Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние исследований химии биологически активных веществ растений рода люцерна Medicago L. (обзор литературы) 10
1.1. Степень изученности химии биологически активных веществ в растениях рода люцерна 10
1.2. Применение растений рода люцерна в народной и научной медицине 17
1.3. Значение и использование биологически активных добавок к пище и функциональных продуктов питания в лечебно-профилактической практики 18
Выводы по главе 1 26
Глава 2 Химическое изучение биологически активных веществ растений рода люцерна 27
2.1. Объекты и методы исследования 27
2.2. Обследование распространения растений рода люцерна в КБР и хроматографическое изучение их флавоноидного состава 28
2.3. Химическое изучение биологически активных веществ люцерны посевной 33
2.3.1. Установление строения флавонов и флавонолов 33
2.3.2. Выделение и установление строения соединений производных 3-фенилхромона (изофлавонов) 38
2.3.3. Идентификация куместанов 49
2.3.4. Выделение и установление строения антоцианов 50
2.3.5. Идентификация оксикоричных кислот 52
2.3.6. Установление строения тритерпеновых соединений 54
2.3.7. Определение содержания пектиновых веществ и установление их аналитических характеристик .60
2.3.8. Определение содержания витаминов и аминокислот 70
Выводы по главе 2 75
Глава 3 Изучение фармакологического действия фракций полученных из травы люцерны посевной 78
3.1. Изучение гиполипидемической и гепатозащитной активности настойки люцерны посевной 78
3.2. Изучение кардиотропного действия настоек люцерны, полученных на 40% и 70% этаноле 84
3.3. Медико-биологические исследования, оценка эффективности водного экстракта люцерны - БАД «Долюцар» в производстве функциональных продуктов питания 88
Выводы по главе 3 94
Общие выводы 95
Список литературы 97
Приложение 111
- Степень изученности химии биологически активных веществ в растениях рода люцерна
- Установление строения флавонов и флавонолов
- Определение содержания пектиновых веществ и установление их аналитических характеристик
- Медико-биологические исследования, оценка эффективности водного экстракта люцерны - БАД «Долюцар» в производстве функциональных продуктов питания
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы достигнуты большие успехи в области химии и фармакологии природных флавоноидов и тритерпеновых сапонинов, широко распространенных в растительном мире.
Разнообразие химического строения и фармакологических свойств этих соединений представляет значительный интерес для дальнейшего поиска новых сырьевых источников указанных групп соединений. Этот интерес обусловлен их выраженным гипохолестеринемическим, антигипер-тензивным, гепатотропным, гипогликемическим, противовоспалительным, сосудоукрепляющим действием. В настоящее время достаточно остро стоит проблема укрепления отечественной сырьевой базы лекарственных растений. Это связано с резким ухудшением экологической обстановки в России, а также ограниченными возможностями использования естественных растительных ресурсов. Именно поэтому важная роль отводится культивируемым кормовым растениям, поскольку введение дикорастущих растений в культуру решает многие ресурсные проблемы.
Использование известных ценных сельскохозяйственных культур, особенно представителей семейства Бобовых, характеризующихся широким набором биологически активных веществ (БАВ), представляется актуальным для отечественной фармации, в первую очередь с позиций расширения сырьевой базы и производства фармацевтической продукции.
Растения семейства Бобовых (Fabaceae), в том числе и представители рода люцерна (Medicago L.), издавна используются в народной медицине. В научной медицине люцерна используется зарубежными производителями для создания биологически активных добавок (БАД) к пище. Так, компании "Пьювейс", "Виталайн", "Инрич" (США) выпускают БАД к пище "Люцерна" (Alfalfa), под названием "основа всех благ". Она рекомендована для профилактики и лечения атеросклероза, сердечных болей, артритов, ревматизма, аллергии, анемии, интоксикации печени, а также для нормализации водного обмена.
В Федеральном реестре БАД к пище (Москва, 2000) зарегистрирован "Эраконд" - жидкий и сухой экстракты люцерны, рекомендуемые как лечебно-профилактические средства при желудочно-кишечных, аллергических, гинекологических и других заболеваниях. Концентраты сиропообразный "Виолетта-3", "Виолетта-оригинальный" и "Виолетта-тонизирующий" (ТОО "Виолетта", г.Москва), в состав которых входит экстракт травы люцерны, обладают общеукрепляющим, мочегонным и успокаивающим действием.
Химические исследования видов рода люцерна, проведенные Бабас-киной Л.И., указывают на содержание в них некоторых групп флавоноидов, белков, аминокислот, минеральных веществ, липидов, стеринов, свободных жирных кислот, пигментов, восков, фосфолипидов, ди- и триацилглицидов. Разработаны и утверждены ТУ, проекты ФСП и ОПР на траву люцерны посевной и на экстракт люцерны жидкий. Предложена технология производства косметических средств: "Крем для рук" и "Крем для ног", обладающих ранозаживляющим и бактерицидным действием, бальзам "Противовоспалительный", "Шисейкан" и др. Однако промышленное производство этих средств пока еще не налажено.
