Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние фитохимического и фармакологического исследований растений рода Marrubium 10
1.1. Систематическое положение рода Marrubium сем. Lamiaceae Lindl. (Labiataea Juss.) и ботаническая характеристика растений 10
1.2. Сведения о химическом составе шандры пустырниковой и ш. чужеземной (Marrubium leonuroides Desr и m. peregrinum L.) 14
1.3. Использование в народной и научной медицине растений рода Marrubium 15
1.3.1. Использование в народной медицине 15
1.3.2. Применение в медицинской практике, гомеопатии и быту 17
1.4. Общие сведения о биологически активных веществах 20
1.4.1. Изопреноиды (терпеноиды) 20
1.4.2. Флавоноиды 25
1.4.3. Танины (дубильные вещества) 27
1.4.4. Азотистые основания 28
Выводы по обзору литературы 30
ГЛАВА 2. Ресурсные исследования шандры пустырниковой и шандры чужеземной и морфолого-анатомический анализ сырья 32
2.1. Ресурсоведческие исследования и определение запасов сырья 32
2.2. Морфологические признаки двух изучаемых видов шандры 38
2.3. Анатомическое строение и диагностические признаки сырья двух видов шандры 39
2.3.1. Анатомическое строение листа шандры чужеземной 40
2.3.2. Анатомическое строение черешка шандры чужеземной 43
2.3.3. Анатомическое строение стебля шандры чужеземной 44
2.4. Морфолого-анатомические диагностические признаки шандры пустырниковой 48
2.4.1. Анатомическое строение листа шандры пустырниковой 48
2.4.2. Анатомическое строение черешка шандры пустырниковой 51
2.4.3. Анатомическое строение стебля шандры пустырниковой 52
Выводы по главе 56
ГЛАВА 3. Изучение химического состава и разработка норм качества сырья шандры пустырниковой и шандры чужеземной 59
3.2. Качественный анализ биологически активных веществ травы шандры чужеземной и ш.
пустырниковой 59
3.2.1. Обнаружение ди- итритерпенов 59
3.2.2. Анализ эфирного масла 65
3.2.3. Определение полифенольных соединений 66
3.2.4. Определение дубильных веществ 71
3.2.5. Обнаружение азотистых оснований 72
3.2.6. Обнаружение алкалоидов 73
3.2.7. Определение аминокислот 76
3.2.8. Изучение качественного состава липофильной фракции 77
3.3. Количественный анализ основных биологически активных соединений 78
3.3.1. Количественное определение терпеноидов 78
3.3.2. Количественное определение полифенольных соединений 81
3.3.3. Количественное определение флавоноидов 82
3.3.4. Изучение динамики накопления суммы флавоноидов 85
3.3.5. Количественное определение дубильных веществ 87
3.3.6. Количественное определение азотистых оснований 88
3.3.7. Количественное определение аминокислот 90
3.4. Микроэлементный состав травы шандры пустырниковой и ш. чужеземной 93
3.5. Определение общих числовых показателей 96
Выводы по главе 100
ГЛАВА 4. Фармакологическое изучение суммарных извлечении изшандры пустырниковой и шандры чужеземной 101
4.1. Изучение острой токсичности водного и спиртового извлечений из шандры пустырниковой и шандры чужеземной 101
4.2. Изучение противоаритмического действия при аритмогенных поражениях 102
4.2.1.Изучение антиаритмических свойств суммарного извлечения из шандры
пустырниковой и ш. чужеземной на хлоркалышевой модели нарушений 103
4.2.2. Изучение антиаритмических свойств суммарного извлечения из шандры пустырниковой на строфантиновой модели аритмии 107
4.3. Исследование антиоксидантных свойств извлечений из шандры пустырниковой и шандры чужеземной 109
4.4. Изучение антигипоксической активности 112
4.5. Изучение мочегонного действия водного и спиртового извлечений из шандры чужеземной и шандры пустырниковой 114
4.6. Изучение желчегонной активности водного и спиртового извлечений из шандры пустырниковой и чужеземной : 116
Выводы по главе: 119
ГЛАВА 5. Разработка оптимальных условий экстрагирования и стандартизация настойки шандры чужеземной 121
5.1.Определение технологических характеристик сырья 121
5.2. Разработка технологической схемы настойки травы шандры 123
5.2.1. Технологический процесс производства настойки шандры 125
5.3. Стандартизация настойки шандры 125
5.3.1.Оценка качества настойки шандры 125
5.4. Определение действующих веществ в настойке травы шандры чужеземной 127
5.4.1. Качественное определение флавоноидов в настойке травы шандры чужеземной... 127
5.4.2. Количественное определение флавоноидов 128
5.4.3. Валидационная оценка предлагаемой методики определения флавоноидов в настойке шандры 129
5.4.4. Качественное и количественное определение ванилина методом ВЭЖХ в настойке 132
5.5. Микробиологическая чистота настойки 135
5.6. Изучение стабильности настойки 137
Выводы по главе: 139
Общие выводы 140
Литература:
- Сведения о химическом составе шандры пустырниковой и ш. чужеземной (Marrubium leonuroides Desr и m. peregrinum L.)
