 55 -70С (эндотермический эффект). С 105 - 125С начинается интенсивная карамелизация, вследствие высокого содержания Сахаров. Для плодов черёмухи обыкновенной характерно образование зольного остатка в низких температурах 170 - 250 С и 300 - 350 С (эффекты экзотермические), составляющего 5.2 %.
Из приведенных данных следует, что оптимальной температурой сушки плодов черёмухи обыкновенной является режим от 80 до 90С, поскольку достигается содержание влаги, соответствующее требованиям ГФ XI.
Таким образом, используемый нами метод дериватографического анализа позволяет не только более достоверно и объективно оценить содержание остаточной влаги и золы в сырье, но и установить термические характеристики. Результаты определения влагосодержания и золы общей в анализируемом сырье, а так же его термические характеристики, представлены в табл. 3.3.
Анализируя данные, приведенные в табл. 3.3., следует подчеркнуть, что результаты, полученные методом дериватографии, отличаются от результатов, полученных по методикам ГФ XI. Вместе с тем, удаление связанной влаги, связанное, как правило, с первыми двумя термоэффектами, наблюдается на дериватограмме при более высоких температурах, чем рекомендованные для определения__официальной методшшй, _что дополнительно доказывалось нами выделением влаги после изотермической сушки растительного сырья до постоянной массы при соответствующих конкретных температурах, найденных методом дериватографии. Термическая деструкция растительного сырья при температурах удаления сорбционно связанной воды не наблюдалась.
Изучение фенольного комплекса плодов черёмухи обыкновенной методом ВЭЖХ
Анализ каротиноидов основан на специфических спектральных свойствах Р-каротина и его изомеров, имеющих максимум поглощения в области от 300 до 500 нм.
С целью идентификации каротиноидного комплекса в исследуемом сырье и получаемых на его основе липидных комплексах нами использовался метод хроматографии в тонком слое.
Сумма каротиноидов качественно определяли на пластинке «Merck», используя метод ТСХ. Системой служила смесь бензол—петролейный эфир— ацетон (20:5:4). Использование этой системы позволяет добиться наилучшего отделения ксантофиллов от каротинов. О наличие каротиноидов судили по желтому окрашиванию пятен при дневном свете, а в УФ (X = 366 нм) по поглощению излучения, в результате чего (3-каротин проявляется в виде коричневых пятен. Для проявления хроматографических зон использовали 10% раствор фосфосфорномолибденовой кислоты в этиловом спирте. При нагревании пластинки при температуре 60-80С проявляются зоны синего — цвета на желто-зеленом фоне. В качестве «свидетеля» использовалир-каротин Общий вид хроматограммы каротиноидов анализируемых липидных комплексов представлен на рис. 4.6. R,«G,39 Тйе-0,2? R,«0,2 Система: Бензол : Петролейный эфир : Ацетон (20:5:4) Детектирующий агент: Спиртовой раствор фосфорно-молибденовой кислоты Сорбент: Пластинка «Merck» с силикагелем марки Kieselgel 6OF254 1 - (3-каротин (50 мкг); 2 - липидный комплекс плодов черёмухи обыкновенной. Разделение веществ каротиноидной природы липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной Количественное определение суммарного содержания каротиноидов.
При изучении содержания каротиноидов мы обратили внимание на тот факт, что концентрацию данной группы БАВ рассчитывают разными методами. В первой методике расчёт концентрации каротиноидов проводят, как отношение "оптической" плотности- испытуемого раствора" к оптическЬй плотности стандартного раствора РСО калия дихромата, учитывая в расчётной формуле колличество р-каротина (мг) в растворе, соответствующем по оптической плотности раствора РСО калия дихромата при длине волны 450 нм. По второй методике расчёт концентрации каротиноидов ведут, исходя из известного значения удельного поглощения (3-каротина.
Результаты количественного определения суммы каротиноидов с использованием «метода добавок» (п=5) Содержаниекаротиноидов(в сумме) влипидномкомплексе,мг/нав ДобавленоР-каротина,мг Должно бытькаротиноидов,мг Найдено мг Ошибка определения
Достоверность и воспроизводимость результатов анализа проверена на образцах липидных комплексов. Метрологические характеристики методики приведены в таблице 4.10.1. Как видно из представленных данных, относительная ошибка определения суммы каротиноидов в пересчёте на (3-каротин в липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной по предлагаемым методикам укладывается в доверительный интервал 95% и не превышает ±4,55%.
Для подтверждения достоверности полученных результатов и отсутствия систематической ошибки был использован метод добавок. Результаты определений представлены в таблице 4.10.2. Методом добавок выявлено отсутствие систематической ошибки. Относительная ошибка единичного определения находится в пределах случайной ошибки разработанной методики и имеет отклонения в сторону, как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Содержание суммы каротиноидов в плодах черёмухи не менее 14 мг% Противовоспалительная активность липидных комплексов многими авторами связывается с наличием в них комплекса витаминов Е. [87] Качественный анализ токоферолов в липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной
Для идентификации токоферолов в липидном комплексе плодов черемухи использовали метод тонкослойной хроматографии предварительно переведя токоферолы в состав неомыляемой фракции по следующей методике: Навеску липидного комплекса (5_ г) помещали в круглодонную колбу объемом 100 мл с обратным холодильником, приливали 50 мл 10% спиртового раствора КОН, добавляли 0,1 грамм аскорбиновой кислоты и проводили омыление на кипящей водяной бане в течение 30-45 минут, считая с момента кипения спирта. По окончании омыления, колбу охлаждали и в нее добавляли 20 мл дистиллированной воды. Раствор количественно переносили в делительную воронку с двойным объемом воды. Неомыленные фракции извлекали диэтиловым эфиром. Для этого в делительную воронку добавляли 50 мл эфира и содержимое воронки осторожно перемешивали. После разделения слоев эфирный слой сливали в колбу с притертой пробкой. Экстракцию проводили еще 3 раза порциями по 50 мл эфира. Эфирные вытяжки собирали в делительной воронке и промывали водой до нейтральной реакции промывных вод по универсальному индикатору.
Экстракт фильтровали через складчатый фильтр. Фильтр промывали тремя порциями диэтилового эфира. Эфир испаряли при температуре не выше 40С.
Полученный таким образом экстракт растворяли в хлороформе и наносили на хроматографическую пластинку "Merck". В качестве "свидетеля" использовали масляный раствор синтетического а-токоферола. Системой растворителей служила смесь гексан - диэтиловый эфир (в соотношении 1:1). Идентификацию токоферолов проводили после проявления реактивом Эммери-Энгеля, состоящего из равных объёмов 0,5% спиртового раствора а,осч-дипиридила и 0,25% спиртового раствора хлорида железа (Ш) -токоферолы окрашивались в розовый цвет (Rf = 0,8) (рис. 4.7.)
