Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Краткая ботанико-фармакогностическая характеристика семейства гвоздичных и его отдельных пердставителей
1.1. Общее представление о семействе 14
1.1.1. Семейство гвоздичные 14
1.1.2. Волдырник ягодный 16
1.1.3. Мягковолосник водяной 18
1.2. Химический состав 20
1.2.1. Элементный состав 21
1.2.2. Вещества первичного обмена 22
1.2.3. Вещества вторичного обмена 24
1.2.3.1. Сапонины 24
1.2.3.2. Фенольные соединения 25
1.2.3.3. Экдистероиды 30
1.2.4. Хемотаксономические исследования36
1.2.5. Особенности и возможности применения в медицине
Заключение 58
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 60
2.2. Методы фитохимических исследований 60
2.2.1. Анализ элементного состава 60
2.2.1.1. Атомно-абсорбционный метод 60
2.2.1.2. Рентгенофлуоресцентный метод 61
2.2.1.3. Масс-спектрометрический метод . 63
2.2.2. Качественный анализ отдельных природных соединений 64
2.2.2.1. Вещества первичного обмена 64
2.2.2.1.1. Углеводы 64
2.2.2.1.2. Аминокислоты 67
2.2.2.2. Вещества вторичного обмена 68
2.2.2.2.1. Флавоноиды 68
2.2.2.2.2. Кумарины 69
2.2.2.2.3. Дубильные вещества 69
2.2.2.2.4. Гидроксикоричные кислоты . 70
2.2.2.2.5. Сапонины 70
2.2.2.2.6. Алкалоиды . 70
2.2.2.2.7. Иридоиды 71 2.2.2.2.8. Производные антрацена 71
2.2.2.2.9. Сердечные гликозиды 72
2.2.2.2.10. Экдистероиды . 72
2.2.2.2.11. Хроматографические методы 74
2.2.2.2.11.1. Гидроксикоричные кислоты 75
2.2.2.2.11.2. Флавоноиды 76
2.2.2.2.12. Высокоэффективная жидкостная хроматография 78
2.2.3.Количественное определение отдельных биологически активных веществ 79
2.2.3.1. Вещества первичного обмена 79
2.2.3.2. Вторичные метаболиты . 79
2.2.3.3. Экстрактивные вещества 80
2.3. Методы морфолого-анатомических исследований 81
2.3.1. Макроскопический метод 81
2.3.2. Микроскопический метод 81
2.4 Товароведческий анализ 82
2.5 Методы фармакологических исследований 82
Глава 3. Определение элементного состава травы волдырника ягодного и мягковолосника водяного
3.1. Химические элементы в жизни растений и человека 83
3.2. Атомно-абсорбционный анализ 85
3.3. Рентгенофлуоресцентный анализ 88
3.4. Масс-спектрометрический анализ . 91
Выводы по главе 97
Глава 4. Качественное обнаружение и количественное определение веществ первичного обмена травы волдырника ягодного и мягковолосника водяного
4.1. Углеводы 98
4.1.1. Краткая характеристика . 98
4.1.2. Качественное обнаружение и количественное определение. 100
4.1.2.1. Свободные сахара 100
4.1.2.2. Связанные сахара 105
4.2. Аминокислоты . 109
4.2.1. Краткая характеристика . 109
4.2.2. Качественное обнаружение . 110
4.2.3. Количественное определение . 111
4.3. Газо-хромато-масс-спектрометрический анализ природных соединений 121
Выводы по главе 128
Глава 5. Качественное обнаружение и количественное определение экдистероидов и флавоноидов травы волдырника ягодного и мягковолосника водяного
5.1. Качественное обнаружение гидроксикоричных кислот и флавоноидов 130
5.2. Качественное обнаружение экдистероидов 133
5.3. Идентификация отдельных экдистероидов 138
5.4. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений и мажорных экдистероидов143
5.5. Методика количественного определения виценина, экдистерона и полиподина В 153 Выводы по главе 157
Глава 6. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование травы волдырника ягодного и мягковолосника водяного
6.1. Значимость морфолого-анатомических исследований 158
6.2. Морфолого-анатомическое изучение надземных органов волдырника ягодного 159
6.2.1. Выявление морфолого-диагностических признаков 159
6.2.2. Выявление микродиагностических признаков 163
6.2.2.1. Стебель 163
6.2.2.2. Лист 169
6.2.2.3. Чашечка 174
6.2.2.4. Венчик 174