- Морфологические признаки двух изучаемых видов шандры
- Определение полифенольных соединений
- Изучение антиаритмических свойств суммарного извлечения из шандры пустырниковой на строфантиновой модели аритмии
Введение к работе
Мировой прогресс привел к возникновению эпидемии «заболеваний цивилизации» из-за постоянного воздействия пероксидации на организм человека - это сердечно-сосудистые, бронхо-легочные, желудочно-кишечные, онкологические и другие заболевания. Кроме того, бурное развитие химико-фармацевтической промышленности привело к увеличению доли синтетических препаратов, что в свою очередь, вызвало рост токсико-аллергическихи хронических заболеваний. В связи с этим, в России и за рубежом прослеживается устойчивая тенденция к увеличению потребительского спроса на лекарственные средства растительного происхождения. Данная группа препаратов наряду с достаточной эффективностью и широтой терапевтического действия имеет относительную безвредность и возможность длительного применения.
Актуальность темы
Получение эффективных лекарственных средств природного происхождения остается одной из важнейших проблем отечественного здравоохранения. Возрождение фитотерапии в настоящее время требует пополнения номенклатуры лекарственных средств новыми видами растительного сырья и фитопрепаратами. При этом основной акцент делается на разработку и внедрение конкурентоспособных и безопасных лекарственных форм, а также поиск новых сырьевых источников. Одним из таких источников являются растения из арсенала народной медицины.
Северный Кавказ располагает большими запасами ценных дикорастущих растений, использующихся в официнальной медицине. Однако значительные экологические изменения и антропологическое воздействие на природу приводят к резкому сокращению их природных ресурсов, поэтому остро стоит вопрос о расширении сырьевой базы за счет новых видов растений. Среди богатейшей флоры Северного Кавказа встречается немало растений, которые широко используются в народной медицине, но ввиду отсутствия научно-обоснованных данных о химическом составе и фармакологических свойствах еще не применяются в научной медицине. В связи с этим, исследование растений сем. Lamiaceae приобретает
особую актуальность, так как они имеют богатый состав биологически активных веществ и обладают широким диапазоном фармакологического действия.
Шандра обыкновенная (белая) (Marrubium vulgae L.) является наиболее популярным растением из рода Marrubium L. Ее трава очень широко применяется в народной медицине как отхаркивающее, желчегонное, диуретическое, седативное, сердечно-сосудистое, кровоостанавливающее и другие средства. Официально во многих странах мира используется трава шандры обыкновенной для получения различных лекарственных препаратов. Основные из них позиционируют на фармацевтическом рынке как: эффективные детоксикационные и регенерирующие средства для лечения печени и желчного пузыря, для профилактики онкологических заболеваний; сиропы, чаи, настойки в качестве отхаркивающих, спазмолитических и противотуберкулезных средств; свечи, таблетки, настойки для лечения мастопатии и различных гинекологических заболеваний. Она является основной субстанцией многих гомеопатических средств и БАД как в России, так и за рубежом. Трава ш. обыкновенной входила в отечественные фармакопеи I-III изданий.
В результате бесконтрольных заготовок и длительного экспорта сырья запасы шандры обыкновенной (белой) на территории России практически истощены и не позволяют заготавливать сырье в необходимом объеме для получения лекарственных препаратов. Поэтому наше внимание привлекли два дикорастущих и наиболее распространенных вида флоры Северного Кавказа из рода Шандра - шандра чужеземная (Marrubium peregrinumn L.) и ш. пустырниковая (Marrubium leonur-oides Desr.), трава которых используется в народной медицине при тех же заболеваниях. Это дает возможность рассматривать данные виды как потеницальные заменители лекарственного растения - шандры обыкновенной. Кроме того, они могут служить самостоятельными источниками для приготовления различных лекарственных средств с направленным действием.
