Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Систематическое положение и ботанико-географическая характеристика Scutellaria galericulata L 12
1.2 Основные группы биологически активных веществ, характерные для представителей рода Scutellaria флоры России 19
1.3 Биологическая активность видов рода шлемник и их применение в медицине 37
Глава 2 Материалы и методы исследования 42
2.1 Материалы исследования 42
2.2 Методы исследования 42
2.2.1 Методы фитохимического анализа 42
2.2.2 Методы ресурсоведческой оценки запасов сырья 47
2.2.3 Методы фармакологического анализа 47
2.2.4 Методы товароведческого анализа 48
Глава З Фитохимическое изучение травы Scutellaria galericulata 49
3.1 Общий фитохимический анализ на основные группы биологически активных веществ 49
3.2 Изучение состава флавоноидов 54
3.2.1 Бумажно-хроматографическое исследование 70% спиртового извлечения из травы S. galericulata и S. baicalensis 54
3.2.2 Выделение и очистка суммарного полифенольного комплекса 56
3.2.3 Разделение суммарного полифенольного комплекса на отдельные компоненты 60
3.2.4 Установление структуры выделенных флавоноидов 62
3.2.5 Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве шлемника обыкновенного 65
3.3 Изучение фенольных кислот 76
3.4 Изучение дубильных веществ 84
3.4.1 Качественный анализ дубильных веществ 84
3.4.2 Количественное определение суммы дубильных веществ 85
3.5 Изучение углеводного состава S. galericitlata 94
3.5.1 Изучение состава и динамики накопления свободных моносахаридов в траве шлемника обыкновенного 94
3.5.2 Изучение состава и динамики накопления водорастворимых полисахаридов в траве шлемника обыкновенного 98
3.5.3 Выделение и анализ пектиновых веществ 104
3.6 Исследование состава азотсодержащих соединений 106
3.7 Изучение макро- и микроэлементного состава 110
3.8 Анализ травы S. galericulata методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором 113
Глава 4 Изучение фармакологической активности Scutellaria galericulata 118
4.1 Определение острой токсичности 118
4.2 Изучение антигипоксического действия 119
Глава 5 Экологическая приуроченность и оценка запасов сырья Scutellaria galericulata 123
5.1 Особенности распространения на территории Северо-Запада России 123
5.2 Определения запасов травы S. galericidata 125
Глава 6 Установление показателей подлинности и качества травы шлемника обыкновенного 130
6.1 Морфологические признаки сырья 130
6.2 Микроскопические признаки сырья 132
6.3 Качественные реакции 138
6.4 Определения суммы флавоноидов и валидационная оценка разработанной методики 140
6.5 Определение предельных значений содержания суммы флавоноидов и дубильных веществ в сырье 147
6.6 Определение товароведческих показателей 149
6.7 Установление срока годности сырья 152
Основные результаты и выводы 154
Список литературы 156
- Основные группы биологически активных веществ, характерные для представителей рода Scutellaria флоры России
- Изучение фенольных кислот
- Изучение антигипоксического действия
- Определения суммы флавоноидов и валидационная оценка разработанной методики
Введение к работе
Актуальность темы. Лекарственные растения в настоящее время остаются незаменимыми источниками получения некоторых лекарственных средств и занимают важное место в фармацевтической практике. По сравнению с синтетическими, растительные препараты, наряду с комплексным многосторонним действием на организм человека, обладают, как правило, меньшими побочными эффектами и менее токсичны. В связи с этим изыскание новых видов лекарственного растительного сырья, их внедрение в научную медицину и расширение сырьевой базы остается актуальной задачей современной фармакогнозии.
Многие растения сем. яснотковых - Lamiaceae обладают широким спектром биологической активности и используются как в официналыюй, так и в народной медицине. К числу таких представителей принадлежат виды рода шлемника - Scutellaria L., широко распространенные на территории РФ. Во многих видах этого рода обнаружены фенолышс соединения, в частности, флавоноиды, дубильные вещества и ароматические кислоты, а также аминокислоты, иридоидные гликозиды и стероидные соединения.
