Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Ботаническая характеристика манжетки обыкновенной 8
1.2. Химический состав травы манжетки 12
1.3. Фармакологические свойства и применение травы манжетки 13
1.4. Растительные полифенолы, обладающие противоопухолевой и антиметастатической активностью 15
1.5. Характеристика аминокислот, как биологически активных веществ лекарственного растительного сырья и методы их анализа 18
1.6. Нуклеиновые кислоты, как компоненты суммы БАВ лекарственного растительного сырья 22
1.7. Характеристика элементного состава лекарственного растительного сырья и методы его анализа 33
1.8. Модели опухолей, рекомендованные для проведения доклинических испытаний по отбору средств, обладающих потенциальной противоопухолевой и антиметастатической активностью 36
Заключение 38
Экспериментальная часть 39
Глава 2. Объекты и методы исследования 39
2.1. Характеристика объектов 39
2.2. Методы фитохимического анализа 40
2.2.1. Методика ВЭЖХ-определения фенольных соединений 40
2.2.2. Методика количественного определения полисахаридов в траве и настое манжетки 41
2.2.3. Методика ТСХ продуктов гидролиза полисахаридов травы и настоя манжетки 42
2.2.4. Методика определения аминокислот 43
2.2.5. Методики определения нуклеиновых кислот и их азотистых оснований 45
2.2.6. Методика определения макро- и микроэлементов 47
2.3. Методики определения характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки и норм качества настоя травы манжетки 49
2.4. Методы фармакологических исследований 52
2.4.1. Методика по доклиническому изучению средств, способных ингибировать рецидивирование злокачественных опухолей 52
2.4.2. Методика по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования злокачественных опухолей 55
2.4.3. Методика по доклиническому изучению средств, обладающих противоопухолевой активностью in vivo 57
2.4.4. Методика определения цитотоксической активности in vitro 59
Глава 3. Фотохимическое изучение травы и настоя манжетки 61
3.1. Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 61
3.2. Определение полисахаридов в траве и настое манжетки 65
3.3. Определение аминокислот в траве и настое манжетки 66
3.4. Определение нуклеиновых кислот и их азотистых оснований в настое травы манжетки 71
3.5. Определение макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки. 74
Глава 4. Разработка характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки и норм качества для настоя травы манжетки 77
4.1. Внешние признаки сырья 77
4.2. Микроскопический анализ сырья 79
4.3. Качественный анализ 86
4.4. Определение числовых показателей сырья 87
4.5. Количественное определение суммы флавоноидов в траве манжетки 90
4.6. Валидация методики дифференциальной спектро фотометрии для определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин 91
4.7. Разработка норм качества для настоя травы манжетки 94
Глава 5. Фармакологическое изучение настоя, суммы полифенолов и агримониина травы манжетки 98
5.1. Определение оптимального пути введения настоя травы манжетки 98
5.2. Изучение влияния настоя травы манжетки на развитие экспериментального лимфолейкоза L1210 100
5.3. Изучение антиметастатической и противоопухолевой активности настоя травы манжетки при отсроченном начале лечения 100
5.4. Изучение антиметастатической и противоопухолевой активности настоя травы манжетки при раннем начале лечения 102
5.5. Изучение противоопухолевой и антиметастатической активности настоя травы манжетки на модели опухоли саркома-37 106
5.6. Изучение способности настоя травы манжетки ингибировать рецидивирование злокачественных опухолей 108
5.7. Изучение влияния настоя травы манжетки на общетоксическое действие циклофосфамида 113
5.8. Изучение влияния агримониина и суммы полифенолов на общетоксическое действие циклофосфамида 114
5.9. Изучение цитотоксической активности суммы полифенолов и агримониина 115
Общие выводы 118
Литература 120
Приложение 136
- Характеристика аминокислот, как биологически активных веществ лекарственного растительного сырья и методы их анализа
- Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
- Разработка норм качества для настоя травы манжетки
- Изучение способности настоя травы манжетки ингибировать рецидивирование злокачественных опухолей
Введение к работе
Актуальность темы. Поиск новых растительных источников для получения потенциальных лекарственных средств, расширяющих арсенал фармакотерапии наиболее распространенных заболеваний, включая онкологические, является актуальной задачей для современной фармацевтической и фармакологической науки. Внедрение лекарственных препаратов в клиническую практику невозможно при отсутствии детального изучения их химического состава, безопасности и эффективности на уровне доклинических исследований.