Широта использования в народной медицине, достаточная сырьевая база, но в тоже время неполная изученность химического состава и отсутствие научных сведений о фармакологическом действии послужили основанием для проведения настоящих исследований.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось научное обоснование возможности расширения сырьевой базы за счет малоизученных видов рода шандра, произрастающих на Северном Кавказе, и получения для них статуса лекарственных растений.
Для этого необходимо решить следующие задачи:
Провести исследования по выявлению мест произрастания шандры чужеземной и шандры пустырниковой на территории Ставропольского края и Республики Дагестан и определить их ресурсные возможности.
Изучить морфолого-анатомическое строение и определить основные диагностические признаки, позволяющие идентифицировать сырье.
Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ выбранных объектов.
Провести фармакологический скрининг спиртовых и водных извлечений с целью выявления наиболее активного действия и возможности внедрения его в
. медицинскую практику.
Выявить оптимальные условия экстрагирования, предложить схему получения настойки и методы ее стандартизации.
На основании проведенных исследований разработать НД на траву и проект ФСП на настойку.
Научная новизна
Впервые определены основные районы распространения шандры пустырниковой и шандры чужеземной на территории Ставрополького края и Республики Дагестан и выявлен их сырьевой потенциал.
Проведено подробное морфолого-анатомическое изучение объектов и выявлены основные диагностические признаки.
Впервые более полно изучен химический состав двух видов рода Marrubium, идентифицировано 12 основных групп биологически активных веществ: терпеноиды (дитерпены), эфирное масло, фенолкарбоновые кислоты и их производные, флавоноиды, кумарины, проантоцианидины, дубильные вещества,
аминокислоты, азотистые основания, алкалоиды, стероиды, витамины. Для некоторых из них определено количественное содержание.
Изучен состав эфирного масла, в качестве основных его компонентов выявлены кариофиллин и его изомеры.
Фракционно разделены смолистые вещества, мажорными в которых являются дитерпены.
Установлен компонентый состав липофильной фракции, наиболее значимые в ней соединения - сквален и у-токоферол.
Из полифенольной группы идентифицированы: оксикоричные кислоты, флаво-ноиды, кумарины, проантоцианидины и конденсированные дубильные вещества. Изучена динамика накопления флавоноидов по органам и фазам развития.
Среди азотистых оснований обнаружены: холин, бетаин, бетоницин.
Изучение аминокислотного состава показало наличие в значительных количествах незаменимых и полузаменимых аминокислот.
Проанализирован элементный состав надземной части обоих видов. Среди макроэлементов в наибольших количествах накапливаются: калий, магний, кальций, натрий.
Установлена близость химического состава и фармакологического действия изучаемых видов и травы шандры обыкновенной, что позволяет рекомендовать их как дополнительные сырьевые источники. У каждого из объектов выявлена наибольшая фармакологическая активность.
Предложены основные критерии оценки качества и идентификации изучаемого сырья по органолептическим, физико-химическим и диагностическим показателям.
На основе проведенных исследований предложена спиртовая настойка (40%), подобраны оптимальные условия экстрагирования, определены нормы ее качества, разработана схема получения в условиях производства и методы стандартизации.
Практическая значимость
В результате наиболее полного изучения двух видов рода шандра расширена сырьевая база лекарственных растений для научной медицины. Изучены запа-
сы растительного сырья в Ставропольском крае и Республике Дагестан, позволяющие планомерно заготавливать сырье с учетом охраны природных ресурсов.
Установлено 5 видов фармакологической активности, что дает возможность рекомендовать шандру пустырниковую и ш. чужеземную для проведения дальнейших исследований как перспективное сырье для практической медицины.
На основании проведенных комплексных исследований разработаны: нормы качества сырья, проект ФСП «Настойка шандры чужеземной», инструкции по заготовке и сушке сырья.
Полученные данные свидетельсвуют о целесообразности использования сырья шадры чужеземной и ш. пустырниковои как дополнительных источников травы шандры обыкновенной, так и в качестве самостоятельного сырья для получения настойки.
Внедрение результатов исследования
Проект ФСП принят к рассмотрению в Институте стандартизации лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора (письмо № 1486 от 26.02.2007 г.).
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01200112164) в рамках проблемы «Фармация» секция № 38 Ученого совета МЗСР РФ.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (2002 г. и 2007 г.). По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 в журналах, рекомендуемых ВАК.
Положения, выдвигаемые на защиту: & результаты фитохимических исследований травы шандры чужеземной и ш.
