Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние фармакогностических исследований растений рода brassica L . 10
1.1 Характеристика рода Brassica L. и вида рапс обыкновенный (Brassica napus L.) 10
1.2 Сведения о химическом составе рапса обыкновенного 14
1.2.1 Кверцетин 15
1.2.2 Кемпферол 16
1.2.3 Изорамнетин 17
1.2.4 Глюкозинолаты 17
1.2.5 Индольные соединения
1.3 Использование в медицине 24
1.4 Хозяйственное значение рапса обыкновенного 26
1.5 Физико-химические методы в анализе БАВ
1.5.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография 28
1.5.2 Капиллярный электрофорез 31
1.5.3 ИК-Фурье спектроскопия 36
Выводы по обзору литературы 38
Глава 2. Морфолого-анатомическая характеристика травы рапса обыкновенного. Определение числовых показателей 39
2.1. Морфологическая характеристика травы рапса 39
2.2 Анатомо-морфологическое изучение травы рапса 40
2.3 Определение числовых показателей рапса 47
2.4 Испытание на микробиологическую чистоту 56
2.5 Определение содержания тяжелых металлов 57
2.6 Определение содержания радионуклидов 58
Выводы по главе 2 59
ГЛАВА 3. Изучение химического состава травы рапса обыкновенного 60
3.1 Качественное определение флавоноидов 60
3.2 Определение степени гликозилирования флавоноидов 61
3.3 Идентификация и количественное определение флавоноидов рапса обыкновенного 66
3.4 Идентификация и количественное определение индол-3-карбинола 71
3.5 Изучение углеводного состава рапса обыкновенного 74
3.6 Использование метода ИК-спектроскопии для экспресс-идентификации растительного сырья 81
Выводы по главе 3 89
Глава 4 Стандартизация травы рапса обыкновенного 90
4.1. Испытание на подлинность для цельного и измельченного сырья 90
4.1.1. Внешние признаки 90
4.1.2. Микроскопия 91
4.1.3. Качественные реакции. Хроматографические и электрофоретические пробы 91
4.2. Числовые показатели для цельного и измельченного сырья 92
4.2.1. Содержание фармакологически активных веществ 92
4.2.1.1. Методика количественное определение производных кемпферола методом ВЭЖХ в траве рапса обыкновенного 92
4.2.1.2. Методика количественное определение индол-3-карбинола методом капиллярного электрофореза в траве рапса обыкновенного 103
4.2.2. Определение потери в массе при высушивании 111
4.2.3. Общая зола 112
4.2.4. Определение золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты 112
4.3 Микробиологическая чистота 113
4.4. Определение срока годности травы рапса обыкновенного 120
Выводы по главе 4 135
Глава 5. Первичная фармакологическая оценка извлечения, полученного из травы рапса 136
5.1 Нефропротекторное действие 136
5.2 Определение острой токсичности 139
Выводы по главе 5 142
Заключение 143
Список литературы
- Кемпферол
- Анатомо-морфологическое изучение травы рапса
- Идентификация и количественное определение индол-3-карбинола
- Числовые показатели для цельного и измельченного сырья
Кемпферол
Род Капуста – Brassica L. насчитывает более 150 видов и принадлежит к отделу Magnoliophyta, классу Magnoliopsida, подклассу Dilleniidae, надпорядку Violanae, порядку Capparales, подпорядку Capparineae, семейству Brassicaceae, трибе Brassiceae [78].
В трибу Brassiceae включены рода Sinapis (горчица), Rhaphanus (редька), Eruca (руккола), виды которых хорошо известны как пищевые и лекарственные растения [78].
Многие исследователи, начиная с Ч. Дарвина, считают, что все существующие в настоящее время культурные формы капусты происходят от дикорастущей формы капусты огородной (Brassica oleracea L.), другие – от рассматриваемого в качестве самостоятельного вида капусты лесной (Brassica sylvestris), третьи связывают их с целым рядом средиземноморских видов. Ни одно растение в течение нескольких тысячелетий не дало человеку столь обширного материала для отбора, как капуста [24].