6.3. Морфолого-анатомическое изучение надземных органов мягковолосника водяного 177
6.3.1. Выявление морфолого-диагностических признаков 177
6.3.2. Выявление микродиагностических признаков . 177
6.3.2.1. Стебель 177
6.3.2.2. Лист 181
6.3.2.3. Чашечка 185
6.3.2.4. Венчик 185
6.4. Определение товароведческих показателей . 188
Выводы по главе . 191
Общие выводы 192
Литература 194
Приложение . 220
- Хемотаксономические исследования
- Количественное определение отдельных биологически активных веществ
- Качественное обнаружение и количественное определение
- ВЭЖХ-анализ фенольных соединений и мажорных экдистероидов
Хемотаксономические исследования
Результаты исследования сапонинов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот отдельных видов и родов семейства послужили основанием для некоторых выводов хемотаксономического характера в рамках системы Энглера, принятой во флоре СССР [2]. Анализ осуществлен на основании исследований 220 видов из 40 родов семейства [45]. Общими веществами для исследованных видов, кроме родов Paronychia и Herniaria, являлись производными апигенина, лютеолина в виде их С- и О-С-гликозидов и гипсогениновые гликозиды. Виды родов Paronychia и Herniaria резко отличаются от остальных исследованных видов содержанием окси-кумаринов, флавонолов и сапонинов производных квилаевой кислоты. Подсемейства Alsinoideae и Silenoideae по составу флавоновых гликозидов и других фенольных соединений стоят ближе друг к другу, чем к подсемейству Paronychioideae, хотя многосемянные роды последнего (Sperula, Spergularia, Alsine, Telephium, Polycarpon) также близки к подсемейству Alsinoideae. Только роды Paronychia, Herniaria и, по-видимому, род Pteranthus по химическому составу располагаются изолированно. Более подробно в хемотаксономическом отношении изучен род Gypsophila (47 видов или 67% видов рода). Анализу подвергнуты производные гидроксикоричных кислот, флавоноидные гликозиды и агликоны. Показано, что кофейная кислота и её депсиноиды находятся в большинстве видов, а n-оксикоричная кислота и её производные - в ограниченном числе. Антагонистический характер распространения этих кислот позволяет по нарастанию последней расположить ряды в секции Eugypsophila в более естественной последовательности, чем принято во флоре СССР. В секции Grandiflorae три вида содержат гликозиды апигенина и лютеолина, а три других – только гликозиды апигенина, что в соответствии с морфолого-географическими признаками позволяет выделить два ряда видов. Анализ рода гвоздика показал, что в большинстве видов преобладают апигениновые гликозиды, затем следуют лютеолиновые, кемпферольные, хризериольные и кверцетиновые. Однако общее распределение флавоновых и флавонольных гликозидов весьма неравномерное, что может служить важным химическим признаком в хемотаксономии рода и семейства [45]. Позже появились сообщения о гвоздичных, из которых выделены многие флавоноиды, оказавшиеся структурно идентичными выделенным ранее или отличавшимся незначительно. Эти исследования подтверждали ранее сформулированный вывод о том, что систематическая и химическая интерпретация системы гвоздичных в ряде случаев сходны, поэтому учитывая химическую обособленность подсемейства Paronychioideae, на данной стадии изучения в семействе гвоздичных следует различать три подсемейства Alsinoideae, Silenoideae и Paronychioideae [45]. Кроме того, в настоящее время полифенольные соединения исследованы в 1/5 всех гвоздичных мировой флоры и возможны только предварительные выводы о степени химической и систематической корреляции в его таксонах.
В связи с чем для углубленных исследований нами выбраны отдельные представители подсемейств Alsinoideae и Silenoideae.