Из представителей рода шлемник в медицинской практике ранее использовался только один вид - шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi). Настойка корней этого вида применялась в качестве гипотензивного и седативного средства. Шлемник обыкновенный (Scutellaria galericalata L.) широко распространен на всей территории РФ, что делает его перспективным в ресурсоведческом отношении. Основными биологически активными веществами двух видов шлемника является комплекс полифенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ). Трава S. galericulata применяется в качестве седативного средства и включена в Британскую Травяную Фармакопею (2001).
Представляется актуальным углубленное изучение компонентного состава биологически активных веществ и фармакологической активности извлечений из травы S. galericulata, произрастающей на Северо-Западе России, с целью введения ее в научную медицину.
Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Исследования с использованием приборных хроматографических методов выполнены в аналитическом центре академии и лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. Л. Комарова Российской Академии Наук. Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии СПХФА. Изучение гербарных образцов S. galericulata проводили на базе Ботанического Музея БИН РАН им. Комарова.
.-- '"\ і \
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является проведение фармакогностического изучения и стандартизация травы шлемника обыкновенного как перспективного лекарственного растительного сырья для введения в медицинскую практику. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести общий фитохимический анализ травы S. galericulata, заготовленной на территории Северо-Запада России, и сравнить с результатами анализа травы S. baicalensis
Изучить качественный состав основных групп биологически активных веществ S. galericulata, провести исследование динамики накопления действующих веществ в траве S. galericulata и разработать методики количественного определения маркерных групп соединений для установления доброкачественности сырья;
Определить уровень острой токсичности и специфической биологической активности на животных сухого экстракта из травы S. galericulata;
Установить макро- и микроскопические признаки сырья S. galericulata;
Провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья;
Разработать проект нормативной документации (проект фармакопейной статьи) на сырье «Шлемника обыкновенного трава».
Научная новизна. Изучен химический состав основных групп БАВ шлемника обыкновенного. Впервые установлена динамика накопления суммы флавоноидов и дубильных веществ в траве S. galericulata, произрастающей на территории Северо-Запада России, получены данные о его компонентном составе.
С помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, газовой хроматографии с масс-селективным детектором, спектрофотометрии) впервые для данного вида идентифицированы: флавоновый гликозид - космосиин; ароматические кислоты и их производные (галловая, хлорогеновая, феруловая, кофейная, и-гидроксикоричная, коричная и моно-2-этилгексиловый эфир 1,3-бензендикарбоксиловой кислоты), производные флаван-3-ола (эпигаллокатехин и эпикатехин); жирные кислоты и их производные (олеиновая, линоленовая и метиловый эфир пальмитиновой кислоты), алифатическое соединение тритерпеновой природы - сквален и два стероидных соединения - кампестерол и у-ситостерол.
В ходе общего фитохимического анализа показано, что S. galericulata и S. baicalensis содержат одни и те же группы биологически активных соединений.
Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве шлемника обыкновенного, которая введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Определена оптимальная фаза вегетации растения для заготовки сырья и установлены оптимальные сроки его заготовки. Установлены критерии, позволяющие оценить подлинность и доброкачественность сырья. Результаты работы использованы при разработке проекта нормативной документации на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Шлемника обыкновенного трава» (ФС). Разработана технология сухого экстракта травы шлемника обыкновенного. Экспериментально установлено, что сухой экстракт
S. galericulata обладает низкой токсичностью; также показана антигипоксическая активность сухого экстракта растения. Результаты фотохимического и фармакологического исследований могут быть использованы при целенаправленном создании фитопрепаратов из травы шлемника обыкновенного, обладающих антигиноксическим эффектом.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященная 90-летию СПХФЛ (Санкт-Петербург, СПХФА 2009); I Съезде натуротсрапевтов в рамках VII Международного конгресса «Традиционная медицина» (Москва, 2009); 65-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010 г.); II Всеросийской молодежной научно-практической конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2010); Научной конференции студентов и молодых ученых (аспирантская сессия) (Санкт-Петербург, СПХФА, 2010); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петрбург, 2010); Научно-методической конференции «Гаммермановские чтения -2011) (Санкт-Петербург, СПХФА, 2011); Всероссийской научно-практической конференции «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 9 работах, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных изданиях.
Основные положения, выносимые на защиту.
