Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Ботаническая и фитохимическая характеристика рода лапчатка potentilla L .
1. Систематика и ботаническая характеристика растений рода Potentilla L. семейства Rosaceae 12
2. Фотохимическая характеристика растений рода Potentilla L 18
2.1 Фитохимическая характеристика некоторых видов лапчатки 18
2.2 Фитохимическая характеристика лапчатки белой 19
3. Биологическая активность соединений и препаратов лапчатки и применение их
в народной и научной медицине 22
3. ІБиологическая активность и применение различных видов лапчатки 22
3.2 Биологические свойства и применение лапчатки белой Potentilla alba L .28
Выводы по обзору литературы 33
Собственные исследования
Глава 2 Оббекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования 34
2.2 Методы исследования 35
2.2.1 Биологические методы 35
2.2.1.1 Метод фенологических наблюдений 35
2.2.2 Методы обнаружения и идентификации биологически активных соединений 36
2.2.2.1 Изготовление извлечений для проведения качественных реакций 36
2.2.2.2 Дубильные вещества 36
2.2.2.3 Аминокислоты 36
2.2.2.4 Фенольные соединения з
2.2.2.5 Полисахариды 37
2.2.2.6 Органические кислоты 38
2.2.3 Хроматографические методы 38
2.2.3.1 Методы тонкослойной и бумажной хроматографии 38
2.2.3.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 41
2.2.4 Спектральные методы 45
2.2.4.1 Эмиссионный спектральный анализ 45
2.2.4.2 УФ-спектрофотометрия 45
2.2.5 Титриметрические методы 47
2.2.6 Гравиметрические методы 48
2.2.7 Фармакологические методы 48
2.3 Микробиологические методы 50
2.4Методы стандартизации сырья 50
2.4.1 Отбор проб для анализа 50
2.4.2 Методы морфолого-анатомического исследования 50
2.4.3 Определение числовых показателей качества сырья 50
2.4.4 Определение сроков хранения сырья 51
2.5 Статистическая обработка данных 51
ГЛАВА 3 Выделение и идентификация биологически активных веществ из корневищ с корнями лапчатки белой
3.1 Выделение и идентификация фенольных соединений 52
3.2 Изучение органических кислот 57
3.3 Изучение полисахаридного состава 59
3.4 Изучение дубильных веществ 62
3.4.1 Количественное определение дубильных веществ 62
3.4.2 Валидация методики УФ-спектрофотометрического определения дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую 64
3.5 Изучение аминокислотного состава 67
З.бИзучение элементного состава 69
Выводы по главе 3 73
ГЛАВА 4 Морфолого-анатомические и товароведческие исследования сырья лапчатки белой
4.1 Морфологические признаки вида 74
4.2Анатомические строение и диагностические признаки лапчатки белой 76
4.2.1 Анатомическое строение подземных органов 76
4.2.2 Анатомическое строение травы 81
4.3 Определение товароведческих показателей 88
Выводы по главе 4 90
ГЛАВА 5 Интродукционные и биологические исследования лапчатки белой
5.1 Изучение онтогенеза лапчатки белой в условиях интродукции 91
5.2 Изучение прироста биомассы лапчатки белой в условиях интродукции 94
5.3 Биологические исследования 98
5.3.1 Определение острой токсичности водно-спиртового извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой 98
Выводы по главе 5 103
Заключение 104
Список литературы 106
- Фитохимическая характеристика некоторых видов лапчатки
- Изготовление извлечений для проведения качественных реакций
- Изучение полисахаридного состава
- Анатомическое строение подземных органов
Фитохимическая характеристика некоторых видов лапчатки
Объектами фитохимического исследования явились корневища с корнями лапчатки белой, интродуцированной на территории Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край).
Интродукционные исследования проводились на территории Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край), Ботаническом саду Кабардино-Балкарского государственного университета (КБГУ) в г. Нальчик и Зольском районе Кабардино-Балкарии.
Почвы Эколого-ботанической станции щелочные, подстилающими породами являются машукские травертины с высоким содержанием кальция. Здесь они представлены предкавказскими чернозёмами. В Зольском районе Кабардино-Балкарской Республики (КБР) распространены кавказские чернозёмы на верхнемеловых известняках. В условиях Ботанического сада КБГУ развиты предкавказские чернозёмы на глинистых сланцах.