Виды семейства гвоздичных широко распространены во флоре России и не удивительно, что многие из них издавна используются в традиционной медицине в качестве лекарственных средств. Из анализа литературных данных следует, что большинство исследуемых родов либо представлено большим разнообразием видов, например, Stellaria, Silene, Dianthus и др., либо эти растения отличаются заметной токсичностью и часто встречаются в посевах, что и обусловило внимание к ним, например, Agrostemma, Vaccaria, либо, наконец, эти виды обладают заметно выраженным физиологическим действием, как Herniaria, Saponaria и др.
По характеру оказываемых эффектов гвоздичные, в основном, обладают отхаркивающим, противовоспалительным, мягчительным, кровоостанавливающим, мочегонным, успокаивающим и другими видами действия. Предварительным фармакологическим изучением без знания природы действующих веществ было обнаружено весьма интересное маточное действие Coronaria flos-cuculi, которое при полной нетоксичности по силе действия приближается к спорынье. Аналогичный эффект обнаружен и в видах гвоздики, куколе, смолёвке татарской [45].
Второе направление фармакологических исследований тесно связывается с определенными БАВ видов семейства, например, с сапонинами, которыми они богаты. А.Д. Туровой было выдвинуто предположение, что сапонины могут быть использованы для лечения экспериментального атеросклероза [56]. По данным А.Д. Туровой и А.С. Гладких [144], сапонины качима метёльчатого и тихоокеанского обнаруживают противосудорожное и антитоксическое действие, чётко заметные на фоне отравления животных стрихнином. Они оказывают седативное действие на центральную нервную систему, снижают уровень холестерина в крови. Экспериментальные и клинические исследования смолёвки широколистной показали, что сапонины приводят к норме пониженную кислотность желудочного сока и проявляют лечебное действие при гастрите [83]. Подобное влияние на желудочно- кишечный тракт оказывают и препараты смолёвки брагуйской, обладающие, кроме того, тонизирующим и болеутоляющим, эффектом, а также способностью понижать кровяное давление [106]. Общепринятым лекарственным средством являются настои и отвары корней мыльнянки лекарственной, успешно применяющиеся при кашле, бронхите, а также как слабительное, потогонное и мочегонное [45]. Траву волдырника используют в народной медицине в виде компрессов при волдырях, а ее отвар – как кровоостанавливающее средство при кровотечениях, в частности при геморрое. Спазмолитическое действие грыжника гладкого и его применение для лечения заболеваний почек и мочевого пузыря, вероятно, связано с наличием в нём наряду с сапонинами и кумаринов [81,166,189]. Из флавоноидов был исследован изосапонарин из листьев мыльнянки лекарственной, который обладает тонизирующим и диуретическим, а ориентин, изоориентин - антиоксидантным действием [125].
Разнообразная фармакологическая активность отмечена для многих групп природных соединений и экстрактов отдельных гвоздичных. Так, сумма сапонинов из мыльнянки, агростеммасапонин из куколя проявляют цитотоксическую активность в отношении клеток рабдомиосаркомы [192], экстракт травы мокрицы – на клетках линий Hep G2/C3 A, SK-Hep-1, HA 22T/VGH, Hep 3B и PLC/PRF/5, агростин из куколя – на клетки линии HL-60 (лейкемия) [176]. Сумма сапонинов из мыльнянки активна в отношении вирусов гриппа A/PR/8, 8/Сингапур и А/Гонконг, экстракт грыжника гладкого – вируса гриппа А и герпеса. Экдистероиды из зорьки обыкновенной снижают синдром повышенной вязкости крови [28,68]. Они показаны в лечении инфаркта миокарда и язвенной болезни [45]. Сумма сапонинов из тысячеголова испанского обладает кардиотоническими, а сумма полипептидов – эстрагеноподобными [190,196,238], полисахариды – иммуностимулирующими и противоопухолевыми [210,245], сумма сапонинов из грыжника гладкого – гиперплазивными, экдистероиды – антифунгальными в отношении дерматофитов, экстракт травы гвоздики пышной – трихомонадными и антимутагенными, экстракт зорьки обыкновенной – антикоагулянтными и церебропротективными свойствами [28,68,125]. Экдистероиды смолевки татарской и волдырника ягодного проявляют протективное действие в отношении осмотического и температурного гемолиза, они являются стабилизаторами мембран [45].