Результаты общего фотохимического изучения травы S. galericulata;
Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп биологически активных веществ из травы S. galericulata (флавоноидов, фенольних кислот, дубильных веществ, углеводов);
Результаты изучения некоторых аспектов биологической активности сухого экстракта из травы 5. galericulata;
Данные товароведческого анализа сырья «Шлемника обыкновенного трава» и его стандартизация.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 49 таблицами. Диссертация состоит из введения, 6 глав (обзор литературы, материалы и методы и четыре главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), основных результатов и выводов, списка литературы, включающего 147 источника, из них 42 на иностранных языках, 4 приложений.
Основные группы биологически активных веществ, характерные для представителей рода Scutellaria флоры России
Химический состав представителей рода Scutellaria изучен с различной степенью детализации. Наиболее подробно исследовался состав биологически активных соединений 4-х видов (S. baicalensis, S. scordiifolia, S. creticola, S. orientalis). Во всех изученных видах обнаружены фенольные соединения, стероиды, иридоидные гликозиды.
Флаеоноидпые соединния.
По данным литературы (табл. 2, 3) флавоноидный состав изучен в той или иной степени 10 представителей рода Scutellaria, произрастающих на территории РФ. Наибольшее количество компонентов установлено в 5 видах шлемника (S. baicalensis, S. galericulata, S. scordiifolia, S. creticola, S. orientalis). Меньшее количество компонентов (от двух до четырех флавоновых агликонов и от одного до четырех гликозидных производных) идентифицировано в S. albida L., S. oreophila Grossh., S. polyodon Juz., S. altissima, S. granulosa. Анализ опубликованных данных показал, что виды рода Scutellaria содержат комплекс флавоноидных агликонов и гликозидов в надземных и подземных органах. Наиболее распространенными являются флавоновые агликоны: хризин (1), байкалеин (2), скутеллареин (3), апигенин (4), лютеолин (5), вогонин (6), ороксилин А (7), динатин (8) [38, 55, 96, 103] (табл. 2). Обнаруженные агликоны в растениях в основном находятся в виде 7-0-гликозидов (7-О-глюкуронидов и 7-О-глюкозидов) (табл. 3).
Хемотаксономическим признакам на уровне рода Scutellaria является наличие 2 -метилированных и гликозилированных производных, которые относятся к группе дериватов флавона [108, 139, 143]. Следует отметить, что число видов шлемника, у которых изучался флавоноидный состав, составляет 20 % от общего количества представителей рода Scutellaria флоры России.
Особенно следует выделить по степени изученности и разнообразию флавоноидных соединений S. baicalensis. К настоящему времени в подземных и надземных органах данного вида обнаружено около 125 фенольных соединений преимущественно флавоноидной природы [62]. Разнообразие флавоноидов обусловлено строением трехуглеродного фрагмента и степенью его окисленности, а также количеством и положением заместителей в кольцах А и В. В подземной части 5". baicalensis идентифицированы флавоновые агликоны (табл. 2) с незамещенным кольцом В в молекуле: хризин, байкалеин, вогонин, ороксилин А, норвогонин (12), 7-метоксинорвогонин (13), 5 гидрокси-7,8-диметоксифлавон (14), 7-метоксибайкалеин (15), 5,8-дигидрокси 6,7-диметоксифлавон (16); агликоны с одной или двумя -ОН-группами в кольце В: скутелляреин, апигенин, лютеолин, 5,7,2 - тригидроксифлавон (17), тенаксин (18), скутевулин (19), 5,8,2 -тригидрокси-7-метоксифлавон (20), скуллкапфлавон 1 (21), 5,8,2 -тригидрокси-6,7-диметоксифлавон (22), 5,7,4 тригидрокси-8-метоксифлавон (24), 5,7,2 ,3 -тетрагидроксифлавон (25), 5,7,2 ,6 -тетрагидроксифлавон (26), висцидулин II (27), 5,2 5 -тригидрокси 6,7,8-триметоксифлавон (28); агликоны с одной или двумя -ОСН3-группами в кольце В: динатин, 5-гидрокси-7,8,2 -триметоксифлавон (29), 5-гидрокси 6,7,8,2 ,6 -пентаметоксифлавон (31); агликоны с -ОН и -ОСНз - группами в кольце В: 5,7,2 -тригидрокси-8,6 -диметоксифлавон (32), скуллкапфлавон II (33), 6,2 -дигидрокси-5,7,8,6 -тетраметоксифлавон (34) и висцидулин III (35). Наряду с флавоновыми производными в подземной части S. baicalensis обнаружены 8 дигидрофлавоновых агликонов - 5,7-дигидроксифлаванон (36), дигидробайкалеин (37), 5,6-дигидрокси-7-метоксифлавонон (38), дигидроороксилин А (39), дигидронорвогонин (40), 5,8-дигидрокси-7 метоксифлаванон (42), 5,7,2 ,6 -тетрагидроксифлаванон (43), 7,2 ,6 тригидрокси-5-метоксифлаванон (44), а также 5,7,2 ,6 тетрагидроксифлаванонол (47), 3,5,7,2 ,6 -пентагидроксифлавонол (48) и 2,4,2 ,6 -тетрагидрокси-6-метоксихалкон (49) [74, 80].