Несмотря на определенные успехи в изучении биологически активных веществ люцерны и разработке лечебно-профилактических средств на ее основе, все же пока не решены задачи научно-обоснованного подхода к расширению сырьевой базы лекарственных растений за счет использования кормовых культур с учетом содержания основных групп БАВ и их фармакологического действия.
В этой связи исследование химии флавоноидов, тритерпеновых сапонинов, пектиновых веществ, витаминов и других БАВ, содержащихся в люцерне, является актуальным и позволит решить ряд задач научно-практической фармации.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - научное обоснование возможности расширения сырьевой базы лекарственных расте-
ний и разработка лечебно-профилактических средств на основе БАВ видов рода люцерна, произрастающих в некоторых районах Кабардино-Балкарской республики (КБР).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
провести исследования распространения растений рода люцерна на
территории КБР;
выявить наиболее перспективные виды этих растений, как источников
БАВ и сырьевых запасов;
изучить химический состав наиболее значимых видов рода люцерна как
лекарственного растительного сырья;
провести фармакологический скрининг суммарных фракции травы
люцерны с целью дальнейшего их использования для производства
различных лечебно-профилактических средств.
Научная новизна. Проведены ресурсные исследования дикорастущих и культивируемых видов люцерны флоры КБР, составлена карта их ареала. Установлено, что в качестве лекарственного растительного сырья целесообразно использовать сельскохозяйственную кормовую культуру - люцерну посевную (Medikago sativa L.), сорт Славянская, с урожайностью 100-120 ц\га, культивируемую в предгорных экологически чистых районах КБР.
Изучены полифенольные соединения, содержащиеся в люцерне посевной, представленные флавонами, флавонолами, изофлавонами, куместа-нами и антоцианидинами.
Впервые из травы люцерны посевной выделены и идентифицированы тритерпеновые сапонины - медикагеновая кислота и ее глюкозид, хедерогенина-3-дигликозид; оксикоричные кислоты - паракумаровая, кофейная, феруловая; пектиновые вещества.
Проведен качественный и количественный анализ аминокислот, содержащихся в траве люцерны посевной, и витаминов в ее сублимационном
порошке, полученном методом высоковакуумной сушки.
Определено количественное содержание флавоноидных соединений, тритерпеновых сапонинов, антоцианидинов и пектиновых веществ в траве люцерны посевной.
В результате фармакологического скрининга настоек люцерны посевной, полученных нами на 40% и 70% этаноле методом перколяции и молочнокислого продукта с БАД "Долюцар" (водный экстракт люцерны посевной), представленного НПФ ООО "Эраконд" г. Стерлитамак установлено, что:
настойка люцерны посевной, приготовленная на 70% этаноле, обладает
гипохолестеринемическим и гепатозащитным действием;
настойки люцерны посевной, полученные на 40% и 70% этаноле,
обладают кардиотропным действием;
добавление водного экстракта люцерны "Долюцар" в молочнокислый
продукт (кефир) повышает его антиоксидантные, иммуномодули-
рующие и гепатозащитные свойства.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в
практику В результате проведенных исследований показана возможность расширения сырьевых источников БАВ за счет люцерны посевной (сорт Славянская), культивируемой в КБР, и использования ее для производства лечебно-профилактических средств. Нами разработаны и внедрены БАД к пище и продукты питания функционального назначения:
хлебобулочные изделия - булочка "Луговая" (2,5% муки травы люцерны и 2,5% муки травы клевера) рекомендована как гипохолестерине-мический, витаминосодержащий продукт (акт внедрения от 10 октября 2000 г);
молочнокислый продукт - кефир с БАД "Долюцар" рекомендован в качестве продукта питания общеукрепляющего действия и повышающего неспецифическую резистентность организма. Зарегистрирован в
Гос. Реестре БАЦ ТУ 9222-283-00419785-2002 (акт внедрения от 20 сентября 2002г);
сублимационный порошок, полученный из травы люцерны посевной (сорт Славянская), рекомендован для производства фиточаев общеукрепляющего действия (акт внедрения от 01 ноября 2002 г); материалы исследований кардиотропного действия настоек люцерны посевной (сорт Славянская), приготовленных на 40% и 70% этаноле, используются в лекционном курсе на кафедре фармакологии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (акт внедрения от 17 ноября 2004г.).
