Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Растения рода Salvia L., ботаническая характеристика, химический состав, применение 11
1.1 Ботаническая характеристика растений рода Salvia L.. Сравнительная ботаническая характеристика Salvia sclarea L. и Salvia officinalis L 11
1.2 Химический состав некоторых растений рода Salvia L. флоры России 14
1.3 Применение видов рода Salvia L. в научной и народной медицине 38
Выводы по обзору литературы 40
Глава 2. Объекты и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2 Методы исследования биологически активных соединений 43
2.2.1 Качественные реакции 44
2.2.2 Бумажная хроматография 45
2.2.3 Тонкослойная хроматография 46
2.2.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография 47
2.2.5 Газо-жидкостная хроматография 50
2.2.6 Атомно-абсорбционная спектрография 51
2.2.7 Дифференциальная спектрофотометрия 51
2.2.8 Прямая спектрофотометрия 53
2.2.9 Титриметрические методы 55
2.2.10 Методика выделения полисахаридов 56
2.2.11 Изучение моносахаридного состава полисахаридов. 58
2.3 Методы определения норм качества сырья - шалфея мускатного травы . 59
2.4 Фармакологические методы 60
2.5 Интродукционные исследования 61
Глава 3. Фитохимическое исследование шалфея мускатного травы 62
3.1 Изучение эфирного масла шалфея мускатного 62
3.1.1 Получение и изучение динамики накопления эфирного масла 62
3.1.2 Изучение качественного состава эфирного масла методом гжх : 63
3.2 Изучение фенольных соединений шалфея мускатного травы 69
3.2.1 Идентификация фенольных соединений методом бумажной и тонкослойной хроматографии 69
3.2.2 Идентификация фенольных соединений методом ВЭЖХ.. 72
3.2.3 Количественное определение суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии 75
3.2.4 Количественное определение фенолкарбоновых кислот методом прямой спектрофотометрии 77
3.3 Изучение качественного состава и количественного содержания тритерпеновых соединений 80
3.4 Определение количественного содержания и качественный анализ полисахаридов, фракционный состав 83-
3.5 Определение количественного содержания дубильных веществ.. 84
3.6 Изучение качественного состава и количественного содержания органических кислот в траве шалфея мускатного 85
3.7 Изучение аминокислотного состава травы шалфея мускатного . 87
3.8 Изучение элементного состава травы шалфея мускатного 88
Выводы по главе 90
Глава 4. Интродукционные исследования шалфея мускатного в условиях Ставропольского края 92
4.1 Характеристика сортов шалфея мускатного 92
4.2 Характеристика климатических условий Ставропольского края. 93
4.3 Изучение лабораторной и грунтовой всхожести семян шалфея мускатного 94
4.4 Изучение фенологических фаз развития шалфея мускатного условиях Ставропольского края 97
4.5 Определение оптимальных сроков заготовки сырья — шалфея мускатного травы 109
Выводы по главе 111
Глава 5. Разработка норм качества шалфея мускатного травы 112
5.1 Внешние признаки сырья 112
5.2 Микроскопические признаки сырья 114
5.3 Качественные реакции. Установление подлинности сырья методом тонкослойной хроматографии 124
5.4 Установление норм качества сырья по содержанию действующих веществ 125
5.4.1 Количественное определение эфирного масла 125
5.4.2 Разработка и валидационная оценка методики определения количественного содержания суммы флавоноидов 125
5.5 Числовые показатели сырья 131
5.6 Определение микробиологической чистоты. Изучение стабильности шалфея мускатного травы при хранении 134
5.7 Изучение острой токсичности и противовоспалительной активности настоя шалфея мускатного травы 138
5.7.1 Определение острой токсичности 138
5.7.2 Изучение противовоспалительной активности настоя шалфея мускатного травы 139
Выводы по главе 140
Общие выводы 141
Список литературы 143
Приложения 157
- Химический состав некоторых растений рода Salvia L. флоры России
- Высокоэффективная жидкостная хроматография
- Идентификация фенольных соединений методом бумажной и тонкослойной хроматографии
- Изучение лабораторной и грунтовой всхожести семян шалфея мускатного