Антигипоксическому и антиишемическому действию экдистероидов гвоздичных посвящены исследования А.В. Шулькина с соавторами [71,76,133,157].
Количественное определение отдельных биологически активных веществ
Количественное определение свободных углеводов в траве волдырника и мягковолосника провели ВЭЖХ на изократическом хроматографе «Gilson» (Франция), связанных – методом капиллярного электрофореза с использованием прибора Applied Biosystem 273T.
Количественное определение аминокислот нами осуществлено на аминокислотном анализаторе «Hitachi» (Япония). Суть методики заключается в первоначальном разделении ВЭЖХ аминокислот, содержащихся в водных извлечениях травы волдырника и мягковолосника, с их дальнейшей фотометрической детекцией.
Сравнительный анализ углеводов, аминокислот и других природных соединений нами проведен методом хромато-масс-спектрометрии с использованием газового хроматографа с масс-селективным детектором фирмы Agilent Technologies (США).
Условия проведения анализа следующие: газ-носитель – гелий (1 мл/мин), капиллярная колонка типа НР-5MS (неподвижная фаза: диметилполисилоксан с 5% содержанием фенильных групп), температура термостата колонки в режиме программирования – с 50оС (1 мин) до 300оС (10 мин), 25оС/мин. Детектирование выдерживалось в режиме сканирования ионов 40-800 m/Z, при напряжении на филаменте – 70 В, токе эмиссии – 34,6 А, напряжении на ионном ускорителе +28,3 В, напряжении на электронном умножителе 1576 В.
Чаще всего количественное определение суммы флавоноидов проводят по спектрометрической методике (ее дифференциальный вариант), отдельных флавоноидов – по хромато-спектрофотометрической методике, довольно труднозатратный. Поэтому количественное определение виценина и отдельных экдистероидов (экдистерона и полиподина В) нами проведено методом ВЭЖХ.
Одной из важных характеристик при составлении нормативной документации являются данные об экстрактивных веществах. Их содержание в траве волдырника и мягковолосника определяли следующим образом: около 1,0 г (точная навеска) измельченной травы того или иного растения, просеянной сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 200-250 мл и прибавляли 50 мл 40% спирта этилового. Колбу закрывали пробкой, взвешивали (с погрешностью ± 0,01 г) и оставляли на 1 час. После этого колбу соединяли с обратным холодильником, нагревали и поддерживали слабое кипение на протяжении 2 часов. Затем колбу с содержимым охлаждали, вновь закрывали той же пробкой, взвешивали и потерю в массе восполняли растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 150-200 мл. 25 мл фильтрата пипеткой переносили в предварительно высушенную при температуре 100-105оС до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 7-9 см и выпаривали на водяной бане досуха. Чашку с остатками сушили при температуре 100-105оС до постоянной массы, затем охлаждали в течение 30 минут в эксикаторе, на дне которого находился безводный хлорид кальция, и немедленно взвешивали. Содержание экстрактивных веществ в процентах (Х) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по ниже приведенной формуле:
Небольшое количество анализируемого сырья раскладывали на доску размером 40 см 50 см и внимательно рассматривали в различных положениях невооруженным глазом и под лупой с десятикратным увеличением. Размеры сырья определяли с помощью миллиметровой бумаги. Морфологические особенности отдельных органов изучали на свежем и гербарном материале на 35-50 растениях. Цветки, плоды, листья размачивали в теплой воде и затем помещали в водно-глицериновый раствор на предметное стекло. Для каждого вида сырья проводили 30 измерений по следующим признакам: длина стебля, число междоузлий, длина среднего и нижнего междоузлия, число и длина боковых побегов, длина и ширина стеблевого и прицветного листа, количество и глубина зубцов на листьях – для вегетативных органов; длина соцветия, венчика, трубки венчика, нижней губы, чашечки, зубцов чашечки, тычинки, пестика, плода – для генеративных органов. Рисунки выполнены с натуры. Полученные данные статистически обработаны по общепринятой методике [37,38].