Положения, выдвигаемые на защиту: результаты исследований ареала растения рода люцерна на территории КБР и выявление перспективных видов, как сырьевых источников ценных биологически активных веществ;
данные о результатах исследований химического состава и количественного содержания некоторых групп БАВ травы люцерны посевной (сорт Славянская);
результаты фармакологического скрининга различных фракций из травы люцерны посевной и продуктов, полученных на их основе; обоснование использования люцерны посевной (сорт Славянская) в качестве сырья для производства различных лечебно-профилактических средств. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№ гос. регистрации 01.20.0013406) и соответствует проблеме "Фармация" Ученого совета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ, секция №38. Апробация работы и публикации Основные фрагменты диссертационной работы изложены в материалах 53-й, 54-й, 58-й региональных конференций по фармации,
фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск 1998, 1999, 2001), V, VI, VIII Российских национальных конгрессов 'Человек и лекарство" (Москва, 1998, 1999, 2003); 5-й международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1998), международного симпозиума "Питание 21 века" (Владивосток, 1999), 7-го международного съезда "Фитофарм 2003" (Санкт - Петербург - Пушкин, 2003). По материалам диссертации опублиовано 11 научных работ.
Объем и структура диссертации
Степень изученности химии биологически активных веществ в растениях рода люцерна
На Северном Кавказе произрастает 20 видов люцерны, из них 7 видов на территории Кабардино-Балкарской Республики [33].
Виды семейства бобовых - Fabaceae относятся к высокобелковым растениям. Наибольшее количество протеина содержат однолетние виды (19,8%), наименьшее - многолетние (17,8%). Установлено, что в некоторых видах накапливается до 42% безазотистых оснований. Богаты растения микроэлементами и витаминами, особенно много каротиноидов и витамина С. Все это позволяет отнести это семейство по питательной ценности для животноводства на первое место среди других. В 100 кг корма в фазе плодоношения у большинства бобовых содержится перевариваемого белка 9 - 10 кг и 50 - 60 кормовых единиц.
Все виды рода люцерна относятся к растениям с высокой питательной ценностью и являются хорошими кормами для животных. Некоторые виды введены в культуру: люцерна посевная (M.sativa L.), люцерна хмелевидная (M.lupulina L.), люцерна серповидная (М. falcata L.), люцерна голубая(М. coeru-lea Hess.), причем урожайность зеленой массы достигает 100 - 120 ц/га.
Районированными сортами люцерны посевной на Северном Кавказе являются: для засушливой зоны - л. сорт Манычская; для хозяйств центральной зоны - л. сорт Славянская и л. сорт Манычская; предгорной - л. сорт Славянская.
По питательной ценности люцерна равноценна клеверу, в надземной части растения содержится 19,3 - 21,3% протеина, до 3,6% жира, БЭВ 32,8 -44,1% в пересчете на абсолютно сухую массу сырья [22, 24, 59].
Одним из важнейших показателей питательной ценности бобовых, в толі числе люцерны, является уровень содержания белка, который определяется его аминокислотным составом. Установлено, что содержание белка во многих видах люцерны свыше 20% в пересчете на абсолютно сухую массу сырья. Он состоит из 17 аминокислот, а суммарное содержание незаменимых кислот составляет до 38-40%.[19, 79, 94, 141]
В наземной части видов люцерны содержатся витамины (С, В, D, Е, каротин), минеральные вещества (К, Mg, Са, Р, CI, Fe, Al, Zn, Си, Со) [2, 22, 30, 142], органические кислоты (лимонная, яблочная, малоновая, янтарная), а также углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза и др.). [3, 26, 87, 117]
В траве и семенах установлен качественный и количественный состав жирных кислот липидного комплекса, который представлен пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линоленовой, линолевой и другими кислотами. Определено содержание фосфолипидов, стеринов и их эфиров, ацилглицеринов, что свидетельствует об активном течении биогенетических процессов, ведущих к образованию липидных соединений [3, 26, 128].
Эфирное масло, представлено большим составом альдегидов, спиртов, кетонов (п-ципол, ацетальдегид, гексапаль, этилацетат, метилбутанол и другие) [87, 106].
Важное народно-хозяйственное значение растений семейства бобовых вызывало повышенный интерес исследователей к изучению их химического состава, в первую очередь это касалось таких групп биологически активных веществ, как флавоноиды, одного из самых многочисленных классов природных соединений (свыше 2500). [15, 16, 50, 115].
Современное состояние и достижения в области исследования флаво-ноидов рассматривается в ряде книг, научных работ и обзоров [25, 98, 112, 122].
Наиболее полная классификация флавоноидов предложена в обзоре Максютиной Н.П. и Литвиненко В.И. и в монографии Клышева Л.К. и др. [54, 65, 86].
Флавоноидные соединения разделяются на ряд классов не только по степени окисленности пропанового фрагмента, положению бокового фенольного заместителя в ядре, но и некоторым другим признакам. Из всех известных флавоноидных соединений около половины выделено из растений семейства бобовых, причем изофлавоны и куместаны чаще всего встречаются в родах клевер, люцерна, дрок, соя и др. [78, 123, 133, 140]
Некоторые флавоноидные соединения (биофлавоноиды, антоцианиди-ны) относятся к промежуточным классам и имеют свои характерные признаки [38,39,89,125].