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из приоритетных методов поиска новых источников биологически активных соединений является принцип филогенетического родства. Большой интерес с точки зрения практического использования в медицине представляют виды рода Salvia L. (Шалфей)і В Государственную фармакопею XI издания включен только шалфей лекарственный, препараты из листьев ь которого применяются в качестве противовоспалительных и антисептических средств при заболеваниях верхних дыхательных путей. Трава шалфея эфиопского входит в состав сбора М.Н. Здренко, применяемого при некоторых опухолевых заболеваниях, анацидном гастрите, язве. Однако многие виды рода Salvia L. еще недостаточно изучены и не востребованы для медицинского использования. Одним из» перспективных и малоизученных растений является шалфей мускатный (Salvia sclarea L.). Ценным и дорогим на мировом рынке является эфирное масло соцветий шалфея мускатного, которое используется в парфюмерии как фиксатор запаха, заменяющий мускус и амбру, в пищевой промышленности для придания* винам аромата муската [43, 48, 65, 73]. Эфирное масло шалфея мускатного ранее было включено в ГФ VIII издания, в настоящее время входит в Европейскую фармакопею [106], используется в фармацевтической и косметической промышленности как ароматическое, антисептическое, противогрибковое, дезодорируещее средство в составе ранозаживляющих бальзамов, ополаскивателей и зубных паст. Кубовой остаток после выделения эфирного масла используют для получения «Салмуса» - концентрата шалфея мускатного, который с 1985 года был внесен в Реестр лекарственных средств и рекомендован к применению в бальнеологической практике при заболеваниях периферической нервной системы (полиневриты, радикулит), опорно-двигательного аппарата (ревматоидный артрит, остеоартроз) [47,67]. В настоящее время «Салмус» выпускается на Украине и в Молдове. Однако шалфей мускатный представляет интерес массивной надземной частью, которая, помимо соцветий, остается невостребованной.
В народной медицине широко используют настой из листьев и травы шалфея мускатного в,качестве спазмолитического, противовоспалительного, антимикробного и мочегонного средства при почечнокаменной болезни, как полоскание при стоматитах и катарах верхних дыхательных путей [19, 43, 65, 77].
Таким образом, обоснование возможности применения травы шалфея мускатного в медицине, наряду с соцветиями, является актуальным, так как будет решена проблема комплексного и рационального-использования всей надземной части растения.
Для создания препаратов на основе травы шалфея мускатного имеются объективные предпосылки в плане сырьевой базы, так как данное растение культивируется во многих странах мира, в том числе в Российской Федерации в Краснодарском крае, где районированы селекционные образцы - «В-24», «Татьяна». Исследования по интродукции эфирномасличных растений в новые районы возделывания в, настоящее время достаточно востребованы.
Таким образом, фармакогностическое изучение травы шалфея мускатного для обоснования возможности комплексного использования растения и разработки лекарственных препаратов на его основе, является актуальной современной проблемой и определяет цели и задачи настоящего исследования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось фармакогностическое изучение шалфея мускатного травы, обоснование возможности комплексного использования сырья для получения лекарственных средств и разработка нормативной документации (НД) на шалфея мускатного траву.
В задачи исследования входило:
Проведение общего фитохимического анализа надземной части шалфея мускатного с целью выявления основных групп БАС.
Изучение качественного состава и количественного содержания доминирующих групп БАС надземной части шалфея мускатного.
Изучение возможности культивирования шалфея мускатного в условиях Ставропольского края.
Разработка проекта нормативной документации (ФСП) на сырье и инструкции по сбору и сушке шалфея мускатного травы.
Определение острой токсичности и противовоспалительной активности настоя шалфея4- мускатного травы в сравнении с настоем шалфея.лекарственного листьев.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Проведен фитохимический анализ одного * неселекционного и двух селекционных образцов шалфея мускатного: «Популяция 4-79» и «Татьяна», интродуцированных в условиях Ставропольского края. Определено количественное содержание основных групп БАС: эфирного масла (0,19-0,38%), флавоноидов в пересчете на цинарозид (1,63-2,37%), фенолкарбоновых кислот в пересчете на' кислоту галловую (2,13-2,36%), тритерпеновых соединений в пересчете на кислоту урсоловую (0,78-1,44%), дубильных веществ в пересчете на танин (8,66-11,17%), органических кислот в пересчете на кислоту яблочную (1,21-1,43%). Проведено выделение фракций полисахаридов и изучен их моносахаридный состав.