Для изучения особенностей анатомического строения использовали растения среднего габитуса, зафиксированные в 70% спирте этиловом. Для микроскопического анализа готовили временные микропрепараты. Просветление осуществляли 5%-ным раствором натрия гидроксида, разведенного водой (1:1). В качестве включающей жидкости служил глицерин. Выявление одревесневших клеток на срезах проводили окрашиванием 1%-ным раствором сафранина в 50%-ном спирте с последующей промывкой препаратов 50% спиртом этиловым, а затем подкисленным спиртом (на 100 мл спирта добавляли 2 капли кислоты хлористоводородной концентрированной). Одревесневшие клетки окрашивались в красный цвет. Опробковевшие и кутинизированные оболочки клеток выявляли с помощью Судана III. Пробка и кутикула окрашивались в оранжево-розовый цвет [122].
Качественное обнаружение и количественное определение
Сахара в растениях находятся в свободном и связанном виде [20,77,87].
Данные о содержании моносахаридов в свободном и связанном состоянии в траве волдырника ягодного и мягковолосника водяного нами не обнаружены. В связи с чем для их качественного обнаружения поступали следующим образом: навеску сырья массой 1,0 г помещали в пробирку, заливали 5 мл воды очищенной и кипятили на протяжении 5 минут. Извлечения фильтровали через складчатый бумажный фильтр, упаривали до 1-2 мл и использовали для качественных реакций на углеводы и для хроматографирования, которое проводили на хроматографической бумаге марки Ленинградская (производства России) или Filtrak М №4 (производства Германии) в системе растворителей н-спирт бутиловый-уксусная кислота-вода (БУВ) в соотношении 4:1:2 или 4:1:5 в сравнении с достоверными образцами стандартных веществ (арабинозы, ксилозы, галактозы, глюкозы, рамнозы, фруктозы, глюкуроновой и галактуроновой кислот). После обработки хроматограмм анилинфталатным реактивом отметили, что в траве анализируемых растений содержалось несколько сахаров в свободной форме, из которых два по коричнево-жёлтой окраске пятен и значению Rf совпадали с достоверными образцами глюкозы (значение Rf равнялось 0,20) и фруктозы (значение Rf было несколько больше и соответствовало 0,29).
Результаты хроматографирования углеводов в свободной форме обобщены в таблицах 4.1, 4.2 и отражены на рисунках 4.1, 4.2.
Для подтверждения полученных хроматографией на бумаге данных мы провели анализ моносахаридов в свободном состоянии методом прямофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии [49,64,139]. При этом при количественном определении этих веществ 100 мг измельчённого сырья анализируемых видов заливали 1 мл воды очищенной в пробирке с завинчивающейся пробкой, нагревали при 90С до набухания сырья и затем экстрагировали углеводы на протяжении часа при температуре 25С при встряхивании. Полученное извлечение центрифугировали 10 мин при 1400 об/мин. После этого добавляли активированный уголь, встряхивали и снова центрифугировали 10 мин при 1400 об/мин. Аликвоту 20 мл супернатанта анализировали методом прямофазной ВЭЖХ на колонке Luna NH 24,6250 мм или аналогичной с подвижной фазой ацетонитрил-вода в соотношении 70:30 при скорости потока 1 мл/мин при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией. При этом использовали изократический хроматограф Gilson, в состав которого входили насос с аналитической головкой 5 SSC, инжектор с петлёй 20 мкл, колоночный термостат и рефрактометрический детектор.
Свободные сахара в листьях анализируемых растений представлены гексозами глюкозой и фруктозой. В обоих случаях доминировала фруктоза. Её содержание в траве мягковолосника было в 2 раза больше, чем глюкозы; в траве волдырника оно было ещё более значительным (в 3,28 раза). Содержание отдельных свободных сахаров в траве волдырника характеризуется их более высоким накоплением, что обусловливает в нём более значимое общее содержание этих веществ, что, возможно, связано с тем, что волдырник ягодный и мягковолосник водяной относятся к различным подсемействам семейства гвоздичных.