пустырниковои; & морфолого-анатомическое строение и основные диагностические признаки
изучаемых видов шандры;
& итоги ресурсных исследований; & результаты фармакологического скрининга;
& условия получения настойки на спирте этиловом 40%, рекомендуемой в качестве антиоксидантного, антигипоксического и гепатопротекторного средства, и методы ее стандартизации. Объем и структура диссертации
Работа изложена на 154 страницах машинописного (копмпьтерного) текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части, включающей 4 главы, обсуждения результатов и выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована 37 таблицами, 47 рисунками и графиками, 19 формулами. Список литературы состоит из 162 источников, из них 27 иностранных авторов.
Обзор литературы
Сведения о химическом составе шандры пустырниковой и ш. чужеземной (Marrubium leonuroides Desr и m. peregrinum L.)
В 60-70-х годах XX века изучению химического состава некоторых растений рода Marrubium посвятили свои труды молдавские ученые Попа Д.П., Пасечник Г.С., Салей Л.А. (ученики школы Лазурьевского Г.В.). В частности, из травы шандры обыкновенной ими были выделены дитерпены - маррубиин, маррубиол и вульгарол. Ими изучался не только состав ди- и тритерпеноидов некоторых растений этого рода (в том числе шандра обыкновенная, ш. чужеземная и ш. пустыр-никовая), но также их биосинтез. К сожалению, в конце 70-х годов в силу ряда объективных причин такие исследования не нашли своего продолжения. Полезные свойства шандры обыкновенной изучались Ролловым А.Х. и Бодруг М.В.. Исследованием некоторых других видов рода шандра занимались и иностранные ученые: Chopra R., Nayar J., Martinez M. [10, 94, 139, 156].
Ввиду разностороннего применения в научной медицине наиболее полно химически была изучена надземная часть шандры обыкновенной (белой). В ней обнаружены: эфирное масло сложного состава (0,04-0,2%): камфен, а-пинен, п-цимол и др..Дитерпеноиды: маррубиин (атерфакт) - 0,18-1,68%; премаррубиин А; премаррубиин В; перегринол - 0,05-0,15%; маррубиол - 0,13-0,59%; вульгарол, фитол. Тритерпеноиды: урсоловая кислота - 0,12%. Стероиды: В-ситостерин -0,12-0,17% (в листьях). Алкалоиды - 0,04-0,05%. Сапонины. Азотсодержащие соединения (бетоницин, холин) - 0,5-2,0%. Фенолкарбоновые кислоты и их производ ные: хлорогеновая, гидроксихлорогеновая, кофейная, розмариновая. Флавоноиды -1,12%. Кумарины. Дубильные вещества-2,63-6,5%. Витамин С [3,104,135].
Сведения же о содержании биологически активных веществ в выбранных нами видах этого рода оказались весьма ограниченными.
Литературный поиск показал, что на данный момент из надземной части шандры пустырниковой выделены и идентифицированы дитерпеноиды: перегри-нол, фитол, дигидроперегринин [10, 94,104].
Семена ее содержат жирное масло, в гидролизате которого обнаружены кислоты: пальмитиновая, стеариновая, олеиновая (18,2%), линолевая (75,5%), лино-леновая [84, 104].
В траве шандры чужеземной содержатся: дитерпеноиды - перегринол, пере-гринин, тетрагидроперегринин, фитол; стероиды — (3-ситостерин; флавоноиды — эупатилин, 5,6,7,4 -тетраметоксифлавон; эфирное масло до 0,05% [9,104,147, 162].
Семена также содержат жирное масло (и.ч. 166,7), в гидролизате обнаружены кислоты (в %): пальмитиновая, стеариновая, олеиновая (18,3%), линолевая (72,6%) линоленовая. Полезные свойства: аналогично таковым шандры обыкновенной [13, 141].
Из растений этого рода широко известна и давно применяется в народной и научной медицине трава шандры обыкновенной (белой) - Marrubium vulgare L. (народные названия: былица болотная, конская мята, шанта), которая содержит сложный комплекс биологически активных веществ. Шандра обыкновенная - старинное целебное растение, первое упоминание о котором встречается еще в античной и средневековой литературе и воспето в поэмах Валафрида XV века [73].
Не потеряло своей актуальности и в настоящее время применение шандры в народной медицине многих европейских и латино-американских стран. С лечебной целью против самых различных заболеваний используют верхушки стеблей с листьями и цветами. В основном, из них получают настои (добавляя к ним изюм, мед), отвары или применяют в виде порошка и получают сок свежего растения.