Методом ВЭЖХ в надземной части шалфея мускатного было идентифицировано 15 соединений фенольной природы: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая и розмариновая кислоты, цинарозид, рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, кемпферол, апигенин, танин, умбеллиферон, кумарин. Из них впервые были идентифицированы: флавоноиды: дигидрокверцетин, рутин; фенолкарбоновые кислоты: галловая, цикориевая и феруловая; кумарины: кумарин, умбеллиферон.
Методом ГЖХ был изучен качественный состав эфирного масла соцветий и травы шалфея мускатного. С помощью стандартных веществ во всех образцах масел идентифицированы, линалоол, линалилацетат, гераниол, цитраль, терпинеол.
Изучена динамика накопления эфирного масла^ и флавоноидов^ по органам растения- и фазам вегетации.
Проведены предварительные скрининговые испытания по изучению противовоспалительной- активности и острой токсичности настоя травы шалфея мускатного.
В эксперименте на животных впервые установлено, что настой травы шалфея мускатного является малоопасным лекарственным1 средством (bD5o>240 мл/кг) и. проявляет противовоспалительное действие,, более выраженное, чем настой листьев шалфея лекарственного.
В- результате интродукционных исследований, изучены, посевные качества семян сорта «Татьяна» шалфея мускатного (лабораторная' и грунтовая всхожесть), сроки наступления фенологических фаз, урожайность надземной- массы и семенная, продуктивность. Определены, оптимальные-сроки заготовки, условия сушки* и срок годности сырья.
Практическая значимость результатов исследования. Установлены нормы качества травы, шалфея- мускатного. Разработана методика количественного определения, суммы флавоноидов' в траве шалфея мускатного и проведена ее валидационная оценка.
Результаты фитохимического исследования использованы при разработке проекта ФСП на новый вид лекарственного растительного сырья «Шалфея мускатного трава», который рекомендуется для внедрения в медицинскую практику в качестве противовоспалительного средства.
На основании результатов изучения динамики накопления основных БАС в траве шалфея мускатного, биологических исследований, проведенных при интродукции шалфея мускатного в условиях Ставропольского края, составлена инструкция по сбору и сушке шалфея мускатного травы. /Выполненные интродукционные исследования позволяют сделать вывод о возможности введения в культуру шалфея мускатного («Татьяна») в условиях Ставропольского края с выходом свежей сырьевой массы — травы до 200 ц/га и содержанием эфирного масла до 0,38% взтраве, что^ является важным показателем рентабельности культуры.
Внедрение результатов исследования. По результатам исследований разработана Инструкция по сбору и сушке травы шалфея мускатного, которая одобрена и апробирована в условиях ГНУ «Вознесенская опытная станция» (акт апробации от 10.03.2010 г). Разработаны методики установления норм качества сырьяг — шалфея мускатного травы, которые включены в проект ФСП. Методики анализа апробированы в лаборатории ГУП Ростовской области «Фармацевтический центр» > (акт апробации от ИЛ 1.2009 г.)
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской, государственной фармацевтической академии Росздрава (номер государственнойфегастрации 01200112164).
Положения, выдвигаемые на защиту:
Результаты фитохимического изучения надземной части шалфея мускатного на присутствие и количественное содержание основных групп БАС.
Результаты интродукционных исследований шалфея мускатного в условиях Ставропольского края.
Показатели подлинности и нормы качества шалфея мускатного травы, необходимые для разработки проекта нормативной документации.
Результаты изучения острой токсичности и противовоспалительной активности настоя травы шалфея мускатного
Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждались на ежегодных научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии в 2007-2010 гг. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц и 28 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», раздела «Объекты и методы исследования», трех глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 135 источников, из них 39 иностранных.
Химический состав некоторых растений рода Salvia L. флоры России
Шалфей (Salvia L.), крупнейший род семейства яснотковые (Lamiaceae) включает многие хозяйственно ценные растения — лекарственные, эфирномасличные, жиромасличные, медоносные и декоративные. Род Salvia насчитывает свыше 500 видов. Представители рода распространены в теплоумеренных, субтропических и тропических областях. Центром видового многообразия являются горные области Мексики и Южной Америки, Средиземноморья, Передней и Восточной Азии. Во «Флоре СССР» род Salvia представлен 75 видами [55].
Название рода произошло от латинского слова «salyeo», что означает «лечить, хорошо себя чувствовать», так как многие виды этого рода употребляются как лекарственные. В частности, в официнальной медицине используются листья шалфея- лекарственного — Salvia officinalis L. [23].