Для анализа связанных сахаров водное извлечение гидролизовали 1 М раствором кислоты хлористоводородной при 100С в течение 2,5 часов. После исчерпывающего гидролиза центрифугировали при 100С 10 минут при 1400 об/мин [49]. К 0,8 мл супернатанта добавляли 7,2 мл воды. 5 мл полученного раствора пропускали через поверхностный концентрирующий патрон (Диасорб С 16). При этом первые 3 мл отбрасывали и собирали 106 следующий 1 мл. К 20 мкл смеси стандартов и исследуемого раствора добавляли 20 мкл раствора внутреннего стандарта (раствор глюкозамина) и упаривали на вакуумированном центрифужном испарителе типа Speevad с подогревом в полипропиленовой пробирке. К высушенной пробе добавляли 20 мкл 0,5 мкл раствора РМР (1-фенил-3-метил-5-пиразолон) в метаноле и 20 мкл раствора натрия гидроксида, тщательно встряхивали на Vortex и термостатировали при 70С на протяжении 2 часов. Пробу нейтрализовали 20 мкл 0,3 М раствором кислоты хлористоводородной и дважды экстрагировали избыток реагента РМР 50 мкл бензола. Остаток упаривали на Speevad с подогревом и растворяли в 500 мкл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:9. Содержание связанных сахаров определяли методом капиллярного электрофореза, используя прибор Applied Biosystem 273Т. Обработку электрофореграмм (рис. 4.5, 4.6) осуществляли с помощью той же программы, что и свободных сахаров. Отношение и расчёт концентрации углеводов проводили по внутреннему (глюкозамин) и внешнему стандарту, содержащему смесь 4 анализированных углеводов в концентрации 1 г/л. Формулы расчётов приведены ниже.
ВЭЖХ-анализ фенольных соединений и мажорных экдистероидов
Виды гвоздичных, как ни одного другого семейства, вызывают интерес как источники важной в медицинском аспекте группы БАС экдистероидов, выполняющих у млекопитающих регуляторные функции и оказывающих разнообразные биологические эффекты [2,10,13,90], в частности анаболический [227], актопротекторный, иммуномодулирующий, антигипергликемический, нейропротекторный, кардиопротекторный [45, 68, 123], антигипоксический, антиишемический [157] и др. [185,209].
Вместе с тем неоднозначно трактуется обнаружение экдистероидов в отдельных видах семейства гвоздичных. Так, их наличие в недалёком прошлом отрицалось в траве мягковолосника [55]. Положительное решение этого вопроса позволит не только более обоснованно обозначить его положение в семействе гвоздичных, но имеет также несомненную практическую значимость, заключающуюся в возможном более осмысленном применении этого растения в медицине.
Подобная ситуация сложилась и для волдырников, в траве которых наличие экдистероидов ставилось не так давно под сомнение [55,68]. Именно из-за этой неопределённости мы избрали эти растения в качестве объектов исследования. Вместе с тем ещё в 1987 году сообщалось о выделении из травы волдырника ягодного доминирующих экдистероидных компонентов, какими оказались экдистерон и полиподин В. Более того, указывалось на наличие других минорных веществ этой группы [48], что в дальнейшем не только подтвердилось, но и отмечалось выделение наряду с экдистероидами других природных соединений. Кроме того, в 2009 году мы сообщили о наличии экдистероидов в траве волдырника японского (Cucubalus japonicus (Miq.) Worosch.), произрастающего в Приморье, на Сахалине и Курильских островах [51].
Сравнительное исследование экдистероидов мягковолосника водяного и волдырников не предпринималось. Тем более не приводились убедительные данные об их обнаружении.
Подготовку проб для качественного обнаружения экдистероидов проводили так, как описано в главе 2. Для их хроматографического анализа использовали ТСХ на пластинках Silufol UV 254. Для хроматографирования приготовили следующие системы растворителей: хлороформ – спирт этиловый в различных соотношениях, в частности, 3:2, 5:1, 3:1 и н-бутанол – кислота уксусная – вода в соотношении 4:1:5 (верхний слой). Довольно чёткие разделения анализируемых соединений наблюдали на хроматограммах с использованием двух последних систем растворителей (рис. 5.3 — 5.6).