Сбор подземных органов интродуцированных растений проводили поздней осенью в период цветения к концу третьего года жизни растения, поскольку именно в этот период происходило формирование значительной подземной биомассы. Очищенные от гнилых частей, отмытые от земли корневища и корни сушили при комнатной температуре методом воздушно-теневой сушки, в помещении с хорошей вентиляцией, разложив на подстилках и периодически перелопачивая. Время между сбором и сушкой не превышало 2 часов. Крупные подземные органы перед сушкой разрезали на части. Сушку считали законченной, когда корневища и корни не гнулись, а ломались при сгибании. После сушки корневища с корнями отсеивали ситом от оставшейся земли и пыли.
Для интродукции лапчатки белой использовался посадочный материал, взятый в естественных условиях произрастания в Липецкой области (Красненский район, деревня Жаркий Верх) и окрестности г. Липецка. В соответствии с рекомендациями Г.К. Смыка с соавторами материнское корневище разделялось на черенки длиной 1-3 см с придаточными корнями и спящими почками. С одного взрослого растения, таким образом, получали от 10 до 50 полноценных черенков. После этого они высаживались непосредственно в грунт во второй половине октября - начале ноября.
Для исследований были заложены 3 участка площадью 10 10 мл на территории Эколого-ботанической станции «Пятигорск» БИН РАН (Ставропольский край), Ботаническом саду Кабардино-Балкарского государственного университета (КБГУ) в г. Нальчик и Зольском районе Кабардино-Балкарии. Ширина междурядий при посадке составляло 40 см, расстояние между растениями в рядах - 20 см. В дальнейшем агротехника выращивания заключалась в двухразовой прополке в течение сезона вегетации и соблюдении полива при продолжительном засушливом периоде. Поскольку внесение минеральных и комплексных удобрений не рекомендуется, для 50% высаженных растений использовалось небольшое внесение перегноя и дальнейшая подкормка биогумусом периодичностью один раз в месяц.
Фенологические наблюдения мы начали сразу после появления первых всходов и продолжали до 2013 г. включительно, применяя известные методики [19,49]. обнаружения и идентификации биологически активных соединений 5,0 измельченного сырья экстрагировали 50 мл воды очищенной или спирта этилового 20%, 40% и 70% путем нагревания с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение часа. Извлечение фильтровали, экстракцию повторяли трижды. Полученные водные и спиртовые извлечения использовали для идентификации биологически активных соединений (БАС) в корневищах с корнями лапчатки белой [51, 89].
К водному извлечению добавляли свежеприготовленный 0,1% водный раствор нингидрина [95] и нагревали. Сине-фиолетовое окрашивание наблюдалось при охлаждении.
Наличие фенольных соединений устанавливали в спиртовых извлечениях из корневищ с корнями лапчатки белой качественными реакциями (цианидиновая проба, с раствором натрия гидроксида и с раствором свинца ацетата) [23] и хроматографическими методами. Использовали восходящую одномерную тонкослойную и бумажную хроматографию в различных системах растворителей:
Для приготовления извлечения к 1 г измельченного растительного сырья добавляли 30 мл 40% спирта этилового, нагревали на водяной бане в течение 45 минут с обратным холодильником. После охлаждения извлечение фильтровали, очищали хлороформом от липофильных веществ в делительной воронке, снова фильтровали через бумажный фильтр, сгущали до получения густого остатка, который растворяли в спирте этиловом 95% и использовали для предварительного обнаружения фенольных соединений методом бумажной и тонкослойной хроматографии [50]. В качестве стандарта использовали растворы рутина, кверцетина, гиперозида, лютеолин-7-гликозида, гесперидина, галловой, феруловой, кофейной и хлорогеновой кислот в 40% этаноле в концентрации 0,5 мг/мл. Пробы наносили объемом по 10 мкл. Высушивали на воздухе в течение 10-15 минут. Детектирование зон адсорбции проводили в видимом и УФ свете до и после обработки хромогенными реактивами - парами аммиака, спиртовым раствором алюминия хлорида и железа хлорида (III) (30 г/л) в 95% спирте этиловом [8, 21].