В отечественных популяциях S. baicalensis (образцы из Приморья, Приамурья и Забайкалья) флавоноиды подземной части характеризуются преобладанием производных с незамещенным кольцом В (хризин, байкалеин, вогонин и др.), в то время как образцы, собранные на территории Японии, Кореи и Китая содержат также соединения, имеющие в кольце В различные заместители [53].
Флавоноидный состав надземной части S. baicalensis представлен более 20 веществами агликоновой и гликозидной природы. Из флавоновых агликонов, помимо хризина, байкалеина, апигенина, лютеолина, скутелляреина, вогонина, ороксилина А, динатина, идентифицированы изоскутелляреин (23), сальвигенин (30), а также флаваноны - дигидровогонин, 5,7,8,4 -тетрагидроксифлаванон (45), картамидин (46) и изофлаванон изокартамидин (50) [98].
Качественный состав флавоновых гликозидов S. baicalensis не коррелирует с разнообразием агликонов. В доступных источниках приводятся сведения об идентификации в надземной и подземной частях 26 флавоновых гликозидов, содержащихся преимущественно в подземных органах, и являющихся производными хризина, байкалеина, скутелляреина, вогонина, ороксилина А, дигидробайкалеина, дигидронорвогонина и картамидина (табл. 3). Указанные агликоны большей частью находятся в форме 7-0-глюкуронидов, которым сопутствует 7-О-глюкозид байкалеина, 5-О-глюкозид вогонина и два изомерных 6,8-С-дигликозида хризина. Методом ВЭЖХ образцов корней 51. baicalensis из Японии и Китая установлено, что основным флавоноидным соединением является байкалин, содержание которого варьирует в пределах от 5,19 до 18,93% [22]. Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в подземной части 5". baicalensis показало, что их содержание составляет 21 - 23%, из них флавоноидных гликозидов 18,0 - 20,5% в пересчете на стандартный образец байкалина [50].
Доминирующими компонентами надземной части S. baicalensis являются 7-О-глюкурониды хризина и скутелляреина, содержание которых установлено методом ВЭЖХ и составляет около 26 и 37% от суммы флавоноидов соответственно [47]. Общее содержание флавоноидов в надземной части, определенное спектрофотометрически, достигает 10 — 22% в пересчете на скутеллярин [51, 99].
Для S. galericulata также установлено наличие внутривидовой изменчивости качественного состава флавоноидов. Из образцов S. galericulata, собранных в Курской области, выделены основные флавоноидные гликозиды байкалин и галерозид, но не обнаружены производные хризина. В некоторых образцах, заготовленных в лесной зоне других центральных областей европейской части России, отмечается, что доминирующим компонентом является лютеолин-7-глюкозид, а в образцах из Воронежской, Оренбургской областей и из окрестностей города Иркутска - дигидронорвогонозид (7-глюкуронид-5,7,8-триоксифлаванона) [76].