Растения рода Salvia представляют собой многолетние травы или полукустарники с цельными-, реже перисторассеченными листьями и верхушечными колосовидными или метельчатыми соцветиями. Листья по форме и характеру расчленения очень разнообразные, более или менее густо опушённые, очень редко совершенно голые. Чашечка,двугубая, с 3-зубчатой верхней губой и 2-зубчатой нижней. Верхняя губа венчика шлемовидная, почти всегда сдавленная с боков, нижняя- 3-лопастная, с более крупной средней лопастью. Трубка венчика с волосистым кольцом или без него. Тычинки 2, передние, задние редуцированы или их нет. Столбик нитевидный, рыльце двулопастное. Орешки яйцевидные, округлые или иногда почти трехгранные, гладкие: В зависимости от вида, растения рода Salvia можно увидеть растущими на каменистых, глинистых, песчаных, известняковых склонах, в степях, лесах, лугах, зарослях кустарников, лесных опушках, нередко как сорные на пашнях, в садах среди культурных растений [55, 76].
Несмотря на принадлежность Salvia sclarea L. и Salvia officinalis L. к одному семейству и роду, эти растения имеют много отличий в! ботаническом описании (таблица 1) [56, 77 88, 92]. Salvia officinalis L. — встречается исключительно в культуре. В диком виде Salvia sclarea L. встречается в странах Южной Европы, Средней Азии, Причерноморье и на Северном Кавказе. Растет на каменистых глинистых и песчаных склонах, среди кустарников, до среднегорного пояса. Как сорное встречается в садах, на пашнях. Сплошных зарослей данное-растение в природной обстановке нигде не образует, отчего и приходится прибегать к его культуре. Имеются посевные площади в России (Краснодарский край), Украине, Казахстане, Молдове, Киргизии, Франции, Италии, Болгарии. Культивируют шалфей мускатный с целью получения из соцветий эфирного масла и дитерпенового спирта склареола, используемого для синтеза-душистых веществ с запахом амбры [73].
По мнению Победимовой Е.Г., шалфей мускатный требует дополнительного критического изучения и наблюдений за ним в природе. На столь обширной площади распространения шалфей мускатный явно не вполне однороден морфологически, так как развивается в неодинаковых экологических условиях. Растения разных ареалов произрастания отличаются по комплексу незначительных и часто количественных, не наглядных признаков, например большей или меньшей степенью железистости, длинными остроконечиями зубцов чашечки, крупными цветками, их окраской [55]. В Крыму обращает на себя внимание более ксерофитная форма (встречающаяся здесь наряду с типичной формой) с менее крупными размерами частей, значительно большим, часто хлопьевидным опушением стебля и листьев, более мелкими, нередко вниз отогнутыми прицветными листьями [88, 91].
Растения рода Salvia в качестве основных групп биологически активных веществ накапливают компоненты эфирных масел, фенольные соединения, дитерпеновые, тритерпеновые и стероидные соединения, хиноны [29, 64, 66, 87]. С различной степенью детализации изучался компонентный состав у разных видов рода. Сравнительно подробно исследован состав биологически активных соединений таких видов, как S. officinalis, S. tesquicola, S. glutinosa. Для, S. sclarea, S. deserta, S. nemorosa, S. verticillata и S.aethiopis сведений о химическом составе явно недостаточно.