Особый интерес для генетиков представляет происхождение рапса. В диком виде это растение не встречается, в культуре было известно за 4 тысячи лет до н.э. Рапс произошёл от скрещивания капусты полевой или сурепицы (Brassica campestris) с капустой огородной (Brassica oleracea) [24].
Наибольшей популярностью пользуется капуста огородная, множество форм и сортов которой возделывают на всех континентах. Из них капуста кочанная – основное пищевое растение стран умеренных широт. Неоспоримы вкусовые качества таких сортов, как кольраби, цветной капусты и ее разновидности брокколи. Многие местные сорта особо предпочитаются населением отдельных стран. Так, одними из древнейших культурных растений, возделываемых в Китае и Япо нии, являются капуста китайская (В. chinensis) и капуста пекинская (В. pekinensis) [67].
Как овощные растения среди капустных широко известны также различные сорта редьки и редиса (Raphanus sativus L.), как острые приправы – хрен обыкновенный (Armoracia rusticana L.) и горчица сарептская (Brassica juncea L.). Одной из возделываемых садово-огородных культур является кресс-салат, в больших масштабах выращиваемый на Кавказе. В качестве салата употребляют также ряд дикорастущих капустных, как, например, сурепица, или сурепка, обыкновенная (Barbarea vulgaris L.), жеруха (Nasturtium officinale L.) и многие другие, а сумочник пастуший, или пастушью сумку (Capsella bursa-pastoris L.) уже более 100 лет в Китае разводят как овощ. [64].
Такие ценные кормовые растения, как брюква (Brassica napus var. napobrassica), репа и турнепс (Brassica rара L.), также принадлежат к капустным. Кроме того, в качестве зеленых кормов высевают кормовую капусту и рапс.
Горчица сарептская (Brassica juncea L.) и редька черная (Raphanus sativus L.) давно используются в научной фармацевтической практике и уже включены в фармакопеи Китая и Японии.
Большое хозяйственное значение имеет ряд возделываемых масличных культур. Из них в умеренных широтах наиболее урожайное масличное растение – рапс, семена которого содержат до 50% масла. Оно имеет сугубо техническое применение – его используют при закалке сталей, после специальной обработки оно хорошо вулканизируется, образуя каучукообразную массу (фактис), которую применяют для смягчения твердых каучуков.
Существуют две разновидности рапса: яровой и озимый. Резких морфологических различий между обеими формами рапса нет.
Рапс – однолетнее растение. Корень стержневой, веретеновидный, утолщённый в верхней части, разветвлённый. Основная часть разветвлённых корней сосредоточена на глубине 20-45 см, но к периоду созревания семян может распространяться и в горизонтальном направлении. Толщина корня до 3 см, он проникает в почву до 3 м у рапса озимого и до 2 м у ярового. Стебель прямостоячий, ок-11 руглый, разветвлённый с 12-25 ветвями первого и последующего порядков. Высота стебля 60-190 см, толщина 0,8-3,5 см. Окраска стебля зелёная, тёмно-зелёная, сизо-зелёная, он покрыт восковым налётом. Листья очерёдные, черешковые, в нижней части стебля лировидно-перистонадрезанные с овальной или округлой тупой верхней долей, иногда слабоволнистой, образуют компактную прикорневую розетку; средние листья – удлинённо-копьевидные; верхние – удлинённо-ланцетные, сидячие, цельнокрайние с расширенным основанием, на 13-23. Поэтому рапс легко отличить от других представителей рода Капуста. Листья сине-зелёные или фиолетовые, неопушённые или слегка волосистые с восковым налётом. Различаются сильно-облиственные и слабо-облиственные формы. Цветки собраны в кистевидные (щитковидные) рыхлые соцветия. Цветок с четырьмя жёлтыми лепестками и эллиптически-яйцевидными чашелистиками, цветоножкой, шестью тычинками (из которых две наружные короче внутренних) и одним пестиком с головчатым рыльцем. У основания коротких тычинок расположены два нектарника. Завязь верхняя, двугнёздная, с 20-40 семяпочками. Плод – узкий прямой или слегка согнутый стручок, расположенный под прямым или тупым углом по отношению к стеблю, длиной 6-12 см, шириной 0,4-0,6 см. Створки стручка гладкие или слабо-бугорчатые. По длине стручка проходит плёнчатая перегородка, заканчивающаяся в бессемянном носике. В стручке 25-30 семян округло-шаровидной формы, слегка ячеистых, серовато-чёрной, чёрно-сизой или тёмно-коричневой окраски. Семена очень мелкие, диаметр семени 0,9-2,2 мм, масса 1000 семян 2,5-5 г у рапса ярового и 4-7 г у озимого. Семена сохраняют всхожесть 5-6 лет [5, 36, 69, 70].