По данным ВОЗ, в последние годы смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после патологии сердечно-сосудистой системы. Доказательной медициной установлено, что растительные препараты являются эффективными, наименее токсичными, а также способны потенцировать и снижать побочные действия химиотерапевтических средств.
Манжетка обыкновенная традиционно применяется как противовоспалительное, кровоостанавливающее, лимфотропное, гипотензивное и гипогликемическое средство.
В последние десятилетия манжетка активно изучается как сердечно-сосудистое средство. Андреева В.Ю. (1998-2001 г.г.) и Зыков А.А. (2000 г.) изучали траву манжетки как лимфотропное, гиполипидемическое и антиишемическое средство.
Ряд исследователей изучали химический состав эндемичных манжеток Сибирского региона. Для них установлено наличие некоторых фенольных соединений (флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот) в спиртовом извлечении (Андреева В.Ю., 2001 г.). Химический состав водных извлечений из травы манжетки не изучался в полном объеме.
В литературе отсутствуют данные о применении манжетки обыкновенной для профилактики и лечения злокачественных новообразований. Вместе с тем в литературе имеются данные о противоопухолевой активности агримониина, выделенного из других растительных источников (Okuda T., 1990).
Таким образом, трава манжетки является перспективным растительным сырьем для применения в научной медицине и, в частности, в онкологии.
Цель и задачи исследования. Провести фитохимическое и фармакологическое изучение травы манжетки.
Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:
-
Провести фитохимическое изучение травы и настоя манжетки по составу фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов;
-
Разработать характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;
-
Разработать нормы качества для настоя травы манжетки;
-
Оценить фармакологическую (противоопухолевую, антиметастатическую и антитоксическую) активность настоя травы манжетки;
-
Оценить фармакологическую (цитотоксическую и антитоксическую) активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки
Научная новизна. Проведено комплексное изучение химического состава нового лекарственного сырья – трава манжетки – в связи с его фармакологической активностью. Качественно и количественно установлено содержание в сырье и настое флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов, аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов. Получены новые данные о содержании азотистых основаниях нуклеиновых кислот (НК) в настое травы манжетки. Впервые для настоя травы манжетки установлен спектр фармакологических эффектов, таких как противоопухолевый, антиметастатический и антитоксический. Получен Патент на изобретение (№ 2403055, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 ноября 2010 г., приоритет изобретения от 23 апреля 2009 г.) «Способ получения средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида». Впервые установлена цитотоксическая и антитоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки. Получены 3 заявки на изобретения: от 14.04.2010 г. (входящий № 020921, регистрационный № 2010114834) - «Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью»; от 14.04.2010 г. (входящий № 020920, регистрационный № 2010114833) - «Способ получения агримониина» и от 14.04.2010 г. (входящий № 020919, регистрационный № 2010114832) - «Средство, снижающее токсичность циклофосфамида».
Практическая значимость.
В свете современных требований проведена валидация методики дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения в траве манжетки суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Получен Акт внедрения результатов валидации методики;
Данные, полученные в результате проведенных исследований вошли в разделы проектов фармакопейной статьи «Herba Alchemillae - трава манжетки» 2009 г. и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки»;
Установлена фармакологическая активность настоя травы манжетки: противоопухолевая, антиметастатическая, цитотоксическая и антитоксическая. Данные защищены публикациями и Патентом на изобретение. Также определена антитоксическая и цитотоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки, защищенные публикациями и заявками на изобретения;
Результаты проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова. Получен Акт внедрения результатов научных достижений.
Положения, выносимые на защиту:
Результаты фитохимического изучения фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов травы и настоя манжетки;
Данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки;
Данные норм качества настоя травы манжетки;
Оценка изучения фармакологической активности настоя травы манжетки;
Данные о фармакологической активности суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.
