Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. структура, свойства и перспективы использования специфических органических веществ лечебных грязей как антиоксидантов природного происхождения 12
1.1. Современные представления о патогенезе окислительно-восстановительных процессов в организме. Применение антиоксидантов в фармации и медицине 12
1.2. Пелоидотерапия, классификация и состав лечебных грязей 16
1.3 Структурная организация, свойства и медицинское применение гуминовых веществ 19
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Выделение и идентификация отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов по общепринятым критериям 30
2.2. Методы исследования элементного состава и структурных компонентов гуминовых веществ пелоидов
2.3 Методы исследования антиоксидантной активности гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro 35
2.4 Количественное определение гуминовых веществ амперометрическим методом 37
2.5. Методы исследования биологической доступности 37
гуминовых веществ пелоидов 37
2.5. Методы исследования про- и антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов условиях in vivo 38
2.6. Статистическая обработка результатов исследования 42
ГЛАВА 3. Состав и структурные компоненты гуминовьгх веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей 43
3.1. Идентификация гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей 43
3.2. Сравнительная характеристика элементного состава компонентов гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей 46
3.2. ИК - спектроскопия гуминовых веществ пелоидов
3.3 ЯМР Ни ЯМР Х — спектроскопия гуминовых веществ пелоидов 56
3.4. Парамагнитные свойства гуминовых веществ пелоидов 65
ГЛАВА 4. Антиоксидантная активность гуминовых веществ в условиях IN VITRO 70
4.1. Определение антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов манометрическим методом 70
4.2. Определение антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей амперометрическим методом 79
4.3 Количественный анализ фракций гуминовых веществ пелоидов 83
4.4. Определение антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов хемилюминесцентным методом 89
ГЛАВА 5. Антиоксидантная активность гуминовых веществ в условиях IN VIVO 93
5.1. Биологическая доступность гуминовых веществ пелоидов 93
5.2. Влияние гуминовых веществ пелоидов на процессы свободно-радикального окисления в сыворотке крови экспериментальных животных 98
5.3. Влияние гуминовых веществ пелоидов на процессы 108
свободнорадикального окисления в печени экспериментальных 108
животных гистологическими методами 108
Заключение 111
Выводы: 117
Список литературы 1
- Пелоидотерапия, классификация и состав лечебных грязей
- Методы исследования про- и антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов условиях in vivo
- Сравнительная характеристика элементного состава компонентов гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей
- Определение антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей амперометрическим методом
Введение к работе
Актуальность темы. Живой организм, как открытая термодинамическая система, активно реагирует на негативные изменения биосферы, и вместе с тем, характеризуется высоким постоянством состава внутренней среды. Поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза, как неотъемлемого свойства живых организмов, обеспечивается комплексом взаимосвязанных биохимических процессов. Нарушение функций редокс-систем тканей и органов является важным звеном патогенеза ряда заболеваний, к которым относятся сахарный диабет, гепатиты различной этиологии [Мехтиев С.Н., 2008], патологии сердечно-сосудистой системы [Барсель В.А., 1998; Решетова Г.Г., 2004; Tang M., 1996], множество онкологических [Бурлакова Е.Б., 1979, Fukushima M, 2001] и аутоиммунных заболеваний, в том числе, ревматоидный полиартрит, склеродермия и другие [Маянский Д.Н., 1991; Меньщикова Е.Б., 2008]. Сказанное обуславливает активный поиск средств лечения окислительно-восстановительных нарушений и коррекции свободнорадикального статуса организма. С этой целью широко используются синтетические антиоксидантные препараты, такие как ионол [Репин В.С, 1998], пробукол (фенбутол) [Оковитый С.В., 2005; Burkitt M.J., 1996], диметилсульфоксид, мексидол [Воронина, 2000] и другие, применение которых ограничено рядом противопоказаний. Причинно-следственные отношения между терапевтическим эффектом и побочными действиями синтетических препаратов остаются недостаточно изученными. Иногда токсическое действие лекарственных средств на организм становится источником серьезных патологий. Вместе с тем, далеко не полностью исчерпаны возможности по разработке и внедрению в фармацевтическую практику терапевтических препаратов на основе природных соединений. Приоритетной задачей фармации в настоящее время является создание инновационных лекарственных субстанций на основе отечественного природного сырья для производства современных конкурентоспособных фармацевтических препаратов.