Анатомо-морфологическое изучение травы рапса
Содержание тяжелых металлов определяли по методике ГФ XII издания в зольном остатке после сжигания сырья.
Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не превышала окраски эталонного раствора, что свидетельствует о соответствии всех образцов сырья по содержанию тяжелых металлов требованиям ГФ XII.
Значения пределов допустимого содержания тяжелых металлов не должны превышать уровня их допустимого содержания в БАД растительного происхождения, согласно действующему СанПин [23, 61, 71].
Концентрации тяжелых металлов (свинца, кадмия и ртути) в сырье определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии по методике ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов» [14]. Результаты исследования представлены в таблице 11.
Анализ показал, что все образцы сырья удовлетворяют требованиям Сан-ПиН 2.3.2 1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2 1280-03 по содержанию кадмия, свинца и ртути. Определение содержания радионуклидов Подготовка счетных образцов сырья осуществлялась в соответствии с «Методическими рекомендациями по санитарному контролю за содержанием радиоактивных веществ в объектах внешней среды» и ОФС 42-0011-03 «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье. Стронций-90, Цезий-137. Отбор проб, анализ, оценка результатов».
Выделение Стронция-90 проводилось радиохимическим методом с дальнейшим измерением активности на установке РУБ-О1П1. Измерение радионук-лидного состава проб проводилось на полупроводниковом гамма-спектрометре на основе IBM PC-386 [54].
Результаты изучения накопления радионуклидов представлены в таблице 12.
Согласно ОФС 42-0011-03, в растительном сырье нормируется содержание радионуклидов техногенного происхождения, в первую очередь Sr-90 и Cs-137 [54].
C точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1 % Cs-137 и 0,15-0,30 % Sr-90 от допустимого нормативной документацией уровня (Таблица 12).
1. Установлены морфологические признаки, отличающие рапс от других представителей рода Brassica: листья очередные, черешковые, в нижней части стебля лировидно-перистонадрезанные с овальной или округлой тупой верхней долей, иногда слабоволнистой, образуют компактную прикорневую розетку; средние листья – удлиненно-копьевидные; верхние – удлиненно-ланцетные, сидячие, цельнокрайные с расширенным основанием, на 1/3.
2. При микроморфологическом изучении были установлены следующие признаки: клетки верхнего эпидермиса слабо извилистые; нижний эпидермис представлен клетками с более выраженной угловатой извилистостью клеточных стенок; устьица анизоцитного типа, многочисленные на обеих сторонах листа; на поперечном срезе стебля отмечены проводящие коллатеральные пучки открытого типа, пыльца округлая, шиповатая, трехпоровая.
3. Определены основные числовые показатели травы рапса обыкновенного: влажность; содержание золы общей; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной; содержания экстрактивных веществ. Установлено содержание в траве рапса микроорганизмов и тяжелых металлов. Показано, что наибольшее количество экстрактивных веществ извлекается спиртом этиловым 70%. ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ТРАВЫ РА ПСА ОБЫКНОВЕННОГО
При изучении химического состава объектами исследований служили образцы сырья надземной части рапса обыкновенного (см. табл. 1).