Публикация материалов исследования и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Материалы диссертационной работы представлены на научно-практических конференциях: 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (январь 2008 г., Пятигорск), конференции с международным участием «Татьянин день» (22-23 января 2009 г., Москва), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва), симпозиуме, посвященном 75-летию академика В.Г. Кукеса, (сентябрь 2009 г., Москва).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры фармакогнозии по теме: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов» (код темы 0407093).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована ___ рисунками и ___ таблицами. Список литературы включает 149 источников, в том числе 35 – на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.
В обзоре литературы (глава 1) обобщены данные за последние годы о современном состоянии исследований химического состава, методов анализа, фармакологической активности лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих полифенолы, проанализированы модели опухолей, рекомендованные для проведения доклинических испытаний по отбору средств, обладающих потенциальной противоопухолевой и антиметастатической активностью.
Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования.
В главе 3 изложены результаты фитохимического изучения травы и настоя манжетки.
В главе 4 приведены данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки, а также данные по разработке норм качества для настоя травы манжетки и валидационные характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки.
Глава 5 посвящена изучению противоопухолевой, антиметастатической, цитотоксической и антитоксической активности настоя, суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.
Приложение включает проекты ФС «Herba Alchemillae – трава манжетки» и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки», Патент на изобретение, уведомления о поступлении и регистрации заявок на изобретения, акт внедрения результатов научных достижений, акт внедрения результатов валидации методики количественного определения, справка о фармакологической активности, а также спектральные и хроматографические характеристики по изучению химического состава травы и настоя манжетки.
Объектами исследований служили:
трава манжетки, собранная в период цветения в Истринском и Раменском районах Московской области в 2007 и 2008 годах. Сырье заготавливали на опушке смешанного хвойно-лиственного леса, на суходольных лугах, на расстоянии более 2 км от населенных пунктов и трасс, в сухую погоду;
настой травы манжетки 1:10 из стандартного сырья, приготовленный по методике Государственной Фармакопеи XI издания;
настой травы манжетки 1:5 из стандартного сырья, приготовленный сгущением настоя 1:10 в 2 раза;
настой травы манжетки 1:50 из стандартного сырья, приготовленный разведением настоя 1:10 в 5 раз;
мыши-самцы линии BDF1;
мыши-самцы линии С57Bl/6;
беспородные мыши-самцы SHY/kv
Для фитохимического исследования использовали настой травы манжетки 1:10.
Для определения фенольных соединений в настое травы манжетки использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе фирмы Perkin Elmer (США).
Полисахариды травы и настоя манжетки количественно определяли методом гравиметрии по методике Государственной Фармакопеи XI издания, вып.2 (частная фармакопейная статья «Herba Bidentis – трава череды»), качественный анализ проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на хроматографических пластинах марки «Сорбифил».
Определение аминокислот в траве и настое манжетки проводили по методике Л.А. Баратовой (1988 г.) на аминокислотном анализаторе, модель 835 фирмы «Хитачи» (Япония).
Для изучения нуклеиновых кислот и нуклеотидов в настое травы манжетки использовали методы ВЭЖХ (жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmer (США)) и ПЦР-РВ (прибор для ПЦР в реальном времени АНК-16/32 (Россия), тест-система «Растение/35S/NOS скрининг»).
Определение макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки проводили на оптическом ИСП-спектрометре «Оптима 3000» атомно-эмиссионным методом МУК 4.1.1482-03.
Разработку характеристик подлинности и показателей качества на траву манжетки по разделам «Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественный анализ» и «Числовые показатели» проводили с использованием общепринятых методик Государственной Фармакопеи XI издания, вып.1. Анализ сырья по разделу «Количественное определение» проводили по проекту ФС «Herba Alchemillae - трава манжетки» 2009 г.
Разработку норм качества настоя травы манжетки по разделам «Определение окраски жидкостей» и «Определение рН» проводили по общепринятым методикам Государственной Фармакопеи XI издания, вып.1.
Определение сухого остатка настоя травы манжетки проводили по методике общей статьи ГФ XI «Настойки».
Для фармакологических исследований использовали линейных и беспородных животных и настои травы манжетки 1:5, 1:10, 1:50, а также агримониин и сумму полифенолов, выделенные из травы манжетки.