Перспективными с этой точки зрения являются гуминовые вещества, которые предполагают реализацию терапевтического эффекта на субклеточном и молекулярном уровне. Актуально фармацевтическое использование гуминовых веществ пелоидов, формирующихся в восстановительных условиях при участии сульфатредуцирующих микроорганизмов, что отражается на их структуре и химических свойствах, которые определяют биологическую активность соединений. Гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия, что подтверждается экспериментальными исследованиями последних лет. Специфические органические вещества обладают адаптогенным [Бузлама А. В., 2010], антитоксическим [Агапов А. И., Аввакумова Н.П., 1999], противомикробным [Жернов Ю.В., 2010], диуретическим [Дубищев А.В., 2010], противовоспалительным [Агапов А.И. 1999; Аввакумова Н.П., 2002; Катунина Е.Е., 2007] действием, а также являются универсальной матрицей, позволяющей ввести в организм человека необходимые микроэлементы в активной форме [Аввакумова Н.П., 2002; Кривопалова М.А., 2010].
Отсутствие в информационных источниках сведений о влиянии гуминовых веществ пелоидов на окислительно-восстановительные процессы обуславливает актуальность и новизну проведенного исследования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование зависимости антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от их структурной организации.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Выделить и идентифицировать по общепринятым критериям гуминовые вещества низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: фульвовые, гиматомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты.
-
Исследовать структурные компоненты гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей физико-химическими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
-
Разработать методы количественного анализа гумусовых кислот и их компонентов: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот.
-
Охарактеризовать в сравнительном аспекте про- и антиоксидантные свойства отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях «in vitro».
-
Оценить биодоступность отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.
-
Изучить антиоксидантную активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов по основным гематологическим характеристикам в условиях «in vivo».
Научная новизна. Получены новые сведения о структурных компонентах фульвовых, гиматомелановых, гуминовых кислот с использованием ИК, ЯМР, ЭПР-спектроскопии. Установлены особенности молекулярной структуры гуминовых веществ пелоидов.
Впервые уточнена и детализирована природа парамагнитных центров в молекулах гуминовых веществ пелоидов, свидетельствующая об их высокой реакционной способности. Установлены соотношения электронодонорных и электроноакцепторных свойств гуминовых веществ пелоидов.
Получены новые данные о влиянии гуминовых веществ пелоидов на динамику окислительного стресса в эксперименте. Выявлена антиоксидантная активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов, раскрывающая перспективность их использования в фармацевтической практике.
Впервые предложен способ количественного определения гуминовых веществ пелоидов методом амперометрии, который может быть использован для стандартизации лекарственных субстанций.
Практическая значимость. Данные об антиоксидантной активности гуминовых субстанций являются основой при выработке алгоритма по рациональной пелоидотерапии с позиций доказательной медицины.
Совокупность сведений о составе, структурной организации, а также количественные характеристики антиоксидантной активности и биодоступности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей являются необходимой базой для создания стандартизированных субстанций и лекарственных препаратов с целью дальнейшего использования в медицинской и фармацевтической практике.
Внедрение результатов работы позволит создать новый для России класс лекарственных средств сочетанного действия на основе экологически чистых природных веществ с доступной сырьевой базой.
Преимуществами применения пелоидопрепаратов, по сравнению с нативным грязелечением, является уменьшение противопоказаний и возможность использования лечебного фактора вне курортных зон.
По результатам исследований оформлено рационализаторское предложение:
- удостоверение на рационализаторское предложение № 122 от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра».