Поскольку литературные источники свидетельствуют о значительном содержании флавоноидов в надземной части рапса обыкновенного [102, 104, 108, 122, 134], то на первом этапе целесообразным являлось провести подтверждение наличия данной группы соединений в изучаемых образцах.
Для качественного определения флавоноидов в сырье аналитическую пробу измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 2 г измельченного сырья переносили в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливали 30 мл 70% спирта этилового, присоединяли обратный холодильник и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, после охлаждения извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли дважды в тех же условиях с 30 мл 70% спирта этилового в течение 30 мин. Объём объединённого извлечения доводили 70% спиртом этиловым до метки.
Идентификация и количественное определение индол-3-карбинола
Таким образом, результаты испытания «Линейность» соответствуют критериям приемлемости, что подтверждает пригодность данной методики для количественного определения И3К в широком диапазоне концентраций.
Определение прецизионности методики. _Следующим этапом валидацион-ной оценки было установление прецизионности на уровне сходимости величины стандартного отклонения результатов шести параллельных определений.
Критерий приемлемости: Относительное стандартное отклонение (RSD) результатов количественного определения И3К в траве рапса обыкновенного не должно превышать 3,7%. Процедура анализа:
Для определения сходимости методики количественного определения И3К в траве рапса обыкновенного с использованием образца 1 (серия П-1) готовили испытуемые растворы в шести повторностях согласно пункту «Приготовление испытуемого раствора» раздела 4.2.1.2. Параллельно готовили раствор СО согласно пункту «Приготовление раствора СО И3К» раздела 4.2.1.2. Вводили и ана 107 лизировали последовательно раствор И3К и шесть испытуемых растворов в приведенных условиях.
В результате были получены удовлетворительной результаты по значению сходимости, при этом относительное стандартное отклонение RSD результатов количественного определения И3К в траве рапса обыкновенного не превысило 3,7%, что соответствует критериям приемлемости.
Определение правильности методики. Оценку правильности проводили теми же способами и методами, что и в случае методики количественного определения кемпферола.
Поэтому, учитывая, что содержание И3К в траве рапса обыкновенного должно быть не менее 0,9 %, то значение открываемости для методики его количественного определения находится в пределах от 95 до 105 %. Критерий приемлемости:
Для выполнение эксперимента согласно необходимо использовать такую навеску травы рапса обыкновенного, чтобы содержание определяемого вещества в ней составляло 60% от выбранной согласно методике. Далее осуществлялась добавка кемпферола до его содержания на уровне 80, 100 и 120%.
Далее для определения правильности проводили 9 испытаний на трех выбранных уровнях концентраций (на каждом уровне 3 испытания).
С использованием образца 1 (серия П-1) готовили испытуемые растворы согласно пункту «Приготовление испытуемого раствора» раздела 4.2.1.2. Параллельно готовили раствор СО согласно пункту «Приготовление раствора СО И3К» раздела 4.2.1.2. Вводили и анализировали последовательно раствор И3К и все испытуемые растворы в приведенных условиях.
Таким образом, среднее значение открываемости (Rср) при определении правильности методики количественного определения И3К в траве рапса обыкновенного составляет 99,52 %, при этом значение относительного стандартного отклонения (RSD, %), рассчитанного для открываемости составило 2,65 %, что соответствует заявленным критериям приемлемости.
Данный показатель определяли согласно методике описанной в ГФ XI, ч.1. Для этого точную навеску измельченной травы рапса обыкновенного (около 1г, 6 серий) помещали в предварительно высушенные и взвешенные вместе с крышкой бюксы и ставили в нагретый до 100-105 С сушильный шкаф. Первое взвешивание проводили через 2 часа. Бюксы охлаждали в эксикаторе 30 мин и взвешивали. Высушивание проводили до постоянной массы.