Изготовление извлечений для проведения качественных реакций
Растительные полимерные фенольные соединения - дубильные вещества -являются перспективными ингибиторами процессов окисления органических веществ наравне со своими мономерными аналогами (фенолкарбоновыми кислотами, флавоноидами), чья антиокислительная активность известна давно и широко исследуется. Хотя антиокислительная способность дубильных веществ мало изучена, что связано, прежде всего, с их сложной химической структурой, тем не менее, данная группа веществ, имея ряд преимуществ перед простыми фенолами (хорошая растворимость в воде и т.д.), может быть во многих случаях разумной альтернативой фенольным антиоксидантам [10].
Дубильные вещества в извлечении из подземных органов лапчатки белой обнаруживали с помощью качественных реакций (табл. 10). Таблица 10 - Результаты проведения качественных реакций на дубильные вещества в водном извлечении из корневищ с корнями лапчатки белой
В результате проведения качественных реакций установлено, что при взаимодействии с 1% раствором желатина появлялась муть, исчезающая от избытка реактива; с 1% раствором антипирина выпадал аморфный осадок; с раствором железоаммониевых квасцов - черно-синее окрашивание (гидролизуемые дубильные вещества) и осадок. При добавлении кислоты хлористоводородной и 40% раствора формальдегида после кипячения образовался осадок, который указывал на присутствие конденсированных дубильных веществ. Полученный осадок отфильтровывали и к фильтрату добавляли раствор железо-аммонийных квасцов и кристаллический свинца ацетат, появлялось фиолетовое окрашивание, подтверждающее присутствие гидролизуемых дубильных веществ. Реакция с натрия нитратом в присутствии 0,1 н кислоты хлористоводородной приводила к бурому окрашиванию.
Проведенные качественные реакции показали, что корневища с корнями лапчатки белой содержат дубильные вещества и гидролизуемой и конденсированной группы.
В результате хроматографических исследований, проведенных по методикам, описанным в главе 2, пункте 2.2.3.1, в извлечениях из корневищ с корнями были идентифицированы танин и кислота галловая.
Количественное определение дубильных веществ Европейская фармакопея в качестве показателя содержания действующих веществ в ЛРС, приводит показатель - содержание дубильных веществ, осаждаемых гольевым порошком, в пересчете на пирогаллол. Этот показатель по сравнению с показателем содержания дубильных веществ в пересчете на танин (по ГФ XI) значительно ниже, поскольку по ГФ XI под названием «дубильные вещества» определяется сумма всех полифенольных соединений, извлекаемых водой и титруемых перманганатом калия 0,02М в присутствии индигосульфокислоты [29].
Разработанные на сегодняшний день методы количественного анализа дубильных веществ основываются на нескольких принципах. Это, во-первых, осаждение дубильных веществ различными реагентами (желатином, формалином, солями тяжелых металлов), во-вторых, окисление перманганатом калия, йодом, в-третьих, колориметрия с использованием окрашивания растворов фенольных соединений различными реактивами (молибдатом аммония, железо-тартратным реактивом), а также спектрофотометрия при определенной длине волны [59]. Для количественного определения дубильных веществ использовали метод перманганатометрии и УФ спектрофотометрии в пересчете на галловую кислоту после осаждения дубильных веществ 1% раствором коллагена (см. главу 2, пункт 2.2.4.2). При исследовании УФ спектра поглощения спиртового извлечения из корневищ с корнями лапчатки белой установлено, что при длине волны 276±2 нм наблюдается выраженный максимум, аналогичный максимуму поглощения раствора кислоты галловой.
Содержание осаждаемых дубильных веществ, суммы полифенольных соединений, не осаждаемых фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, определенных методом спектрофотометрии (Х,%)
Содержание группы БАВ, % на абсолютно сухое сырье осаждаемых дубильных веществ не осаждаемых фенольных соединений суммы фенольных соединений
Содержание дубильных веществ в корневищах с корнями лапчатки белой, определенное перманганатометрически, составило 16,37±0,12%.
Таким образом, количественное содержание дубильных веществ, определенное различными методами, составило от 8,57 ± 0,02% до 16,37±0,12%. Значение, полученное при определении методом перманганатометрии, завышено, поскольку данным методом определяется сумма всех полифенольных соединений, извлекаемых водой и титруемых перманганатом калия.