Настои и отвары применяются как жаропонижающее при лечении тифа, а также при инфекционных заболеваниях печени (особенно при желтухе, холецистите), почечно-каменной болезни, воспалении почек и мочевого пузыря [44,55].
Высокий лечебный эффект оказывают водные извлечения при респираторных инфекциях, бронхите, бронхиальной астме, заболеваниях желудка и кишечника, диареях, малярии [13,20,46]. Рекомендуется применять их при болезненных и недостаточных менструациях, ревматизме, сердечной слабости, аритмии, золотухе, анемии, для улучшения аппетита, как средство для успокоения нервной системы. Прием настоя травы шандры вызывает повышение тонуса миометрия [52,65].
Сок шандры в смеси с подсолнечным маслом закладывают в виде ушных тампонов при отите. Сок из свежего растения при насморке закапывают в нос. Применяется сок травы и для ретенции плаценты [18,52].
Настой молодых побегов в практике народной медицины используется как гемостатическое и обезболивающее при ревматизме (в виде порошка в 2-3 приема вдень) [61 66].
В немецкой и болгарской народной медицине траву некоторых видов шандры ценят как отхаркивающее средство при воспалении дыхательных путей, при остром и хроническом бронхите, коклюше, старческой и спастической астме; применяют при женских заболеваниях, анемиях, болезнях печени, селезенки, воспалении лимфатических узлов и мочевого пузыря, при желтухе, болезнях желудка и кишечника [134, 158,159].
Отвар из шандры обыкновенной и чужеземной применяется для ванн при дерматозах у детей [28,62]. В Центральной Америке и Африке используют траву шандры также как вяжущее средство в соотношении 1:5 в виде отвара [154,156]. Цветы и листья применяют как седативное средство при бессоннице, тонизирующее и стимулирующее пищеварение [160].
Морфологические признаки двух изучаемых видов шандры
Шандра чужеземная- Marrubium peregrinum L. - цельное сырье представляет собой олиственные цветоносные четырехгранные опушенные стебли длиной до 20 см. Листья накрест супротивные, ланцетовидные, городчато-пильчатые, светло-зеленые. Соцветие разветвленное, состоит из 8-10-цветковых ложных мутовок (длина 8-11 мм); прицветники равны трубке или половине ее длины, шиловидные. Чашечка колокольчатая, с пятью треугольными зубцами. Венчик белый, трубка его немного выдается из чашечки, верхняя губа надрезана до половины на две продолговатые лопасти, нижняя губа немного короче верхней. Запах своеобразный, слабый мятно-камфорно-тимоловый. Вкус - горький, пряный.
Измельченное сырье - высушенные куски листьев, стеблей и соцветий, сохранивших свою естественную окраску (светло-зеленую) и проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Высушенные кусочки стебля четырехгранные, бледно-зеленые, опушенные. Запах мятно-камфорно-тимоловый. Вкус - горький, пряный.
Шандра пустырниковая - Marrubium leonuroides Desr. — цельное сырье состоит из высушенных листоносных и цветоносных четырехгранных стеблей длиной до 20 см. Листья накрест супротивные, простые, цельные, яйцевидные со сморщенной пластинкой, покрыты густыми волосками. Ложные мутовки (диаметр 10-15 мм) образуют длинное соцветие; прицветники не колючие, короче чашечки, имеют пять шиловидных, к верхушке заостренных изогнутых зубцов, в два-три раза короче трубки; венчик розовый, трубка его слегка выдается из чашечки, верхняя губа до половины надрезана на две лопасти, значительно длиннее нижней. Запах легкий бальзамический. Вкус - сильно горький, пряно-жгучий.
Измельченное сырье — представляет сосбой кусочки листьев, стеблей и соцветий, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет темно-зеленый с буроватыми вкраплениями. Сырье на ощупь колючее. Запах бальзамический. Вкус - сильно горький, пряно-жгучий.
Таким образом, в результате внешнего изучения различных видов сырья кроме схожих морфологических признаков были выявлены различия: - сырье шандры чужеземной представлено в виде небольших, средне опушенных кусочков светло-зеленого цвета. Чашечка с пятью одинаковыми тре угольными зубцами, венчик белый, пятилопастный, вверху двугубый. Имеет кам форно-пряный запах и горький вкус. - сырье шандры пустырниковой имеет темно-зеленый цвет, с небольшими коричневатыми кусочками стеблей. Мало опушенное. Чашечка также с пятью зуб цами, венчик пятилопастный, но розового цвета. На ощупь сырье грубое, колю чее. Запах бальзамический, вкус сильно горький.