Для определения фармакологической активности использовали общепринятые методики «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.).
Характеристика аминокислот, как биологически активных веществ лекарственного растительного сырья и методы их анализа
Наряду с полифенолами, как установлено ещё в прошлом столетии, одной из важнейших групп биологически активных веществ (БАВ) в растительном сырье являются аминокислоты. В связи с этим изучение аминокислотного состава растительного сырья является актуальной задачей.
Аминокислотам принадлежит большая роль в современной фармакологии. Являясь не только структурными элементами белков и других эндогенных соединений, они имеют большое функциональное значение. Некоторые из них выступают в качестве нейромедиаторных веществ (глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глицин, таурин, у-аминомасляная кислота и др.). Производными аминокислот являются энкефалины, эндорфины, динорфины и другие нейропептиды, а также высвобождающие факторы (рилизинг-факторы) гипоталамуса, гормоны гипофиза и т.д. [61].
Некоторые аминокислоты (глутаминовая, у -аминомасляная, метионин, глицин и др.) нашли самостоятельное применение в качестве лекарственных средств. Расширяется круг новых лекарственных препаратов, синтезируемых с использованием остатков аминокислот (Даларгин, Каптоприл, Тимоген и др.).
Глутаминовая кислота играет важную роль в жизнедеятельности организма: участвует в белковом и углеводном обмене, стимулирует окислительные процессы, способствует обезвреживанию и выведению из организма аммиака, повышает устойчивость организма к гипоксии. Она способствует также синтезу ацетилхолина и аденозинтрифосфорной кислоты, переносу ионов калия. Как часть белкового компонента миофибрилл играет важную роль в деятельности скелетной мускулатуры.
В последнее время придается особо важное значение центральной нейромедиаторной роли глутаминовой кислоты. Ее относят к нейромедиаторным аминокислотам, стимулирующим передачу возбуждения в синапсах ЦНС [51].
В медицинской практике глутаминовая кислота находит применение главным образом при лечении заболеваний ЦНС: эпилепсии (преимущественно малых припадков с эквивалентами), психозов (соматогенных, интоксикационных, инволюционных), реактивных состояний, протекающих с явлениями истощения, депрессии, и др.
В педиатрии препарат применяют при задержке психического развития различной этиологии, церебральных параличах, болезни Дауна, полиомиелите, в остром и восстановительном периодах [61].
Глицин относится к заменимым аминокислотам. По современным данным, является центральным неиромедиатором тормозного типа действия. Оказывает седативное действие. Улучшает метаболические процессы в тканях мозга. Оказывает положительное влияние при мышеч ных дистрофиях. Рекомендован для применения как средство, ослаб ляющее влечение к алкоголю, уменьшающее явления абстиненции, депрессивные нарушения, повышенную раздражительность, нормализующее сон, а также при других явлениях у больных хроническим алкоголизмом [51].
Пролин и оксилизин являются основными аминокислотами, содержащимися в белках соединительных тканей (коллаген и эластин). Следовательно, перспективно применение препаратов, содержащих эти аминокислоты при заболеваниях, связанных с повреждением соединительнотканных структур (переломы костей, болезни кожи, сухожилий и мышц, поражение стенок кровеносных и лимфатических сосудов, дегенеративных заболеваниях суставов) [61].
Современные методы количественного анализа аминокислот основаны на ионообменной хроматографии с использованием колонок, заполненных сульфополистирольным катионитом. Этот метод впервые был предложен сотрудниками Рокфеллеровского института в США в 1958 г. Шпэкман, Штейн и Мур [112].
При изучении качественного состава свободных и связанных аминокислот и их количественное определение в плодах и экстракте шиповника [90], авторы [90] для анализа использовали аминокислотный анализатор фирмы «Хитачи» модель 835. Авторы [90] в плодах шиповника идентифицировали 16 свободных и 18 связанных аминокислот, суммарное содержание которых составило 0,86+0,04 и 1,21 ±0,06% соответственно. В сухом экстракте шиповника обнаружено 18 свободных и связанных аминокислот, в том числе незаменимые, общее содержание которых составило 1,02+0,06 и 2,61+0,14% соответственно; преобладали аспарагиновая и глутаминовая кислоты [90].