Состав эфирных масел у представителей рода Salvia представлен широким спектром веществ. В литературе имеются сведения» о качественном и количественном составе-эфирных масел более чем для 15 видов. Основные компоненты эфирных масел наиболее распространенных на территории России видов рода Salvia представлены в таблице [7, 12, 20, 41, 65, 83; 89, 96, 107, 108, ПО]. Как следует из таблицы 2, чаще всего встречаются и содержатся в значительных количествах в эфирных маслах видов рода Salvia: 1. Ациклические монотерпены (мирцен, гераниол, линалоол, линалилацетат) 2. Моноциклические терпены (1,8-цинеол, а-терпинеол, лимонен) 3. Бициклические терпены (камфора, борнеол, а- и Р-пинен, камфен, сабинен, а-туйон и Р-туйон) 4. Моноциклические сесквитерпены (гермакрен, гумулен) 5. Бициклические сесквитерпены (кариофиллен, кариофиллен оксид) 6. Трициклические сесквитерпены (а-копаен) 7. Дитерпеновые спирты (склареол, маноол) Состав эфирного масла S. sclarea исследовали многие авторы: СВ. Шевченко, Л.И: Тихомирова, 1973; Х.К. Джумаев и др;, 1989; P:Pitarokili и др., 2002; P.Farkas и др., 2005; D.Fraternale и др., 2005 [89, 96, 108, 109, 110]. С.В.Шевченко и Л.И.Тихомирова изучали качественный и количественный состав эфирных масел дикорастущего и культурного шалфея мускатного, произрастающих на Украине (Крым). Методом газожидкостной хроматографии было установлено, что главными компонентами эфирного масла из соцветий являются,монотерпеновые кислородсодержащие соединения (линалоол, гераниол, линалилацетат и а-терпинеол), в сумме составляющие до 97-98%. Оказалось, что качественный- состав- эфирных масел дикорастущего и культурного шалфея был одинаков, хотя количественное содержание главных компонентов — различно [89].
Х.К.Джумаев с соавторами исследовали компонентный состав масел из соцветий и листьев шалфея мускатного, произрастающего в Узбекистане. В эфирном масле из соцветий было обнаружено методом газо-жидкостной хроматографии до 17 компонентов, главными из которых были линалоол (до-35%), линалилацетат (до 51%), нерол игераниол (6-12%). Эфирное масло из листьев шалфея мускатного состояло из линалоола (38%), кариофиллена (14%) и неидентифицированных сесквитерпеноидов [33, 96].
P.Pitarokili с соавторами с помощью метода хромато-масс-спектроскопии установили, что главными компонентами эфирного масла дикорастущего шалфея мускатного из Греции, являются линалилацетат (19,75-31,05%), линалоол (18,46-30,43%), геранилацетат (4,45-12,10%) и терпинеол (5,08-7,56%) [108].
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Качественный состав эфирного масла шалфея мускатного изучали методомгазо-жидкостной хроматографии; Эксперименты былипроведеньт на базе кафедры аналитической химии и кафедры токсикологической.! химии ПятигорскошРФА..
Метод 1. Хроматографирование;проводили на газовом хроматографе «Цвет-500» с пламенно-ионизационным.: детектором. Эфирное масло (0,5 мкл) и стандартные образцы терпеноидов; (0,5 мкл)? с помощью микрошприца вводили. в испаритель- хроматографа. Условия хроматографирования: колонка длиной 2,4 м;свнутренним.диаметром 0;3 см, заполненная сорбентом; 10% Рёоплекс 400 нашнертоне Super, размер зерна -О-16мкм,температурное:программирование.колонки - от 60 (?5 мин) до? 190?Є (10 мин); со скоростью нагрева 3 град/мищ температура. испарителя и. детектора 220(2, скорость газа-носителя: (азота) — 30 мл/мин, водорода -30 мл/мин, воздуха — 300- мл/мин. Жараллельно» хроматографировали стандартные образцы терпеноидовшроизводства Sigma-Aldrich Єпетіе, Fluka Ghemie:; цитраля, лимонена; линалоола,. а-терпинеола; гераниола; кариофиллена: Качественный- анализ? проводили? посредством., регистрации времен: удерживания:- компонентов исследуемого эфирного маслам и стандартных растворов терпеноидов. Количественное: содержание компонентов определяли методом; внутренней нормализации; для расчета. использовали площадь пиков.
Метод 2. Хроматографирование проводили на газовом хроматографе: «ЛХМ-8МД-5» с пламенно-ионизационным детектором. Эфирное масло (1 мкл): и стандартные образцы терпеноидов (1 мкл) с помощью микрошприца вводили в испаритель хроматографа.- Условия хроматографирования: колонка из нержавеющей стали: длиной 2,0 м с внутренним- диаметром 0,35 см, заполненная сорбентом 15% ПЭГ-6000 на хроматоне NAW,. температура колонки — 140С, температура, испарителя и детектора 200G, скорость газа-носителя (азота) - 30 см /мин, водорода - 30 . см/мин,, воздуха — 300 см/мин. Параллельно хроматографировали стандартные образцы терпеноидов:производства Sigma-Aldrich Chemie, Fluka Chemie: цитраля лимонена, линалоола а-терпинеола-. гераниола, кариофилленаї Качественныш анализ проводили посредством регистрации времен удерживания компонентов» исследуемого эфирного; масла и. стандартных растворов? терпеноидов; Количественное содержание компонентов? определяли методом: внутренней нормализации, для расчета использовали площадьпиков.