Результаты диссертационного исследования внедрены:
В учебный процесс на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011);
В учебный процесс на кафедре химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Принадлежность субстанций выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей к классу гуминовых веществ, а именно: фульвовым, гиматомелановым и гуминовым кислотам, по общепринятым идентификационным признакам: элементному составу, ИК-спектроскопии, коэффициенту цветности.
-
Генетическое сходство представителей веществ гуминового ряда по совокупности результатов, полученных физико-химическими методами анализа: инфракрасной спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса.
-
Антиоксидантная активность в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro по результатам амперометрического, манометрического и хемилюминесцентного методов.
-
Результаты определения биологической доступности отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.
-
Методика количественного анализа фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов как основа для стандартизации лекарственных субстанций.
-
Сравнительный анализ антиоксидантной активности в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях in vivo.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на «XII конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2007), межрегиональной научно-практической конференции по вопросам восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии, посвященной 175-летию ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» (г. Самара, 2008), XVI и XVIII Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (г. Пенза 2009, 2010), IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (г. Москва, 2008), VII Всероссийской конференции с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (г. Уфа, 2009), региональной конференции «Молодые ученые - медицине», «Аспирантские чтения, 2009» (г. Самара, 2009), V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г. Санкт-Петербург, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 6 работ – в ведущих рецензируемых журналах ВАК.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (государственная регистрация № 01200809998).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 33 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), трех глав (глава 3,4,5), отражающих результаты собственных исследований, заключения, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 209 источников, из которых 65 – на иностранных языках.
Пелоидотерапия, классификация и состав лечебных грязей
Частным примером заболевания, связанного с свободнорадикальным окислением является атеросклероз. При сочетанном взаимодействии свобод-норадикальных частиц с фракциями липопротеидов низкой (ЛПНГГ) и очень низкой плотности (ЛПОНП) на клетки интимы сосудов формируются атеро-склеротические бляшки [75].
Другим примером группы заболеваний, в основе патогенеза которых лежит чрезмерное свободнорадикальное окисление является бронхолегочная патология. Избыточное количество активных форм кислорода, возникших под действием этиологического агента (бактерии, вирусы, аутоиммунные антитела), способны повредить эндотелиальноальвеолярный барьер легких, что приводит к развитию тяжелого патологического состояния - отёку легких [14, 41, 136]. Описанное выше состояние зачастую сопровождает такое инфекционное заболевание, как грипп. По данным исследований, эпидемические вспышки гриппа возникают при низкой иммунологической прослойке общества, что связано с множеством факторов, ведущим из которых является гипо- и авитаминоз. Иными словами недостаток в организме витаминов, выполняющих функции экзогенных антиоксидантов. В результате развития патологического процесса в легких под действием вируса гриппа возникает избыточное количество активных форм кислорода, что определяет мутагенез и протеолитическую активность вируса, цитопатический эффект, деструкцию капиллярной сети и стенок капилляров, развитие пневмоний и легочного отека [50, 135].
Многочисленные исследования свидетельствуют, что процессы сво-боднорадикального окисления лежат в основе патогенеза многих хронических заболеваниях (ревматоидный артрит, ревматизм, сахарный диабет и др.), причем избыточное образование активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов проявляется на самых ранних стадиях процесса [138].
В процессе эволюции человеческий организм выработал собственную эндогенную антиоксидантную защиту, которая противостоит ряду заболева 15 ний с свободнорадикальным компонентом в патогенезе. Эндогенную систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов перекисного окисления липидов можно условно поделить на физиологическую и биохимическую [42, 137]. Под физиологическим механизмом понимается единая система, осуществляющая регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам тканей. Биохимический механизм представляет собой собственно антиоксидантную систему организма, то есть широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов.
Физиологический компонент системы антиоксидантной защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическим процессам по его выгодной и безопасной утилизации. Биохимические механизмы антиоксидантной защиты реализуются собственно антиоксидантной системой организма, состоящей из тесно, структурно и функционально связанных между собой звеньев, обеспечивающих превращение избыточной активации перекисного окисления липидов и неконтролируемую продукцию активных форм кислорода на всех этапах этих процессов, как в клетках, так и в межклеточной жидкости и крови [32, 144].