При исследовании состава аминокислот и их количественного содержания в траве фиалки полевой (Viola arvensis Murr.) и траве донника рослого (Melilotus altissimus Thuil.) качественное обнаружение аминокислот авторы [39] проводили в водных извлечениях с помощью нингидриновой реакции и хроматографически. Хроматографический анализ проводили в тонком слое сорбента. Аминокислоты проявлялись в виде красно-фиолетовых пятен. В траве фиалки полевой обнаружено 11 аминокислот, в том числе 4 незаменимых (валин, лейцин, лизин, треонин), а в траве донника рослого — 13 аминокислот, из них 6 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, лизин, треонин, фенилаланин).
Для более глубокого изучения содержания свободных аминокислот использовали аминокислотный анализатор марки ААА-339 (Чехия). Аминокислоты анализировали на аминокислотном анализаторе в стандартных условиях, обычно используемых для разделения белковых гидролизатов [39]. Суммарное содержание свободных аминокислот в траве фиалки полевой и донника рослого составляет 6,80 и 53,56 мкг/мл соответственно. В траве фиалки полевой преобладают аспарагиновая и глутаминовая кислоты, а в траве донника рослого — треонин и фенилаланин [39].
При исследовании аминокислотного состава листьев, цветков и плодов боярышника сглаженного Crataegus laevigata (Poir.) [90] аминокислотный анализ водорастворимых фракций проводили на аминокислотном анализаторе фирмы «Хитачи» модель 835.
Количественное содержание фракции нейтральных аминокислот (глицина, аланина, валина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина) в цветках и листьях практически одинаково. В плодах содержание этих аминокислот очень мало.
При изучении аминокислотного состава особый интерес представляли аминокислоты, оказывающие положительное фармакологическое действие на сердечно-сосудистую систему: метионин, лейцин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты [22]. Все они найдены в цветках, плодах и листьях боярышника сглаженного.
В цветках обнаружено высокое содержание глутаминовой кислоты — до 9,2 % от суммы свободных аминокислот (4,8 ммоль/кг), оно превысило таковое в листьях и плодах в 3,7 и в 16 раз соответственно. Содержание метионина и лейцина, обладающих положительным инотропным эффектом, в цветках соответственно 5,5 и 0,8 % (от суммы свободных аминокислот) [22].
Содержание суммы свободных аминокислот в цветках 5 видов боярышника из секции Sanguineae находилось в пределах 83,1-172,4 ммоль/кг, в среднем 136,4±36,9 ммоль/кг, а эти же величины для 7 видов из секции Oxyacanthae составили соответственно 47,1-71,4 и 57,9+10,8 ммоль/кг. Среднее содержание суммы свободных аминокислот в цветках 12 изученных европейских и азиатских видов было равно 90,7+46,8 ммоль/кг [26].
Авторы также количественно определили содержание в изучаемых органах гистидина и треонина, выполняющих в организме человека роль транспорта меди. Медь необходима для коррекции нарушений микроэлементного обмена при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Проведенное исследование позволило установить высокое содержание треонина в плодах, листьях и цветках боярышника сглаженного (соответственно 7,7, 4,5 и 15,2 % от суммы свободных аминокислот). Полученные результаты согласуются с данными о количественном содержании меди в различных органах боярышника сглаженного [90]. Было установлено невысокое содержание тирозина и фенилаламина в листьях, цветках и плодах боярышника сглаженного, что объясняется, по-видимому, участием этих аминокислот в биосинтезе флавоноидов [90].
Анализ литературных данных показал, что аминокислоты, содержащиеся в лекарственном растительном сырье, вносят значительный вклад в его фармакологическую активность.
Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Для оценки качественного и количественного состава компонентов настоя травы манжетки проводили идентификацию как по времени удерживания, так и по спектрам поглощения.