Определение содержания, макро- и микроэлементов в надземной; части шалфея мускатного: проводили; с использованием? эмиссионного спектрального анализам (метод испарениям из кратера; угольного- электрода) в:. испытательнош лаборатории; (филиал) спектрального- анализа ФЕУ . «Пятигорский центр стандартизации, метрологии и сертификации» [26]і Анализируемые пробы высушивали,, измельчали, сжигалш и подвергали озолению в муфельнош печи: прш температуре 450 - 500?С при доступе воздухш в течение 2 часов. Полученную золу после охлаждения; в; . эксикаторе: взвешивали на аналитических весах: и: анализировали? на.. дифракционном спектрографе ДФС-8-1 (Россия). Идентификацию спектрограмм проводили с помощью спектральных линийс w спектров-стандартов с погрешностью не более 2% в пересчете на золу.. 2.2.7 Дифференциальная спектрофотометрияі Метод дифференциальной , спектрофотометрии использовали для количественного определения . суммы флавоноидов в траве шалфея мускатного по разработанной нами методике (гл. 5, п. 5:4.2) [28]; Методика количественного определения суммы флавоноидов. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера, частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм.. Около 1,0 г (точная; навеска) . измельченного сырья помещают в; коническую5 колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл спирта этилового 70%, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный спиртом этиловым 70%, в мерную колбу на 100 мл. Осадок вместе с фильтром еще раз экстрагируют спиртом этиловым 70% в аналогичных условиях. После охлаждения- полученное извлечение фильтруют в ту же мерную колбу на 100 мл, доводят спиртом этиловым 70% до метки и перемешивают. В мерную колбу вместимостью 25 мл переносят 5 мл полученного извлечения, прибавляют 8 мл 2% спиртового раствора алюминия(Ш) хлорида и 0,1 мл кислоты уксусной-разведенной, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% и перемешивают. Через 40 мин измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10імм. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 5 мл- извлечения и ОД мл кислоты уксусной разведенной, доведенный до метки спиртом этиловым 96% в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле: где А - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 400 нм; 145 - удельный показатель поглощения раствора цинарозида в среде кислоты уксусной с 2% спиртовым раствором алюминия(Ш) хлорида; а - масса сырья, г; В — потеря в массе при высушивании сырья, %. Для получения достоверных результатов спектрофотометрическая методика количественного определения суммы флавоноидов (см. гл. 5, п.5.4.2.) в шалфея мускатного траве была подвергнута валидационной оценке в соответствии с рекомендациями Международной конференции по гармонизации (ICH) [13, 134] и ОФЄ 424) 115-09 «Валидация аналитических методик» по показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность [4, 14, 15, 16] . Количественное определение фенолкарбонових кислот в траве шалфее мускатного- проводили методом прямой спектрофотометрии по методике, предложенной для стандартизации корневищ иглицы шиповатой [75]. При изучении УФ-спектра поглощения спиртового извлечения из надземной части шалфея мускатного установлено, что. при длине волны 276s HMv наблюдается максимум светопоглощения. В аналогичных условиях при этой же длине волны имеет максимум, и УФ-спектр-раствора галловой кислоты 0,0001%, следовательно, расчет суммы фенолкарбонових кислот при спектрофотометрическом количественном определении можно проводить пересчетена галловую кислоту. Методика количественного определения суммы фенолкарбонових кислот в траве шалфея мускатного. Аналитическую пробу травы шалфея мускатного измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл спирта этилового 50%, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл через складчатый бумажный фильтр и объем раствора доводят спиртом этиловым 50% до метки (раствор А).