Числовые показатели для цельного и измельченного сырья
Как видно из данных, представленных в таблице 43, введение раствора сулемы привело к развитию острого токсического поражения почек, сопровождающегося выраженной гиперазотемией (увеличение в крови концентрации мочевины и креатинина на 579% и 243% соответственно), стимуляцией интенсивности процессов пероксидации (рост концентрации первичных и вторичных продуктов пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ)) и формированием острой воспалительной реакции в почках (достоверное увеличение по сравнению с интактной группой значения весового индекса почек (ВИП)). Кроме того, у животных контрольной группы отмечали снижение содержания в почках белка на 70%, НК на 37% и концентрации глюкозы в крови на 31%.
Применение извлечения рапса в дозе 200 мг/кг привело к полной нормализации всех изменившихся в условиях острой почечной недостаточности показателей, значительно уменьшив уровень ТБК-активных продуктов в крови на 83% ниже интактного.
Таблица 43 – Влияние извлечения травы рапса на некоторые показатели сыворотки крови и почек при сулемовом нефрозе В группе животных, леченных леспефланом, выявлено достоверное по сравнению с контролем уменьшение уровня мочевины в крови на 72%, креатини-на на 60%, увеличение содержания белка в почках на 178, но эти показатели полностью не восстановились до уровня здоровых животных.
От интактного уровня достоверно не отличались только содержание ТБК-активных продуктов в крови и почках, глюкозы в крови, НК в почках, а изменения значений ВИП и уровня ДК не были достоверными по отношению к контролю.
Из данных, приведенных в таблице 44, видно, что введение животным су лемы сопровождается развитием олигурии (снижение диуреза на 42%), гликозу-рией и протеинурией.
При лечении извлечением из рапса и леспефланом глюкоза определяется в моче, причем в большем количестве в группе референтного препарата. Уровень протеинурии был наименее выраженным при использовании извлечения рапса, применение которого привело к полному восстановлению до уровня здоровых животных этого показателя, в то время как при введении раствора леспефлана этот показатель достоверно превышал норму на 189%, 268% и 479% соответственно.
Для получения суммарных извлечений использовали высушенную в сушилках с искусственным обогревом при температуре 40-500 С, траву рапса (20 см верхушечной части). Извлечения получали методом дигестии – экстракцию сырья проводили водой очищенной, спиртом этиловым 70% 40 минут двукратно. Затем извлечения объединяли, упаривали при пониженном давлении и высушивали при температуре 60±5 С до сухого состояния.
Серию опытов по изучению «острой» токсичности исследуемого сырья и продуктов его переработки проводили методом Кербера [72, 74]. Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах обоего пола, прошедших 10-тидневный карантин. В работе соблюдались правила по содержанию, защите, использованию лабораторных животных, а также рекомендаций из руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [66]. В каждой группе было 6 мышей. Объекты вводили однократно перорально с помощью желудочного зонда. За состоянием животных наблюдали в течение 14 дней. Критериями оценки «острой» токсичности служила картина интоксикации и выживаемости животных, а также состояние внутренних органов. Контролем служили животные, которым перорально вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.
Введение извлечения во всех дозах не сопровождалось изменениями в поведении, объемах потребляемой пищи и воды.
Оценка общего состояния при осмотре животных в руках, в клетке и на открытой площадке показала отсутствие отличий от группы интактных животных по внешнему виду, состоянию волосяного покрова, интенсивности дыхания, тонусу мускулатуры, двигательной активности, координации движения, а также отсутствие любых других отклонений.
Изменений в вышеуказанных характеристиках не было как в первые сутки, так и во время всего остального периода наблюдения. К концу эксперимента (14 сутки) не было отмечено летальных случаев во всех группах животных.
Макроскопическая характеристика внутренних органов по истечению 2-х недель после введения не отличается от интактных животных. Введение максимально технически возможной дозы 7000 мг/кг не привело к гибели ни одного животного в течение двух недель, LD50 5000 мг/кг.(таблица 45).
Результаты данного изучения показывают, что водное и водно-спиртовое извлечения из травы рапса обыкновенного относятся по классификации токсичности H.C. Hodge и L.H. Sterner к 5 классу соединений – практически нетоксичным (значения LD50 во всех случаях более 5000 мг/кг).