Валидация методики УФ спектрофотометрического определения дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую Определение линейности методики Линейность методики - это наличие прямопропорциональной зависимости оптической плотности от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе.
Линейность выражается уравнением линейной регрессии у = ах + b. Параметр b градуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент a характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики. Значения параметров a и b вычисляются методом регрессионного анализа с помощью программы Excel. Для аналитических целей можно использовать методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом г, который должен быть 0,99.
Изучение полисахаридного состава
Исследование «острой» токсичности выполнялось на аутбредных мышах обоего пола весом 22,0-24,0 г, полученных из вивария Пятигорского медико-фармацевтического института. Животные, прошедшие двухнедельный карантин, находились в пластмассовых клетках группами при смешанном освещении в условиях свободного доступа к воде и корму. При исследовании острой токсичности были сформированы группы из 5 самок и 5 самцов для каждой дозы.
При проведении фармакологического эксперимента мы руководствовались следующими нормативными документами: приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.03 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Национальным стандартом РФ ГОСТ Р 53434 - 2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» [58].
При изучении острой токсичности экстракт лапчатки белой вводился однократно. Дозы, необходимые для регистрации ЛД50, были установлены экспериментальным путем.
Клиническое наблюдение за каждым животным проводилось в течение первого часа после введения препарата, ежедневно в последующем. Фиксировались следующие показатели: особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координация движений, тонус скелетных мышц, реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частота и глубина дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покрова, органов чувств, положение хвоста, количество и консистенция фекальных масс, частота мочеиспускания и окраска мочи. Производили подсчет количества погибших животных в ходе эксперимента [63].
Осмотр животных в клетках содержания с целью выявления смертности или признаков отклонения в состоянии здоровья, производили ежедневно.
Массу тела определяли с помощью электронных весов однократно перед введением для точного расчета вводимой дозы.
Ежедневно визуально отмечали отклонения в потреблении корма и воды выжившими животными в отдельных клетках. Через 14 дней после введения выжившие животные подверглись эвтаназии путем декапитации под эфирным наркозом. Расчет LD50 производили с использованием пробит-анализа по методу Прозоровского.
При вскрытии погибших животных визуально осматривали внутренние органы, отмечали патологические изменения их цвета, размера и расположения. 2.3 Микробиологические методы
Определение микробиологической чистоты сырья лапчатки белой Пробу сырья измельчали стерильными ножницами на мелкие куски. Методом квартования выделяли образцы и переносили в стерильную колбу со 100 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического. Колбу с исследуемым образцом встряхивали на качалке 15 минут. Из полученного смыва, условно соответствующего разведению 1:10, готовили последующие десятикратные разведения в растворителе до 10-6. Испытание проводили чашечным агаровым методом. Для каждого разведения использовали 2 чашки Петри с определенной питательной средой. Посевы инкубировали при температуре 32,5±2,5С на среде № 1 и при температуре 22,5±2,5 С на среде № 2 в течение 5 суток.
Изучение внешних признаков сырья лапчатки белой проводили согласно методикам ГФ XI издания и Сборнику методических рекомендаций по стандартизации ЛС [65].
Растительный материал для микроскопического изучения представлял собой свежесобранные и высушенные растения, фиксированные в системе этанол-глицерин-вода в соотношении 1:1:1. Микроструктура стебля, корневища, корня, листовой пластинки и черешка листовой пластинки изучалась на поперечных срезах, а также на микропрепаратах нижней и верхней эпидермы листовой пластинки. Поперечные срезы приготавливались лезвием безопасной бритвы от руки. Окрашивание микропрепаратов на наличие лигнифицированных элементов проводили при помощи спиртового раствора флороглюцина и раствора кислоты серной 50%, локализацию крахмальных зерен - реактивом Люголя. В ходе эксперимента использовали временные микропрепараты, которые фиксировали в растворе глицерина. Анатомические исследования проводили при помощи микроскопа Биолам с увеличением объективов x4; xЮ; x40. Сегменты анатомических срезов фотографировали с помощью микроскопа «Биолам», люминисцентного микроскопа Микромед-3-Люм с увеличением объективов x4; xЮ; x40 (светофильтры зеленый (G) и нейтральный (N)) и цифрового фотоаппарата Samsung NV4.