Идентификация фенольных соединений методом бумажной и тонкослойной хроматографии
Аналитическую пробу- сырья- измельчали, до» величины частиц, проходящих сквозь, сито с отверстиями размером 2 мм. Около 1,0» г измельченной травы помещали в-коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 70% (в случае идентификации галловой кислоты для приготовления извлечения использовали спирт этиловый 40% и воду) и нагревали на водяной-бане с обратным холодильником-в течение 30 минут. После охлаждения извлечение очищали хлороформом от липофильных веществ в делительной воронке, фильтровали через бумажный фильтр, упаривали и остаток растворяли в 1 мл спирта этилового 90%, полученный раствор использовали для предварительного обнаружения флавоноидов методом бумажной и тонкослойной хроматографии (гл. 2, п. 2.2.2, 2.2.3). В качестве стандартных веществ использовали спиртовые растворы рутина, кверцетина, гиперозида, апигенина, лютеолина, лютеолин-7-глюкозида, гесперидина, галловой, феруловой, кофейной, хлорогеновой и салициловой кислот. Детектирование зон адсорбции флавоноидов проводили в видимом и УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами -парами аммиака, 5%-ными спиртовыми растворами алюминия(Ш) хлорида. Обнаружение фенолкарбоновых кислот осуществляли в УФ-свете до и после обработки парами аммиака и раствором железа(Ш) хлорида.
Галловая кислота была идентифицирована при проведении ТСХ анализа в системе БУВ (4:1:5). Пятно с Rf=0,65-0,67 совпадало с образцом сравнения, которое в УФ-свете имело зеленую окраску, а после обработки парами аммиака - желтую. Методом бумажной и тонкослойной хроматографии с использованием образцов сравнения в спиртовом извлечении шалфея мускатного травы было установлено наличие флавоноидов (рутина, кверцетина и лютеолин-7-глюкозида) и фенолкарбоновых кислот (галловой, хлорогеновой, кофейной и ферул овой кислоты). Следует отметить, что в образцах сырья сорта «Татьяна» рутин не был идентифицирован. Для изучения качественного состава фенольных соединений травы шалфея мускатного использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), отличающийся высокой чувствительностью, точностью (см. гл. 2, п.2.2.4). Результаты ВЭЖХ по методу 1 представлены в таблице 12 и на рисунке 8. Методом ВЭЖХ в надземной части шалфея мускатного обнаружено 15 соединений фенольной природы, которые представлены флавоноидами, фенолокислотами, кумаринами и дубильными веществами (таблица 12). Анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ (метод 1; гл.2, п.212.4) осуществлялся помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм. Как видно из рисунка хроматограммы далеко не все флавоноиды и фенолокислоты имеют в своих УФ-спектрах максимумы.при этой длине волны. Поэтому для достоверной идентификации таких соединений как дигидрокверцетин, кумарин, кемпферол необходимо было продолжить работу по подбору условий хроматографирования. Для этой цели применили метод обращено-фазовой хроматографии (метод 2; гл. 2, п.2.2.4). Детектирование в данном случае осуществляли при различных длинах волн: для идентификации дигидрокверцетина — 280 нм.
Изучение лабораторной и грунтовой всхожести семян шалфея мускатного
В России шалфей мускатный успешно культивируется на территории Краснодарского края, где районированы сорта «Вознесенский-24» («В-24») и «Татьяна». Сорт «В-24» выведен Вознесенским научно-исследовательским институтом эфирно-масличных культур (ВНИИЭМК). Авторы сорта Л.В.Лузина, И.А.Лукьянов, И.И.Кузян. Сорт среднеспелый, засухоустойчивый. Продолжительность вегетационного периода от всходов до технической спелости в первый год вегетации составляет 105-109 дней, от отрастания розетки до технической спелости во второй год жизни 72-78 дней. Период технической спелости 10—12 дней. Зимостойкость средняя, на второй год после перезимовки сохраняется до5 70% растений, ушедших в зиму. Основное достоинство: высокая урожайность, дружное цветение в первый и второй годы жизни и биометрическая выравненность. Урожай соцветий в сумме-за 2 года вегетации составляет 14Д т/га, содержание эфирного масла в соцветиях - 0,25%. Валовойсбор эфирного масла, в сумме за 2 года 35,2 кг/га.
Сорт «Татьяна» создан в ГНУ «Вознесенская опытная станция». Основными задачами при создании сорта ставились: увеличение урожая сырья, семян и выхода эфирного масла с единицы площади посева. Содержание эфирного масла в сырье сорта «Татьяна» выше, чем у контрольного сорта «В-24» в среднем на 45%. Урожай семян на участках размножения сорта составляет 1-2 ц/га. Сорт двулетний, среднеспелый с вегетационным периодом до технической спелости 124 дня. Урожай соцветий зависит от плодородия почвы, и за годы испытаний колебался в зависимости от места произрастания от 50 до 82 ц/га в условиях Краснодарского края, что определяло и колебания в сборе эфирного масла от 16 до 33 кг/га.