На основании анализа данных о качественном составе флавоноидов 10 изученных видов рода Scutellaria флоры России установлено, что в большинстве представителей обнаружены преимущественно производные флавона. При этом для всех этих видов отмечается присутствие байкалеина. Данный компонент, а также хризин, скутеллареин и их гликозидные производные являются наиболее характерными флавоноидными соединениями представителей трех секций рода Scutellaria. Менее распространенные флавоновые соединения динатин и гиспидулин обнаружены в двух видах секции Lupulinaria (S. orientalis и S. creticold), но отсутствуют в видах секции Galericularia. Кроме того, динатин найден только в подземных и надземных органах S. baicalensis, относящегося к секции Stachymacris. Флавоновые агликоны 12-36 (табл. 2) идентифицированные в S. baicalensis, а также их гликозилированные производные, пока не найдены в других видах шлемника. Однако, следует отметить, что в надземной части S. galericulata отмечены флаваноны дигидробайкалеин, дигидровогонин, дигидронорвогонин, а также гликозиды - дигидронорвогонозид и 7-0-глюкуронид дигидробайкалеина [80].
Изучение фенольных кислот
Предварительное обнаружение фенольных кислот в 70% спиртовом извлечении из надземной части ш. обыкновенного осуществляли методом одномерной бумажной хроматографии. Наилучшее разделение указанных соединений наблюдали при использовании системы растворителей БУВ (4:1:2). Детектирование осуществляли в УФ-свете при длине волны 365 нм, при которой отмечали пятна фиолетовой и синей флуоресценции, соответствующие фенольным кислотам, указывающие на присутствие данной группы во всех образцах надземной части. Идентификацию компонентов осуществляли в присутствии стандартных образцов фенольных кислот (рис. 9, табл. 16).
При использовании БХ в 70% спиртовом извлечении были обнаружены хлорогеновая, кофейная, /7-гидроксикоричная и феруловая кислоты.
Более детальное изучение компонентного состава и содержание фенольных кислот осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [40]. Для этого получали извлечение из травы S. galeiicidata для образцов №№ 9, 14, 18 и 20 (см. приложение А) по следующей схеме: около 1 г (точная навеска) измельченного сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещали в колбу вместимостью 250 мл и экстрагировали последовательно спиртом этиловым 90, 70, 40% и водой на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 90 минут при соотношении сырья и экстрагента 1:25. Все вытяжки фильтровали через бумажный фильтр и объединяли в мерной колбе вместимостью 100 мл, а затем доводили спиртом этиловым 90% до метки (исследуемый раствор).
Для сравнительного анализа параллельно готовили 0,05% растворы стандартных образцов галловой, хлорогеновой, ванилиновой, кофейной, /7-гидроксикоричной, феруловой, вератровой, 3,4,5-триметоксикоричной, салициловой, коричной кислот в водном растворе 10% трифторуксусной кислоты.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали в вышеописанных условиях (п. 2.2.1). Хроматограммы суммы стандартных образцов фенольных кислот и спиртовых извлечений из травы S. galericulata, заготовленной в Ленинградской области в фазы отрастания побегов, цветения, начала плодоношения и массового плодоношения представлены на рисунках 10, 11, 12, 13 и 14.
Методом ВЭЖХ в данных образцах сырья было идентифицировано 5 фенольных кислот: галловая, хлорогеновая, кофейная, и-гидроксикоричная, феруловая. Содержание фенольных кислот в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х,%) вычисляли по формуле где Sx - площадь пика испытуемого раствора, So - площадь пика раствора стандартного образца соответствующей фенольной кислоты, Мх - масса навески сырья в граммах, Мо - масса навески стандартного образца фенольной кислоты в граммах, w - потеря в массе при высушивании сырья, %.
По данной методике было определено содержание данных фенольных кислот в образцах сырья, собранных по фенофазам растения на территории Ленинградской области (табл. 17).
Установлено, что галловая кислота в свободном виде определяется только в фазу отрастания побегов. Содержание кофейной, хлорогеновой кислот достигает максимальной концентрации в фазу цветения и заметно снижается в фазу массового плодоношения. Концентрация феруловой кислоты максимальна в фазу начала плодоношения, а в фазу массового плодоношения данная кислота не определяется. и-Гидроксикоричная кислота была обнаружена методом ВЭЖХ только в фазу массового плодоношения.
Изучение антигипоксического действия
С точки зрения фармакологической активности представляет интерес изучение антиоксидантной активности сухого экстракта травы ш. обыкновенного, поскольку ранее Научно-исследовательским институтом фармакологии Томского научного центра Академии медицинских наук России было предложено патентованное лекарственное средство - экстракт ш. байкальского в качестве антигипоксического средства [22].