В 50 годах XX столетия достаточно много проведено научных исследований на содержание БАВ - куместанов и изофлавонов в растениях рода клевер, люцерна, обладающих слабой эстрогенной активностью. Фитоэстрагены обнаружены во многих растениях: в цветках ивы, в листьях ревеня, кукурузе, картофеле, пшенице, свекле и других растениях, т.е. являются непременной составной частью зеленых и сочных кормов фуражных культур. Поступая в организм животных в какой-то определенной норме, они оказывают благоприятное влияние на развитие и рост животных. В люцерне были обнаружены ряд изофлавонов: дайдзеин, генистеин, биохашш А, формононетин, а также куместаны: куместрол, медикагол (7-окси, 11, 12-метилендиоксикуместан) и их производные (7,12-диоксикуместан; З -метоксикуместрол; 4 -метокуместрол); сати-вол (8, 12-диокси-7-метокси-куместрол) [54, 101, 109, 111, 118].
В люцерне посевной и некоторых других видах (л. серповидная, л. хмелевидная, люцерна гибридная) обнаружены флавоноидные соединения: флавоны (апигенин и его 7-глюкозид), флавонолы (рутин, гиперозид, кверцетин, кверцитрин) [3, 43, 121, 131, 134].
Обнаруженные флавоноиды являются как агликонами, так и гликозида-ми, причем для изофлавонов характерно наличие, в структуре агликона 1-2 или 3 гидроксильных группы [5], а гликозиды являются, в основном, моно О-гликозидами [124].
Для обнаружения флавоноидов применяют различные качественные реакции в сочетании с хроматографией на бумаге или на тонком слое адсорбента [4,8,98,137]. Для них не существует стандартных методов выделения. Извлекают их обычно органическими растворителями, иногда водой. Для получения индивидуальных флавоноидных веществ используют различные виды хроматографии, чаще на колонках, применяя в качестве сорбентов полиамиды, силикагель, целлюлозу и другие [138].
Для установления строения флавоноидных соединений, как правило, используются химические методы в сочетании с физическими (УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопия и др.) [11, 27, 28, 53].
Флавоноиды в УФ-области дают две интенсивных полосы поглощения при 320 - 380 нм (1 полоса) и при 240 - 270 нм (2 полоса). Важное значение в характеристике этого класса природных соединений имеет соотношение интен-сивностей максимумов первой и второй полос, причем характерной особенностью изофлавонов является то, что максимум первой полосы составляет 20-25% от интенсивности второй полосы [34, 126]. Это дает возможность предварительно отнести исследуемое вещество к определенному типу флавоноидов (таблица 1).
Установление строения флавонов и флавонолов
Вещество Ф-1 , бледно-желтые кристаллы.
С помощью качественных реакций (цианидиновая проба дает оранжевое окрашивание, а с водным раствором щелочи - желтое окрашивание), а также на основе данных хроматографии на бумаге в системе БУВ (4:1:5) с применением соответствующих реагентов установили, что соединение Ф-1 является веществом флавоноидной природы.
В УФ-спектре соединение Ф-1 имеет два характерных максимума поглощения в области 329 нм (1) и 253, 225 нм (2), а также имеет «плечо» при 312 нм, что характерно для флавонов со свободными оксигруппами в положении С7 и С4 . В отличие от флавонолов, максимум поглощения 1-й полосы которых находится ближе к 370 нм, у флавонов он обнаруживается в пределах 327 - 355 нм. Под влиянием натрия ацетата наблюдается батохромный сдвиг (ДА 7-8 нм), что характерно для свободной оксигруппы в положении С7; с натрия этилатом также наблюдается батохромный сдвиг (ДА, 9 нм), что указывает на присутствие оксигруппы в положении С . Отсутствие батохромных сдвигов с алюминия хлоридом указывает на то, что при Сз и С/ ортооксигруппировка отсутствует. Сравнение физико-химических свойств с данными литературы, Тпл=316-317С и Rf с достоверным образцом позволило идентифицировать вещество Ф-1 как 7,4 - диоксифлавон.
Вещество Ф-2, бледно-желтые кристаллы.
Аналогично соединению Ф-1 проведены качественные реакции на Ф-2 и установлено, что оно является веществом флавоноидной природы. В УФ спектре отмечаются два максимума поглощения в области 340, 310 нм и 250, 234 нм, что характерно для флавонов со свободными оксигруппами в положении С7 и С , а с алюминия хлоридом и натрия ацетатом при добавлении кислоты борной наблюдается батохромный сдвиг (ДА, 25 и АХ, 38 нм), что указывает на ортодиоксигруппировку при Сз и С4 .
Сравнение с достоверным образцом на бумажной хроматограмме в системе БУВ (4:1:5), а также полученные физико-химические характеристики (Тпл 319-321 С), а также его УФ-спектр позволяют идентифицировать Ф-2 как 7,3 ,4 -триоксифлавон.
Вещество Ф-3, бледно-желтые кристаллы.