Наиболее полная картина при диагностике видов одного рода возникает при сочетании внешнего морфологического анализа с анатомическим исследованием. Нами проведено подробное изучение строения вегетативных органов.(листа, стебля), на основании которого составлены схемы и рисунки микропрепаратов с наиболее характерными диагностическими признаками.
При приготовлении микропрепаратов и их анализа использовалась общепринятая методика Н.И. Терпило, А.А. Долгова [38,119]. Работа выполнялась в сотрудничестве с кафедрой ботаники ПятГФА под руководством старшего преподавателя кафедры, канд. фармац. наук Елисеевой Л.М.
Сырье для просветления предварительно подвергали мацерации в хлоралгидрате. Срезы готовили безопасной бритвой ручным способом и после соответствующей обработки их заключали в глицерин. Проведенные микрохимические ре акции на одревесневшие элементы и эфирное масло с Суданом III дали положительный результат (красное окрашивание). Вначале объекты рассматривали с помощью микроскопа Биолам С-11 при увеличении 8x7 и 40x17, затем использовали микроскоп для морфологических исследований МИКМЕД-1 с большим увеличением (х 150), фотографирование проводили цифровым фотоаппаратом марки «Canon Power fhot А 95». 2.3.1. Анатомическое строение листа шандры чужеземной
Для анатомического исследования выбирали листья средние по величине и возрасту. Изучали верхнюю и нижнюю эпидерму при малом увеличении.
Верхняя эпидерма состоит из одного слоя клеток со слабоизвилистыми антиклинальными стенками. Клетки ее имеют разный размер. Устьиц мало. Обнаружены очень характерные трихомы - мутовчато-ветвистые с одноклеточной ножкой и мутовчато-ветвистые на подставке. От вершины этих трихом в разном направлении расходятся острооканчивающиеся веточки, одна из которых наиболее удлиненна и имеет 2 клетки. В основании волосков обычно 4 эпидермальные клетки с прямыми стенками. Если волоски сильно ветвистые, то количество клеток в основании увеличивается. Имеются таюке простые одноклеточные волоски, которые встречаются реже и крупные однорядные двуклеточные волоски, которые суживаются от основания к верхушке и остро заканчиваются.
Нижняя эпидерма: клетки ее достаточно мелкие с извилистыми антиклинальными стенками и с прямыми по жилкам. Эпидерма, покрывающая жилку, имеет продолговатые клетки с прямыми стенками, устьиц очень мало. На нижней эпидерме имеются в большом количестве устьица, побочные клетки которых не выделяются, т.е. устьичный аппарат - аномоцитного типа. Обнаружены многочисленные звездчатые (с одной базальной и многочисленными апикальными клетками) и простые одноклеточные волоски (рисунки 4,5).
Определение полифенольных соединений
Из масс-спектров видно, что интенсивные пики молекулярных ионов 95, 177, 192 совпадают, что говорит о присутствии в шандре чужеземной наряду с указанными в литературе высшими дитерпеноидами и вульгарола, определенного нами впервые.
Таким образом, полученные результаты качественного анализа показали, что в обоих исследуемых объектах присутствуют дитерпеноиды. Кроме того, выявлены: биологический предшественник тритерпеноидов - сквален и представитель высших терпеноидов с неустановленной пока структурой.
Нами установлено наличие в обоих объектах общих дитерпеноидов - фитола и Р-ситостерина, а также специфических - вульгарола (в траве шандры чужеземной), перегринола, перегринина, дигидроперегринина.
Ограниченное распространение дитерпеноидов в сем. яснотковых, по-видимому, позволяет использовать их для химической характеристики некоторых таксонов низшего ранга.
Данный фрагмент работы был нами выполнен совместно с лабораторией масс-спектрометрии при МГУ, г. Москва. Выражаем благодарность сотрудникам лаборатории за оказанную помощь в работе над экспериментом. 3.2.2. Анализ эфирного масла
Из литературных источников известно, что содержание эфирного масла в траве шандры пустырниковой и ш. чужеземной составляет от 0,04 до 0,3% [9]. Однако сведений о компонентном составе эфирного масла изучаемых объектов нами найдено не было. В связи с чем, возникла необходимость в определении его качественного состава.
Эфирное масло получали методом гидродистилляции по ГФ XI [30]. Процесс отгонки длился около 5 часов. Полученное масло представляло собой желто-зеленую жидкость с приятным лимонно-ванильным запахом. Его состав устанавливали хромато-масс-спектрометрически (таблица 4).