Антигипоксическую активность изучали на моделях острой гемической, гистотоксической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией. Извлечения вводили животным внутрибрюшинно в дозах 1/10 и 1/100 LD50.
Острая гистотоксическая гипоксия (ОГТГ)
Острая гистотоксичекая гипоксия развивается за счет взаимодействия различных ядов с цитохромоксидазой (ферментом терминального участка дыхательной цепи), приводящего к подавлению ее активности [54].
Регистрировали продолжительность жизни животных на фоне введения летальной дозы раствора натрия нитропруссида до наступления летального исхода. На данной модели значение выживаемости (%) для всех извлечений было равным нулю.
Сухой экстракт ш. обыкновенного в дозах 1/10 и 1/100 LD5o обладал прогипоксическим действием. Продолжительности жизни экспериментальных животных возросла при введении экстракта в дозе 0,024 г/кг на 44 % по сравнению с контрольной группой. Прирост длительности жизни животных при введении сухого экстракта в дозе 0,24 г/кг составил 124 % относительно контрольной группы (табл. 35). Препарат сравнения - гутимин увеличивал длительность жизни экспериментальных животных, получавших летальную дозу натрия нитропруссида на 180% по сравнению с группой контрольных животных.
Антигипоксический эффект исследуемого растительного средства в дозе 1/10 LD5o близок по эффективности к препарату сравнения и уступает препарату сравнения в дозе 1/100 LD5o Острая гемическая гипоксия (ОГГ)
В основе острой гемической гипоксии лежит уменьшение кислородной емкости гемоглобина, вызываемой превращением оксигемоглобина в метгемоглобин или карбоксигемоглобин.
Регистрировали продолжительность жизни животных на фоне введения летальной дозы раствора натрия нитрита до наступления летального исхода. Результаты исследования представлены в табл. 36.
Изучение действия сухого экстракта на выживаемость и прирост времени жизни животных в условиях острой гемической гипоксии показало, что максимальный защитный эффект, сравнимый с действием препарата сравнения, сухой экстракт травы ш. обыкновенного проявляет при введении большей (0,24 г/кг) из исследуемых доз (табл. 35). Продолжительность жизни экспериментальных животных возрастала на 92 % по сравнению с показателем контрольной группы животных. Антигипоксическая активность экстракта ш. обыкновенного в двух исследуемых дозах превосходит эффективность препарата сравнения гутимина.
Гипоксия сгиперкапнией
Регистрировали продолжительность жизни животных в условиях данного вида гипоксии.
Установлено, что сухой экстракт травы ш. обыкновенного обладает умеренным антигипоксическим эффектом в данных условиях гипоксического состояния (табл. 37). Максимальный эффект экстракта отмечен при введении дозы 0,024 г/кг. Продолжительность жизни опытных животных возрастала на 37 % по сравнению с группой контрольных животных. Увеличение дозы экстракта (0,24 г/кг) приводило к снижению его протекторных свойств в условиях гипоксии. Во всех сериях экспериментов антигипоксическая активность экстракта травы ш. обыкновенного уступала эффекту препарата сравнения.
Таким образом, сухой экстракт травы ш. обыкновенного обладает антигипоксическим действием на основных моделях гипоксических состояний [35].
В используемых моделях наблюдаются различные механизмы развития гипоксии, т.е. модели отличаются участками гипоксических нарушений. Антигипоксические свойства соединений, проявляемые на одной модели, не всегда воспроизводятся на другой модели. Это дает возможность судить о мишени действия антигипоксантов.
Сухой экстракт ш. обыкновенного воздействует на различные участки гипоксических нарушений. Максимальная активность экстракта наблюдается на модели гистотоксической гипоксии, т.е. в защите фермента цитохромоксидазы, что можно рассматривать как основу для более глубокого фармакологического исследования.
Определения суммы флавоноидов и валидационная оценка разработанной методики
Для количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид использовали разработанную нами методику дифференциальной спектрофотометрии (п. 3.2.5).
Проведена метрологическая аттестация (валидация) данной методики, т.е. доказана, ее пригодность для определения суммы флавоноидов в траве ш. обыкновенного.