На основании качественных реакций вещество Ф-3 также отнесено к фла-воноидным соединением. В его УФ-спектре наблюдаются два максимума в области 342 и 272 нм, что характерно для флавонов.
Применение ионизирующих и комплексообразующих реагентов, вызывающих сдвиги максимумов поглощения в зависимости от характера и положения функциональных групп в молекуле в веществе Ф-3 с натрия ацетатом происходит батохромный сдвиг максимума в длинноволновой области спектра (Ал 42 нм), что характерно для С7-оксигруппы, а в присутствии алюминия хлорида батохромный сдвиг происходит максимум (ДА, 50 нм) - что характерно для свободной оксигруппы в положении С5, отсутствие же батохромного сдвига при добавлении натрия ацетата и кислоты борной, свидетельствует о том, что в положении Сз и С5 имеются метоксигруппы. Температура плавления вещества Ф-3 - 270-272С.
На основании физико-химических и спектральных данных соединение Ф-3 идентифицировано как 5,7,4 -триокси-3 ,5 -диметоксифлавон. [54]
Вещество Ф-4, бледно-желтые кристаллы. С помощью качественных реакций (цианиднновая проба дает фиолетовое окрашивание, с водным раствором щелочи - желтое окрашивание), а также на основании данных хроматографии на бумаге в системах растворителей 15% раствор кислоты уксусной (Rf 0,04), БУВ (Rf 0,64) с применением соответствующих реагентов установили, что соединение Ф-4 является агликоном флаво-нола.
В УФ-спектре соединение Ф-4 имеет два максимума поглощения в области 372 нм и 256 нм и «плечо» при 264 нм, что характерно для флавонолов со свободной оксигруппировкой в боковом фенильном радикале. Это подтверждается образованием комплекса с кислотой борной при ионизации натрия ацетатом, в результате чего наблюдается батохромний сдвиг первого максимума (АЛ, 18 нм.).
Под влиянием натрия ацетата наблюдается батохромия первого максимума (АЛ, 12 нм), что характерно для свободной оксигруппы при С7. Наличие характерного батохромного сдвига первой полосы поглощения (АЛ, 57) нм при добавлении алюминия хлорида и сохранения устойчивости комплексов при добавлении кислоты хлористоводородной указывает на то, что у Cs и Сз имеются свободные оксигруппы. Отсутствие комплексообразования с кислотой борной при наличии натрия ацетата и появления батохромнії первого максимума под влиянием натрия этилата дает нам основание считать, что в боковом фенильном радикале имеется свободная оксигруппа при С .
В результате анализа УФ-спектров установили, что соединение Ф-4 содержит свободные оксигруппы в положении 3, 5, 7, 3 ,4 .
Наличие свободных оксигрупп в положениях 3, 5, 7, 3 , 4 флавонового ядра подтверждается константами ацетильных и метоксильных производных, смешанная проба которых с пентаацетатом и с пентаметиловым эфиром квер-цетина не дала депрессии Тпл. Смешанная проба вещества Ф-4 с достоверным образцом кверцетина также не дала депрессии Тпл (311С).
На основании проведенных исследований можно утверждать, что соединение Ф-4 представляет собой 3, 5, 7, 3 , 4 - пентаоксифлавон, известный под названием кверцетин.
Вещество Ф-5, желтые игольчатые кристаллы. Тпл 237-239С" [а]д 36,4 (с 1.08; формамид).
На основании результатов хроматографии на бумаге в системе 15% раствор кислоты уксусной (Rf 0,57), пробы Херхаммера и устойчивости к щелочному гидролизу вещество Ф-5 отнесено к флавоноидам и возможно является 3-гликозидом.
В УФ-спектре соединение имеет два характерных максимума (362, 255 нм и «плечо» 265 нм) характерных для флавонолов у которых в боковом фе-нильном радикале имеется свободная оксигруппировка.
УФ-спектры с диагностическими добавками указывают на наличие свободных оксигрупп в положениях 5, 7, 3 , 4\ При кислотном гидролизе (10% кислота серная и нагревание в течение 2-х часов) обнаружили агликон (Тпл. 312 -314С) с выходом 63,64%, что характерно для моногликозида. Строение агликона установили на основании УФ-спектроскопии, отсутствия депрессии температуры плавления смешанной пробы агликона и кверцетина (313С). Агликон идентифицирован нами как 3, 5, 7, 3 , 4 - пентаоксифлавон (кверцетин). Гид-ролизат после отделения от агликона исследовали на углеводный компонент методом хроматографии на бумаги в системе БУВ 4:1:5, и хлороформ - уксусная кислота - вода в соотношениях 55:45:10 с достоверными образцами D-глюкозы и D-галактозы. Была идентифицированна D-галактоза. Результаты ферментативного гидролиза р-гидролазой позволили предположить, что сахарный компонент в флавоноиде связан с агликоном Р-гликозидной связью. На основании полученных данных соединение Ф-5 может быть охарактеризованно, как кверцетин З-Р-галактозид. Для определения величины окисного цикла галактозы проведено сравнение величин молярного вращения соединения и соответствующего феннлглпкозида. Величина [М]д-Кф соединения соответствует фенилгликозиду (-182,0), из чего следует, что галактоза имеет пиранозный цикл. Следовательно соединение Ф-5 является 5, 7, 3 , 4 тетраокси-3-O-P-D-галактопиранозид флавоном (пшерозид).