Было идентифицировано 8 соединений для ш. пустырниковой и 12 - для шандры чужеземной. Установлено, что компонентный состав эфирного масла довольно разнообразен, в. нем наиболее широко представлены кариофиллин и его изомеры. Кроме того, в эфирном масле обоих растений найден и ванилин.
Сведения о содержании данной группы соединений в изучаемых объектах весьма ограничены. Известно лишь, что в траве шандры чужеземной из флавонои-дов идентифицированы эупатилин и 5,6,7,4 -тетраметоксифлавон [147]. Что касается шандры пустырниковой, то таких данных в литературных источниках нами не обнаружено.
Приготовление извлечения для определения полифенолъных соединений проводили по следующей методике [40]: около 10,0 г измельченной травы помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл 50% спирта этилового и с обратным холодильником нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа (с момента закипания). Смесь после охлаждения отфильтровывали и в мерной колбе объемом 100 мл доводили до метки 50% раствором спирта этилового. 10 мл полученного раствора помещали в колбу вместимостью 100 мл и доводили до метки тем же растворителем (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,1% растворов сравнения в этаноле: рутина, кверцетина, лютеолина, гиперозида, кофейной, хлорогеновой, феруловой, коричной кислот, кумарина, умбеллиферона.
Изучение полифенольного состава проводили на высокоэффективном микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» в градиентном режиме с детекцией при длинах волн 260, 280, 240, 300 и 360 нм. Такой диапазон был взят в качестве дополнительной характеристики для более точной идентификации индивидуальных веществ, согласно рекомендации института хроматографии для методик, реализуемых на указанном хроматографе. Условия хроматографирования были следующими: хроматографическая колонка размером 2x75 мм, заполненная обращено-фазовым сорбентом ProntoSil 120-5С AQ.
Подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор кислоты трифторуксусной, элю-ент Б - ацетонитрил, скорость потока — 100 мкл/мин; температура термостата колонки -35 ; градиент элюента Б от 10% до 40% за 25 минут детектирования; объем пробы - 4 мкл.
На хроматограмме извлечения,, соответствующего шандре чужеземной, наблюдали 33 пика (рисунок 28) и на хроматограмме извлечения из ш. пустырнико-вой - 29 пиков (рисунок 29).
Идентификацию индивидуальных соединений проводили по времени удерживания пика и его спектральным отношениям (таблица 5).
Таким образом, сопоставление времен удерживания пиков веществ на хромато-граммах испытуемых извлечений с временами удерживания стандартных образцов позволило с точностью идентифицировать 13 полифенольных соединений. Они представлены: фенолокислотами (хлорогеновая, кофейная, розмариновая, феруловая); кумарина-ми (умбеллиферон, 4-оксикумарин и кумаровая кислота); флавоноидами преимущественно группы флавона (кверцетин, рутин, гиперозид и два неустановленных флавонои-да); проантоцианидинами (катехин, эпикатехин, эпигаллокатехин).
Кроме того, на хроматограммах полученных извлечений выявлен пик, характеризующийся временем удерживания 1,98 мин (площадь пика - 137,489) для шан-дры пустырниковой и 2,10 мин (площадь пика - 69,302) для ш. чужеземной и идентифицированный нами как аскорбиновая кислота. Из отношения пиков видно, что ее содержание в 2 раза больше в траве шандры пустырниковой.
При общем сравнении хроматограмм выявлено сходство их полифенольного состава. Отличия выражены преимущественно в величине пиков тех или иных соединений. Полученные результаты подтверждают межвидовую генетическую близость и единообразие влияния факторов окружающей среды обитания на накопление БАВ.
Для уточнения наличия некоторых флавоноидов было изучено их хромато-графическое поведение. Для этого: навески сырья по 200 г, помещали в колбы для экстракции и заливали 70% спиртом этиловым до зеркала. Первый слив был сделан через 24 часа. Кратность экстракции — 4. Полученные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом до 1/3 первоначального объема и отфильтровали. Фильтрат разбавляли 100 мл воды очищенной, а затем последовательно экстрагировали хлороформом и этилацетатом. Этилацетатные фракции сгущали под вакуумом и сушили над безводным натрия сульфатом, после чего смешивали с 3-кратным объемом сухого хлороформа. Выделившийся осадок отделяли и сушили.
Изучение антиаритмических свойств суммарного извлечения из шандры пустырниковой на строфантиновой модели аритмии
Традиционно в народной медицине траву шандры используют как желчегонное средство, а в официальной с успехом применяется препарат Регален (США), обладающий выраженным детоксикационным, желчегонным и регенерирующим действием на печень - это послужило очередным этапом исследований по выявлению желчегонной активности у изучаемых нами объектов.