Как мы отмечали в главе 2, для обработки хроматограмм использовали 1% раствор ванилина в кислоте серной. После детектирования этим реактивом на хроматограммах наблюдали при дневном свете появление бурых с зеленоватым оттенком пятен, которые флуоресцировали в УФ-свете разной интенсивности голубым с различными оттенками цветом (экдистероиды). Следует отметить, что подобным образом обнаруживались также отдельные фе-нолкарбоновые кислоты, что, возможно, препятствовало детектированию экдистероидов. При выдерживании хроматограмм на протяжении 2-3 суток фенолкарбоновые кислоты обесцвечивались, а экдистероиды (экдистерон, полиподин В и другие) обнаруживались в УФ-свете по светло-лиловой окраске. По-видимому, на основании изложенного обнаружение экдистерои-дов в некоторых видах семейства гвоздичных было затруднительным.
При хроматографировании с использованием ТСХ на пластинах Silufol в траве каждого из анализируемых растений нами выявлено не менее 7-8 соединений экдистероидной природы с преобладанием экдистерона и полиподина В, которые детектировали визуально при сравнении с достоверными веществами отдельных рабочих стандартных образцов (рис. 5.3 — 5.6). Кроме того, для анализа мы использовали траву волдырника японского и показали, что состав экдистероидов травы волдырника ягодного и в. японского (рис. 5.5 и 5.6) если не в полной мере идентичен, то довольно близок [55].
Дальнейшее обнаружение и анализ экдистероидов травы объектов исследования нами проведено ВЭЖХ-МС с использованием жидкостных хроматографов Surveoor MSQ и Waters Aquity UPLC (США). Условия хрома-тографирования изложены в главе 2. Результаты исследований отражены на рисунках 5.8 - 5.12.
Из хроматограммы (рис. 5.7) экдистероидов спиртового извлечения травы мягковолосника следует, что добиться чёткого разделения пиков экди-стероидных соединений не удалось. Возможно, несколько веществ представлены одним растянутым неровным пиком.
Вместе с тем при анализе хроматограммы со временем удерживания 1,48 мин в масс-спектре (рис. 5.8) присутствовал молекулярный ион экдисте-рона 481,57 m/z.
Наличие пиков с m/z 445,05; 303,08; 226,03 позволяет предполагать, что они являются продуктами распада близких по химической природе экдисте-роидов, вероятно, экдистерона, полиподина В, отличающегося от экдисте-рона наличием гидроксильной группы в положении R4 (таблица 1.2), инте-гристерона А, отличающегося от экдистерона наличием гидроксильной группы в положении R1 (таблица 1.2), экдизона, отличающегося от экдисте-рона отсутствием гидроксильной группы в положении R6 (таблица 1.2) и других. В связи с чем обнаружение пиков с m/z 519,82; 562,764 595,68; 651,58; 726,60; 813,70 служит основанием для предположения, что они соответствуют гликозилированным или этерифицированным формам экдистероидов. В известной мере изложенное подтверждается идентифицированными к настоящему времени близкими по химическому строению экдистероидами травы волдырника, представленными экдистероном, 24(28)-экдистероном, 22-дезоксиэкдистероном, 3--О--D-глюкопиранозидом 2,22-дидезокси-экдистерона [55,218].
На основании изложенного идентификация мажорных экдистероидов травы мягковолосника водяного нами предпринята с помощью ВЭЖХ при сопоставлении с временем удерживания эталонных веществ (рабочих стандартных образцов) – экдистерона и полиподина В. Результаты исследований отражены на рисунках 5.13 — 5.19.
В результате исследований нами установлено, что содержание экдисте-рона в спиртовом извлечении травы мягковолосника составляло 0,019%, полиподина В – 0,049%. Концентрации упомянутых веществ нами рассчитаны известным способом по площади пиков.
![Фармакогностическое изучение травы коровяка скипетровидного (Verbascu denseflorum bertol.) [Электронный ресурс]](/i/i/4236/197572.png "Фармакогностическое изучение травы коровяка скипетровидного (Verbascu denseflorum bertol.) [Электронный ресурс] Ахмед М.С. Алкилани")
![Формакогностическое изучение травы тысячелистника широколопастного [Электронный ресурс]](/i/i/4713/201091.png "Формакогностическое изучение травы тысячелистника широколопастного [Электронный ресурс] Глушко Маргарита Петровна")