Вещество Ф-6, светло-желтые кристаллы.Т.пл. 194-196, [ос] -31,5 (с 0,32; диметилформамид).
Хроматографией на бумаге (Rf 0,43 в системе БУВ 4:1:5), цветными реакднями, пробой Херхаммера установили, что соединение является, 3-гликозидом флавона.
Определение содержания пектиновых веществ и установление их аналитических характеристик
Пектиновые вещества, являясь составным компонентом растительного сырья не только выполняют различные функции в жизни растения, но и обладают широким спектром лечебного действия (снимают вредное действие токсических веществ, влияют на холестериновый и углеводный обмен, регулируют работу желудочно-кишечного тракта и т.д.). Поэтому изучение пектиновых веществ, как составной части БАВ, имееет важное значение.
Техника извлечения пектиновых веществ и перевод в растворенное состояние: (водорастворимого пектина) - 25 г навески влажной травы л. посевной, тщательно растирали до однородной массы. Количественно переносили в коническую колбу на 150 мл, добавляли в колбу 100 мл дистиллированной воды 40С и выдерживают эту температуру на водяной бане 30 минут. Содержимое колбы отфильтровывали через бумажный фильтр. Операцию повторяли заливая твердый осадок в колбе 75 мл, 50 и 60мл воды, полученные извлечения собирали в мерную кобу на 250 мл и доводили до метки водой дистиллированной. Полученный раствор водорастворимого пектина использовали для дальнейшего изучения.
Для выделения протопектина и пектовой кислоты: остаток на фильтре заливали 50 мл 0,ЗМ раствор кислоты хлористоводородной и переносили в коническую колбу на 250 мл. с обратным холодильником и выдерживали 30 минут на кипящей водяной бане. После этого извлечение отфильтровывали через бумажный фильтр в мерную колбу на 500 мл. Остаток на фильтре 3-4 раза промывали 75 мл дистиллированной водой, фильтровали в ту же колбу. Фильтр с остатками растительного материала переносили в коническую колбу, заливали 50 мл 1%-ного аммония лимоннокислого и помещали на кипящую водяную баню на 30 минут. Полученный экстракт отфильтровывали в ту же мерную колбу. После чего содержимое колбы охлаждали и доводили до метки.
Следующую операцию для определения массовой доли пектиновых веществ в траве л. посевной проводили методом осаждения пектовых кислот в виде кальциевых солей. Для гидролиза пектиновых веществ к 50 мл исследуемого раствора прибавляли 50 мл 0,4%-ного (1М) раствора натрия гидрооксида и оставляли на ночь. На следующий день добавляли 50 мл 1 М кислоты уксусной. Образовавшиеся пектовые кислоты осаждали 50 мл 11,1%-ного раствором кальция хлорида. Осадок пектата кальция отфильтровывали через высушенный до постоянной массы фильтр, промывали 0,5%-ным раствором кальция хлорида и 5 раз холодной дистиллированной водой, для удаления ионов хлора. Фильтр с осадком помещали в бюкс и сушили до постоянной массы при 100С. Масса осадка пектата кальция (разность между массой фильтра с осадком и массой фильтра) не должна превышать 0,03 г. Ее величину умножали на 0,9235 для пересчета пектата кальция на пектовую кислоту. Расчет содержания водорастворимого пектина при объеме вытяжки 250 мл. проводили по формуле:
Х=а- 0,9235- 20=0,057- 0,9235- 20=1,05% Где: Х- содержание водорастворимого пектина, в (%); а- масса осадка пектата кальция - 0,057 г. 0,9235 - коэффициент пересчета пектата кальция на пектовую кислоту; 20 - множитель перевода результата определения пектиновых веществ при объеме вытяжки 250 мл., при общем объеме вытяжки 500 мл. множитель-40. Ход анализа при определении пектинов в обоих растворах одинаков. Расчет содержания протопектина при объеме вытяжки 500 мл. проводили по формуле: Х= а 0,9235- 40 = 0,085- 0,9235- 40 = 3,15%
Было установленно, что содержание пектиновых веществ в процентном отношении составляет: растворимого пектина 1,05% , протопектина 3,15% и общего пектина 4,20%. Как видно из полученных данных протопектиновая фракция значительно преобладает над растворимой (в 3 раза).
Результаты определения протопектина и водорастворимого пектина в люцерне посевной обработаны статистически, достоверны и представлены в таблицах 10, 11.