Однако для удовлетворения растущей потребности медицины» в препаратах растительного происхождения необходимо расширять районы культивирования лекарственных растений.
Шалфей мускатный, (сорт «Популяция 4-79») успешно проходит интродукцию с 2002 года на экспериментальном участке лаборатории лекарственных растений Ставропольского НИИ сельского хозяйства, где разрабатываются приемы- его культивирования в условиях зоны неустойчивого увлажнения Ставропольского края. Сорт был получен селекционерами путем отбора из, гибридных популяций украинских и краснодарских коллекционных образцов.
Наши исследования в период 2007 - 2009 гг. были посвящены вопросу выращивания шалфея мускатного в условиях Ставропольского1 края- на опытно-исследовательском участке в Ботаническом, саду ПятГФА (г. Пятигорск) и пришкольном участке КСОШ №1 (с. Кочубеевское). Два района интродукции были выбраны нами для сравнительного анализа. всхожести семян, урожайности надземной массы и семян, биометрических показателей растений, количественного содержания основных БАС у растений, выращенных в разных климатических условиях.
Климат в городе Пятигорске умеренно-континентальный, с умеренным количеством осадков, около 500 мм в год, главным образом в апреле -октябре, наибольшая относительная влажность в декабре (80%), наименьшая - в июле (54%). Зима умеренно мягкая, длится» 2-3 месяца, средняя температура января -5С (иногда до -15С ). На Кавказских Минеральных Водах (КМВ) господствуют восточные и юго-восточные ветры, средняя скорость которых составляет 2,5-10 м/с. Весна ранняя, прохладная, с частыми дождями и туманами. Средняя температура воздуха в апреле +8С, в мае +15С. Погода летом теплая, сухая. Средняя температура июля +22С. Осень теплая, сухая, продолжительная, первые заморозки появляются в середине октября. Средняя температура воздуха в сентябре - +16С, в октябре +10С, в ноябре +2,5С. Средняя-продолжительность безморозного периода 169 дней.
Кочубеевский район, расположен в степной зоне Ставропольского края. Климат умеренно-континентальный, с умеренным количеством осадков (около 350-400 !мм в год), наибольшая относительная влажность в декабре -70-75%, наименьшая в августе - 40-45%. Среднегодовые температуры практически сходны с температурами города Пятигорска. В степных районах господствуют западные и восточные ветры, средняя скорость которых составляет 5—10 м/с, иногда до 25 м/с.
Годы проведения эксперимента были различными по климатическим условиям, и соответственно это позволило получить более полную картину реакции растений на температуру и количество осадков.
Период 2007-2008- г.г. характеризовался холодной зимой (температурный минимум в феврале -26С), высоким и длительным снежным покровом, чрезмерно жарким, засушливым летом с минимальным количеством осадков, (температурный максимум июля +ЗбС). Период 2008-2009 г.г. характеризовался теплой; непродолжительной зимой (температурный минимум в феврале -21 С), теплой ранней, весной (конец марта +8С), теплым летом с большим количеством дождей; средняя температура июля +26С.
Для посева были использованы семена — сорта «Татьяна», предоставленные ГНУ «Вознесенская опытная станция». Семена шалфея мускатного по форме обратнояйцевидные или эллиптические, на верхушке округлые, при основании слегка трехгранные, 2,8-3,0 мм длиной и 1,9-2,1 мм шириной. Окраска семян - бурая, темно-коричневая. Масса 1000 шт. семян -3,8-4,3 г (массу семян определяли путем 5-ти измерений на аптечных весах). При изучении вопросов интродукции применяли общепринятые методики [6, 49].
Для определения качества, жизнеспособности семян используется показатель их лабораторной всхожести, поэтому на начальном этапе исследования, была изучена лабораторная всхожесть семян и влияние сроков хранения семян на всхожесть. Анализировали образцы семян урожая 2007 года, которые подсушивали, затем хранили в течение 2-х лет в бумажных пакетах в условиях лаборатории, при температуре 18-24С и относительной влажности воздуха 30-50%. Проращивание вели в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге при температуре 20±2С, число семян в каждой чашке 100 шт. При этом учитывали день начала прорастания и всхожесть на 10-й день после начала прорастания (таблица 25).