Валидационную оценку методики проводили с использованием образца № 18 травы ш. обыкновенного, заготовленного в фазу цветении - начала плодоношения в Ленинградской области в 2009 году по следующим характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность, правильность [4, 14, 15, 16, 17, 137].
При использовании спектрофотометрического метода, основанного на реакции комплексообразования алюминия хлорида с цинарозидом, наблюдается батохромный сдвиг длинноволнового максимума поглощения с 251 до 400 нм. Спектр 70% спиртового извлечения травы ш. обыкновенного с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида имеет один из максимумов поглощения 400±2 нм, которой совпадает с максимумом поглощения спектра цинарозида с алюминия хлорида, что позволило выбрать данную длину волны в качестве аналитической (рис. 37).
Полученные результаты подтверждают специфичность выбора варианта дифференциальной спектрофотометрии при разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в траве ш. обыкновенного.
Проведен подбор оптимальных условий экстракции в зависимости от степени концентрации спирта этилового, время экстракции, измельченности сырья, соотношения сырья и экстрагента, кратности экстракции (табл. 9, 10, И, 12, 13, 41). Содержание суммы флавоноидов вели в пересчете на цинарозид (п. 3.5.2).
Для определения линейности методики проведены исследования по выбору оптимального количества реактива алюминия хлорида. Была проанализирована зависимость значений суммы флавоноидов обыкновенного и различных количеств 2% раствора алюминия хлорида (табл. 42).
В результате было установлено, что наибольшее количество флавоноидов определяется через 20 мин после начала реакции и сохраняется в течение 30 минут для продуктов взаимодействия суммы флавоноидов травы ш. обыкновенного и 2% раствора алюминия хлорида, взятом в количестве от 0,1 до 0,9 мл. В случае использования 0,1 и 1,3 мл реактива значение суммы флавоноидов было наименьшим (эти значения при дальнейшей работе не использовались), объем 0,5 мл реактива является оптимальным.
Определение линейности методики устанавливали при изучении характера зависимости количества 2% раствора алюминия хлорида от величины аналитического сигнала (значений оптической плотности). Из пяти различных навесок травы ш. обыкновенного были получены спиртовые извлечения с применением оптимальных условий экстракции, с каждым из них проведена реакция с 2% раствором алюминия хлорида, но с различным количеством реактива: 0,3, 0,5 и 1,0 мл (табл. 43). В каждом случае были построены градуировочные графики зависимости значений оптической плотности от количества суммы флавоноидов, найденном в каждой навеске сырья по реакции с 2% раствора алюминия хлорида в пересчете на цинарозид. На рис. 38 в качестве примера представлен один из градуировочных графиков.
Во всех трех случаях градуировочные графики имеют линейный характер, однако коэффициент корреляции, рассчитанный в программе Microsoft Office Excel 2007 / статистика, максимально приближен к единице в случае использования 0,5 мл 2 % спиртовом растворе алюминия хлорида.
Таким образом, можно сделать вывод о линейной характеристики методики определения количественного содержания суммы флавоноидов в траве ш. обыкновенного методом дифференциальной спектрофотометрии и целесообразности использования для реакции комплексообразования 0,5 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида.
Для определения лабораторной прецизионности, т.е. выявления степени близости между известным значением и значением определяемой величины, определяли сумму флавоноидов по разработанной нами методике в 5 навесках травы ш. обыкновенного. Результаты эксперимента представлены в табл. 44.
Из таблицы следует, что относительное стандартное отклонение составляет 1,5%, следовательно, методика является воспроизводимой.
Для определения правильности методики (или отсутствие систематической ошибки) определяли методом добавок трех различных навесок РСО цинарозида непосредственно в извлечение из травы ш. обыкновенного на трех образцах в трехкратной повторности (табл. 45).
Из представленных показателей видно, что во всех трех экспериментальных для анализируемых образцов получаются сопоставимые результаты, а относительное стандартное отклонение оценки правильности методики равно 1,69%
Таким образом, предложенная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве ш. обыкновенного носит линейный характер, позволяет получить достоверные результаты и воспроизводима в условиях лаборатории, следовательно, может быть включена в нормативную документацию на новый вид лекарственного сырья «Шлемника обыкновенного трава» (см. приложение В).