Для определения аналитических характеристик пектина необходимо выделить пектиновые вещества анализируемого сырья.
Для этого траву л. посевной предварительно измельчали до частиц размером 1 - 2 мм (влажность до 12%), смешивали с десятикратным количеством воды дистиллированной нагретой до 95 -98 С, добавляли такой же объем кипящей воды, содержащей 6 - 10 г кристаллической кислоты щавелевой в расчете на литр. Экстрагирование осуществляют при температуре 80 - 90 С в течение 0,5 час, а затем извлечение фильтровали. Для выделения пектина 100 весовых частей пектинового извлечения смешивали с 5,0 - 7,5 объемными частями 25 %-ного раствора алюминия сульфата. После тщательного перемешивания добавляли 20 %-ный раствор аммиака до рН среды 3,5 - 3,9, затем сумму пектиновых веществ промывали однократно разбавленным этанолом, сушили и измельчали до частиц размером 0,1 - 0,2 мм. Сушку и измельчение продукта проводили для того, чтобы обеспечить быстрое и полное промывание алюминия пектината с целью освобождения его от многовалентных катионов. Очистку продукта проводили следующим образом: 100 весовых частей алюминия пектината смешивают со 100 объемными частями 80 %-ного раствора этанола до однородной массы, добавляют 700 об. ч. соляно-кислого 45 %-ного раствора этанола (300 об. ч. 90 %-ного этанола + 300 об. ч. воды + 114 об. ч. 36 %-ной кислоты хлористоводородной). Смесь размешивали в течение 1 час, затем в нее добавляли 200 об. ч. 95 %-ного этанола (для уменьшения набухаемости частиц с целью облегчения фильтрации) и оставляли еще на 1 час. Смесь фильтровали и промывали слабокислым 55-60 %-ным раствором этанола (2000 об. ч. 95 %-ного этанола + 1370 об. ч. воды + 195 об. ч. 36 %-ной кислоты хлористоводородной) с целью полного удаления катионов, затем обрабатывали также на фильтре 70 %-ным этанолом до нейтральной реакции. Полученные пектиновые вещества сушили при температуре 55 С и измельчали (Рис. 5).
Медико-биологические исследования, оценка эффективности водного экстракта люцерны - БАД «Долюцар» в производстве функциональных продуктов питания
Целью исследования явилась оценка полезности применения для профилактики здоровья БАД «Долюцар» (водный экстракт люцерны), предоставленной нам НПФ ООО «Эраконд» (г. Стерлитамак), содержащего разнообразные биологически активные вещества люцерны при производстве разнообразных продуктов питания, в том числе кисломолочных продуктов, таких как кефир, ряженка, молочных коктейлей, сыров, творожной массы, мороженного [42].
На основании сведений о химическом составе и биологической активности БАД «Долюцар», для оценки полезности применения кефира с добавкой «Долюцар» было изучено его антиоксидантное, нммуномодулирующее и гапа-топротекторное действие.
Опыты проведили на белых беспородных половозрелых крысах самцах, массой 180-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария Пятигорской государственной фармацевтической академии под руководством доцента Дорки-ной Е.Г., за что выражаем ей большую благодарность.
При определении дозы кефира с БАД "Долюцар" исходили из максимальной дневной дозы для взрослого человека (1 г или 14 мг/кг), которая в отношении экспериментальных животных была увеличена в 10 раз (10 г или 140-150 мг/кг), т.к. они обладают более высокой (в 6-Ю раз выше) интенсивностью метаболических процессов. 40% раствор БАД "Долюцар" добавляли в кефир непосредственно перед введением животным с учетом рассчитанной дозировки и объема вводимого кефира (1-2 мл на одну крысу) и тщательно перемешивали при 30-35С. Кефир с БАД "Долюцар" вводили пероралыю опытной группе животных в течение 14 дней. За сутки до забоя пероралыю вводили 50% масляный раствор тетрахлорметана в дозе 0,15 мл /100г. В качестве контрольной группы служили животные, которые на протяжении 14 дней получали только кефир, а затем за сутки до забоя - четыреххлористый углерод. Для оценки окислительно-антиокислителыюго статуса организма в сыворотке крови и гомогенате печени определяли содержание ТБК-активных продуктов [132] и активность каталазы по реакции с молибденовым реактивом. Для оценки гуморальных и клеточных факторов неспецифической резистентности проводили определение активности лизоцима, содержания р-лизинов в сыворотке крови, [17] общей бактерицидной активности сыворотки крови, фагоцитарную активность, фагоцитарный индекс лейкоцитов и процент завершенности фагоцитоза. Гепатозащитное действие кефира с БАД "Долюцар" было изучено на модели острого токсического поражения печени тетрахлорметаном: 3-х кратное через день введение 50% раствора тетрахлорметана в дозе 0,15 мл /100 г массы тела. Эффективность гепатозащит-ного действия оценивали по нормализации биохимических показателей функционального состояния печени: активности аланинаминотрансферазы (АлАт) по методу Reitman S. и Frankel S., щелочной фосфатазы (ЩФ) по методу Bessey О.А., Lowry О.Н., Brock МЛ. в сыворотке крови, содержанию общего билирубина в сыворотке крови по методу Йендрашика, содержанию триглицеридов в гомогенате печени по Gottfried S. P., Rosenberg В. в модификации Сентебо-вой.[68] Статистическая обработка результатов проводилась по компьютерной программе "Microsoft Excel" с использованием критерия Стыодента.