Анатомическое строение подземных органов
Согласно результатам анализа, содержание аминокислот в траве лапчатки белой составило 19,90 г/кг. Идентифицировано 11 аминокислот, около 24 % из которых - незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают трептофан (2,01 г/кг) и лейцин (1,73 г/кг), в числе заменимых - аспарагин (3,81 г/кг) и глицин (3,51 г/кг).
Мажорной аминокислотой является заменимая аминокислота аспарагин (3,81 г/кг), в следовых количествах представлены лизин (0,72 г/кг) и фенилаланин (0,36 г/кг).
Известно, что нативнык комплексэ элементор растений могут быть использованы в качестве лекарственных и профилактических средств в комплексной терапии различных заболеваний, а также в качестве маркеров в биогеохимических, биологоэкологических и фитохимических исследованиях [52].
Известно, что существует генетический и экологический факторы формирования элементного состава растений. Их приоритетность меняется в зависимости от условий окружающей среды, при техногенном загрязнении экологический фактор становится ведущим [56]. Поэтому усиление антропогенной нагрузки на окружающую среду позволяет рассматривать проблему оценки экологической чистоты лекарственных растений как одну из важнейших экологических проблем современности, т.к. химические элементы, которые накапливаются в растении, могут, о ойнос стороны, обеспечивать фармакологический эффект, с другой стороны, содержание некоторых может являться причиной токсического воздействия. Исходя из этого, изучение лекарственных растений как объектов экологического мониторинга признано актуальным направлением в совершенствовании качества фитопрепаратов и исследования антропогенного влияния на окружающую среду [42] .
В соответствии с рекомендацией диетологической комиссии Национальной академии США ежедневное поступление химических элементов с пищей должно находиться на определенном оптимальном уровне, представленном в таблице 18. Таблица 18 - Нормы суточного поступления химических элементов в организм человека
Первые 4 элемента относятся к макроэлементам в силу того, что их содержание в организме превышает 10 2 %, а остальные - к микроэлементам. Большинство микроэлементов являются -металлами и входят в состав ферментов. Например, марганец входит в состав 12 различных ферментов, медь - в 30, железо -70, а цинк - более чем в 100. При малом поступлении элементов снижается активность ферментов, в состав которых входит данный элемент, что сопровождается характерными симптомами.
Особое внимание следует обратить на такой микроэлемент, как йод. В настоящее время около 300 миллионов человек в мире имеют клинические проявления недостатка йода в организме - эндемический зоб и гипотиреоз. Около 20 млн. человек в мире имеют недоразвитие интеллекта из-за того, что в детстве не получали йода в достаточном количестве. В настоящее время жители России в среднем употребляют 40-80 мкг йода в сутки, в то время как в США на среднего жителя приходится 400-800 мкг, в Японии - 1500 мкг в сутки. От количества поступающего ежесуточно йода в организм зависит работа эндокринной системы. Учитывая то, что большая часть нашей страны (около 70%) относится к зонам с пониженным содержанием природного йода, рекомендовано в плане здорового питания ежесуточно потреблять 100-200 мкг йода [33].
Таким образом, элементный состав лапчатки белой представлен в том числе эссенциальными (Си, Zn, Mn, Fe, Mo, P, Co, Cr, S) и условно-эссенциальными (Ba, Ni, Si,V) элементами [46]. Можно также отметить высокое содержание марганца и фосфора.
Обнаружение йода в корневищах с корнями лапчатки белой проводили по реакции с крахмалом в присутствии сульфаминовой кислоты. Количественное определение йода в сырье лапчатки проводили по методике ГФ XI изд. после сжигания пробы [27]. Содержание йода составило 0,66±0,04%, что объясняет широкое использование лапчатки для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостатком йода, поскольку известно, что йод, содержащийся в растительном сырье, усваивается лучше, чем вводимый в виде препарата йодистого калия. Часто лапчатку используют в виде настойки или экстракта. Нами были проведены исследования по разработке технологической схемы производства настойки и ее стандартизации, которые отражены в Приложении 1.
Поскольку в РФ отсутствуют нормативная документация, регламентирующая ПДК тяжелых металлов для ЛРС, полученные результаты сравнивали с ПДК СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» [64].