В связи с тем, что водное извлечение травы манжетки содержит модифицированные формы витаминов, танинов, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, агликонов, и, возможно, нуклеотидов, целесообразно исследовать спектральные и хроматографические характеристики, которые должны совпадать с используемыми стандартными соединениями и качественно оценить извлечение в целом, как по основным компонентам, так и по минорным. Общим характерным признаком для подобных соединений является наличие хромофорных групп, особенности которых можно экспериментально оценить по спектру поглощения соединений, выбранных в качестве рабочих стандартов. Исходя из природы компонентов травы манжетки, была выбрана длина волны детектирования 255 нм - для флавоноидов, основным из которых является рутин и 280 нм для выявления других фенольных соединений.
Проведенное хроматографическое разделение при одновременном детектировании при длине волны 255 нм и 280 нм показало, что трава манжетки содержит фенольные соединения (детектирование при 280 нм) и соединения флавоноидной природы (детектирование при 255 нм).
Хроматограммы водного извлечения манжетки представлены на рис. 3 и 4. В условиях градиентного элюирования идентифицировали рутин с временем выхода 31,4 мин, относительное содержание которого составляет 44,7%.
В таблице 1П приведены времена удерживания и относительное содержание компонентов манжетки, выявленные при данной длине волны детектирования.
Как показывает анализ полученных экспериментальных данных, при длине волны детектирования 255 нм, настой травы манжетки 1:10 содержит 41 соединение. В то же время при детектировании на 280 нм определен 81 компонент.
В таблице 2П приведены времена удерживания и относительное содержание каждого компонента при длине волны 280 нм.
Для идентификации и количественной оценки использованы стандартные соединения: рутин, кверцетин, гиперозид, лютеолин, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, галловая кислота, арбутин, аскорбиновая кислота и рибофлавин. Хроматограмма модельной смеси данных соединений представлена на рисунке 5.
Для идентификации использовали спектральные характеристики данных соединений, которые представлены в Приложении.
В Приложении на рисунках 1П-10П и в таблицах Ш и 2П представлены спектры компонентов настоя травы манжетки и указаны времена выхода каждого компонента.
Оценили содержание основных биологически активных веществ, обнаруженных в настое травы манжетки. Результаты определения представлены в таблице 7.
Из таблицы 7 видно, что наибольшее содержание установлено для рутина, хлорогеновой и аскорбиновой кислот: 0,87 , 0,27 и 0,35 мг/мл соответственно.
Разработка норм качества для настоя травы манжетки
Настой травы манжетки готовили согласно методике ГФХІ, с учетом коэффициента водопоглощения (Квп=4).
В результате фитохимического изучения настоя травы манжетки установили нормы содержания основных БАВ. Данные представлены в таблице 20.
В связи с фармакологическим изучением, необходимо было получить стандартное водное извлечение из травы манжетки.
Для этого провели оценку окраски настоя травы манжетки 1:10 в сравнении с эталонами цветности. Приготовленная серия настоев соответствовала фармакопейным эталонам от 1а до 16.
Установили, что приготовленная серия настоев травы манжетки имеет слабокислую реакцию среды (рН от 4,0 до 4,6), также определили сухой остаток настоя травы манжетки.
Разработаны характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;
Методом дифференциальной спектрофотометрии в опытных образцах травы манжетки определено содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин;
Проведены валидационные исследования методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки в пересчете на рутин. Предложенная методика обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов;
Разработаны нормы качества настоя травы манжетки 1:10 по показателям: «Окраска настоя», «рН настоя», «Сухой остаток» и содержанию основных БАВ.
Исследование проводили на беспородных интактных мышах по схеме: 1-й группе мышей вводили внутрибрюшинно (в/б) настой травы манжетки 1:10 в объеме 0,75 мл на мышь, что соответствует дозе 18,75 мг/кг (здесь и далее в пересчете на сухой остаток настоя); 2-й группе - внутрибрюшинно настой травы манжетки 1:10 в объеме 0,5 мл на мышь, что соответствует дозе 12,50 мг/кг; 3-й группе одновременно вводили настой 1:10 0,25 мл/мышь внутрибрюшинно и 0,25 мл/мышь 1:10 настоя перорально (per os) (6,25 мг/кг + 6,25 мг/кг), 4-й группе мышей вводили перорально настой травы манжетки 1:10 в объеме 0,5 мл на мышь, что соответствует дозе 12,50 мг/кг; 5-й группе мышей вводили внутрибрюшинно воду очищенную по 0,75 мл/мышь.