Изучение желчегонной активности извлечений проводили в остром эксперименте на наркотизированных беспородных белых крысах - самцах. Перед операцией животные голодали в течение 6 часов. За час до наркотизации им per os зондом вводили исследуемые извлечения в 1мл водного раствора (для водных извлечений) или в водной эмульсии на Твине-80 (для спиртовых извлечений) в дозе 25мг/кг. Вторую такую же дозу вводили шприцем непосредственно во время операции в тощую кишку, обеспечивая всасывание субстанций in situ, ниже сформированного желчного резервуара. Контролем служили питьевая вода и водная взвесь Твина-80, которые вводили в таком же объеме и последовательности, как и в опыте. Наркоз осуществляли внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг массы животного. Суть операции заключалась в искусственном образовании резервуара для сбора желчи из участка двенадцатиперстной кишки, который выше и ниже желчного протока брали на лигатуры и перевязывали [63]. В резервуар вставляли катетер и через него собирали выделяющуюся желчь в мерные пробирки (из гемометра Сали). Процесс желчевыделения фиксировали в течение трех часов. Количество полученной желчи рассчитывали на единицу массы животного - 1кг. В каждую серию брали по 6 крыс. Полученные результаты статистически обработаны и приведены в таблице 30.
Из полученных данных следует, что максимальное желчевыделение во всех сериях отмечалось на 1 часе эксперимента и в последующем снижалось к его окончанию. Достоверных различий в контрольных опытах нет. Водные извлечения из обоих объектов и спиртовое извлечение из шандры пустырниковой не обладают желчегонным действием. Спиртовое извлечение из шандры чужеземной обладает выраженным желчегонным эффектом на протяжении всего эксперимента с максимальной активностью на 2 часе после стимуляции экстрактом.
На основании проведенных собственных исследований можно сделать вывод о проявлении фармакологического эффекта в зависимости от наличия той или иной группы биологически активных извлечений.
Так, антиаритмический эффект, возможно, обеспечивается присутствием холина, бетоницина и усиливается ионами калия и магния, которых в траве шанд-ры пустырниковой практически в 2 раза больше (К -2,21% против 1,18% и Mg" -1,31% против 0,71%), чем в траве ш. чужеземной. Это подтверждается антиаритмическим эффектом водного экстракта ш. пустырниковой при двух видах моделированной патологии (хлоркальциевой и строфантиновой) и только при одной (хлоркальциевой) у экстракта ш. чужеземной.
Высокая антиоксидантная и антигипоксическая активности (АОА и АГА) обусловлены наличием в сырье оксикоричными кислотами, флавоноидами, проан-тоцианидинами, а также присутствием аскорбиновой кислоты, сквалена, у-токоферола и ванилина.
Полифенольные соединения (оксикоричные кислоты, флавоноиды и дубильные извлечения) способны тормозить неферментативное перекисное окисление липидов [54,146,147].
Сквален - нестабильное соединение и способно захватывать лишний атом кислорода, превращая его в нормальный (гашение сенглетного кислорода), по АОА сильнее витаминов А и Е, Q10 [111].
Ванилин в опытах in vitro и in vivo, в том числе и при болезни Альцгеймера, потенцирует антиоксидантные свойства эндогенных систем. Уже в дозах 2,5 ммоль/л влияет на процессы оксидантного повреждения мембран и ПОЛ, является пероксинитритом [150]. у-токоферол - мощный нуклеофил, захватывает мутагены в липофильной и гидрофильной фазах клеток. Соединение относится к группе пероксинитритов (как и ванилин) и защищает липиды и белки от повреждения. Кроме того, улучшает транспорт кислорода в клетках мозга и защищает от повреждающего действия свободных радикалов [155].
Диуретический эффект может возникать из-за присутствия в траве ионов натрия, магния, калия, влияющих на водно-солевой обмен.
Желчегонное действие спиртовых фракций обеспечивается полифенольными соединениями (оксикоричные и флавоноиды) и высшими терпеноидами. Наличие бетаина и холина обеспечивает липотропное и гепатопротекторное действие [88].
Таким образом, по результатам вышеизложенных экспериментов, можно сделать общее заключение, что спиртовые фракции шандры чужеземной по фармакологическим эффектам доминируют над таковыми шандры пустырниковой, хотя ее водное извлечение является лидером при восстановлении сердечного ритма.