Введение животным такого повреждающего фактора, как тетрахлорметан, на фоне применения только кефира привело к усилению интенсивности свободно-радикального процесса перекисного окисления липидов: содержание ТБК-активных продуктов в крови достоверно увеличилось на 24%, в печени - на 48%. При том отмечалось снижение эффективности систем ферментативной антиоксидантної! защиты, т.е. наблюдалось достоверное снижение активности ката-лазы в печени на 62% и в крови - на 67%.
Помимо усиления процессов свободно-радикального окисления, тетра-хлорметан оказал выраженное отрицательное действие на факторы неспецифического гуморального иммунитета: наблюдалось снижение на 42% бактерицидной активности и Р-лизшюв крови на 46%. Активность лизоцима в сыворотке крови увеличилась на 15%, что может отражать напряжение в работе данного звена защиты при воздействии повреждающего фактора. Под влиянием тетрахлорме-тана также отмечалось снижение всех исследованных показателей фагоцитоза: фагоцитарная активность лейкоцитов снизилась на 18%,-фагоцитарный индекс лейкоцитов - на 15% и процент завершенности фагоцитоза - на 25% (Табл. 20).
Профилактическое применение кефира с БАД "Долюцар" препятствовало нарушению окислительно-антиокислителыюго статуса организма, вызванного введением тетрахлорметана. В печени и крови наблюдалось снижение по сравнению с контролем содержания ТБК-активных продуктов соответственно на 38% и 21%. При этом содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке крови опытных животных достигло уровня интактных крыс, достоверно не отличаясь от значений у этой группы. Одновременно в крови наблюдалась также нормализация активности каталазы, в печени активность исследуемого антиоксидантного фермента достоверно повысилась на 57% (Табл. 21). Использование кефира с БАД "Долюцар" в значительной степени улучшило показатели неспецифического гуморального иммунитета: бактерицидная активность была выше на 37%, а содержание р-лизинов на 31% по сравнению с контрольной группой (Табл. 21). Отмечалось достоверное снижение активности лизоцима, которая достигла уровня интактных значений. Значительно повысились по сравнению с контролем исследованные показатели фагоцитоза: фагоцитарная активность, фагоцитарный индекс и процент завершенности фагоцитоза - +34%, +39% и +26% соответственно (Табл. 21).
Данные по изучению гепатозащитного действия кефира с БАД "Долю-цар" приведены в таблице 22. Как видно из таблицы, добавление к кефиру БАД "Долюцар" способствовало проявлению в достаточной степени выраженной ге-патозащитной активности данного продукта в условиях острого токсического ССЦ-гепатоза.[68,84]
В группе животных с ССЦ-гепатозом наблюдалось повышение активности АлАт и ЩФ в сыворотке крови на 82% и 109% соответственно, повышениє содержания в крови общего билирубина на 31% и содержания триглицери-дов в печени на 57%, что свидетельствовало о развитии цитолиза и холестаза ге-патоцитов, о нарушении детоксицирующей функции печении и ее жировой дистрофии. Лечебно-профилактическое применение кефира с БАД "Долюцар" привело к нормализации активности щелочной фосфатазы и содержания общего билирубина в сыворотке крови, а также содержания триглицеридов в печени, снизив эти показатели соответственно на 40%, 31% и 60%. Выявлено также достоверное снижение на 20% по сравнению с контролем активности аланинаминотрансфера-зы, но активность этого фермента осталась достоверно выше уровня интактных значений.
Проведенные нами исследования подтверждают тот факт, что повышение резистентности организма к различным агрессивным воздействиям химических и физических факторов окружающей среды обусловлено положительным влиянием на различные звенья иммунной и детоксикационной систем организма и другие общие механизмы адаптационно-приспособительных реакций, в том числе за счет поддержания функции антиоксидантных систем организма.
Таким образом, профилактическое применение кефира с БАД "Долюцар" оказывает положительное влияние на окислителыю-антиокислительный статус организма и способствует улучшению гуморальных и клеточных факторов неспецифической резистентности при действии повреждающего химического агента тетрахлорметана.; эффективно защищает печень от повреждающего действия тетрахлорметана, нормализуя показатели холестаза, жировой дистрофии печени и снижая показатель цитолиза гепатоцитов.
Похожие диссертации на Изучение биологически активных веществ люцерны флоры Кабардино-Балкарской Республики