После однократного введения настоя животным 1-й и 2-й группы гибель мышей отмечена на 1-2-е сутки от начала инъекции. Средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей составила 1,5±0,99 дня.
В 3-й группе гибель животных наступила позднее, средняя продолжительность жизни мышей составила 3,7=Ы,73 дня. В 4-й группе гибель животных не наступила. Мышей контрольной группы забили на 30-й день, так как выживших животных в группах с 1 по 3 не осталось. Результаты представлены в таблице 21.
Внутрибрюшинное введение настоя травы манжетки 1:10 в дозах 18,75 мг/кг, 12,50 мг/кг и 6,25 мг/кг (при сочетанном применении в дозах 6.25 мг/кг внутрибрюшинно и 6,25 мг/кг перорально) приводит к гибели животных на фоне острой токсичности. При вскрытии павших животных наиболее выраженные макроскопические изменения выявлены в ткани тонкого и толстого кишечника: отек, кровоизлияния, что связано, вероятно, с раздражающим действием полифенольных соединений на слизистую оболочку кишечника.
При пероральном введении настоя травы манжетки гибели животных не отмечено. Выживаемость животных зафиксировали на уровне контроля. Выявили, что оптимальным путем введения препаратов травы манжетки является пероральный.
Изучение способности настоя травы манжетки ингибировать рецидивирование злокачественных опухолей
Изучили способность настоя травы манжетки ингибировать процесс рецидивирования на модели экспериментальной карциномы легкого Льюис (LLC), привитой мышам линии BDF1. После хирургического удаления опухоли (рис. 29, 30, 31) мышей разделили на 2 группы: контрольную и опытную. Животным опытной группы ежедневно в течение 5-й дней вводили настой травы манжетки 1:10 по 0,5 мл/мышь (12,50 мг/кг).
После окончания лечения наблюдали появление рецидивов и наличие метастазов у мышей. На 28-е сутки после удаления опухоли забили мышей обеих групп. При вскрытии отмечали массу легких каждой мыши в группе для оценки метастазирования. Оценку антирецидивной активности проводили по следующим критериям:
1. Частота рецидивирования (ЧР).
В контрольной группе рецидивы отметили у 5 мышей из 7, в опытной -у 2 из 7. Таким образом,
ЧРКотроль= 5x100/7 = 71%;
ЧР0ПЫТ= 2x100/7 = 29%;
2. Динамика появления рецидивов у животных.
На 18-е, 19-е, 25-е, 27-е и 28-е сутки после первоначальной прививки опухолевых клеток мышей пальпировали в оперированной области и отмечали наличие рецидивов. Результаты представлены в таблицах 31 и 32.
Рецидивы выявили у 5 мышей из 7 в контрольной группе и только у 2 из 7 в группе, получавшей настой травы манжетки в дозе 12,50 мг/кг.3. Торможение роста метастазов (ТРМ%).
При вскрытии взвешивали массу легких каждой мыши в контрольной 3 4 5 6 7 мышь (рис. 32) и опытной группах (рис. 33).
Интенсивность метастазирования определяли по средней массе легких у мышей контрольной и опытной групп. Результаты представлены в таблице 33.
Определили, что частота рецидивирования после проведенной терапии настоем травы манжетки в опытной группе в 2,4 раза ниже, чем у мышей в контрольной группе. Таким образом, настой травы манжетки обладает способностью ингибировать процесс рецидивирования опухоли LLC у экспериментальных животных. Высокая величина ТРМ%=36% подтверждает антиметастатическую активность настоя травы манжетки.
![Фармакогностическое изучение травы коровяка скипетровидного (Verbascu denseflorum bertol.) [Электронный ресурс]](/i/i/4236/197572.png "Фармакогностическое изучение травы коровяка скипетровидного (Verbascu denseflorum bertol.) [Электронный ресурс] Ахмед М.С. Алкилани")
![Формакогностическое изучение травы тысячелистника широколопастного [Электронный ресурс]](/i/i/4713/201091.png "Формакогностическое изучение травы тысячелистника широколопастного [Электронный ресурс] Глушко Маргарита Петровна")