Зачастую физиологические и биохимические компоненты эндогенной антиоксидантной защиты не могут в полной мере ликвидировать избыток образовавшихся в результате патологического процесса активных форм кислорода, поэтому является необходимым коррекция окислительного стресса за счет медикаментозного введения экзогенных антиоксидантов.
Для лекарственной коррекции окислительного стресса широко используют антиоксиданты различной химической природы [168, 190]. В зависимости от источника получения выделяют две большие группы антиоксидантов: природные (биологические) и синтетические.
Большая часть лекарственных препаратов, обладающих антиоксидант-ным действием, представленных на фармацевтическом рынке, относятся к препаратам синтетического происхождения. Синтетические антиоксиданты характеризуются большим количеством противопоказаний и высокой стоимостью препаратов [93]. Подавляющее большинство из представленных синтетических антиоксидантов являются зарубежного происхождения, либо дженериками, отличающимися от оригинальных препаратов составом вспомогательных веществ, уменьшающих антиоксидантную активность.
Такая ситуация не может считаться удовлетворительной, поэтому является важным поиск инновационных биологически активных субстанций природного происхождения, обладающих выраженным антиоксидантным эффектом, на основе которых могут быть созданы лекарственные препараты.
Одним из перспективных источников получения природных биологически активных веществ являются иловые сульфидные грязи, широко распространенные на территории Российской Федерации.
Методы исследования про- и антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов условиях in vivo
Проводили на модельной реакции радикально-цепного инициированного окисления 1,4-диоксана в стандартных ус-ловиях при температуре 348 К и скорости инициирования Vt — Г10" моль/л»с в кинетическом режиме окисления [37], в качестве инициатора окислительных процессов выбран азодиизобутиронитрил (АИБН) с использованием модифицированной установки типа Варбурга [36, 158]. Предварительно 1,4-диоксан (СфНзОг) подвергали очистке по общепринятой методике [130]. АИБН дважды перекристаллизовывали из свежеперегнанного этанола, затем сушили в вакууме. Ионол предварительно очищали перекристаллизацией из этанола; выделенные кристаллы сушили и возгоняли в вакууме. Коммерческий кверцетин (3,3,4,5,7-петнагидроксифлавон) квалификации «ч»
Выражаем благодарность д.ф-м. н., с.н.с, профессору Лебедеву Ю.А. за помощь в проведении данного раздела работы в «Институте физики молекул и кристаллов» УНЦ РАН. 5Выражаем благодарность д.х.н., профессору Герчикову А.Я. за помощь в проведении данного раздела работы на базе кафедры физической химии и химической экологии химического факультета БашГУ. использовали без дополнительной очистки. Кинетические опыты проводили в стеклянном реакторе, в который загружали раствор инициатора в 1,4-диоксане, термостатировали 10 минут, затем следили за поглощением кислорода с помощью универсальной манометрической дифференциальной установки. Скорость окисления V0 определяли по тангенсу угла наклона кинетической кривой поглощения кислорода. Ингибированное окисление 1,4-диоксана проводили в присутствии ионола, кверцетина и фракций гумино-вых веществ пелоидов. В этом случае скорость ингибирования V0 определяли по начальному участку кинетической кривой.
Амперометрический метод. Количественное определение суммарного содержания антиоксидантов было произведено в НПО «Химавтоматика» (г. Москва) методом жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием . Определение осуществляли с помощью прибора Цвет Яуза АА-01, предназначенного для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов [16, 144]. Массовую концентрацию антиоксидантов в гумино-вых веществах измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации кверцетина и/или гуми-новых веществ. Для построения градуировочного графика кверцетина последовательно регистрируют сигналы стандартных растворов кверцетина в порядке возрастания их концентрации. Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняли пять последовательных измерений для каждого из пяти градуировочных растворов кверцетина. Анализ проводили в следующих условиях: постоянно-токовый режим — АД п.т.; потенциал рабочего электрода (Up) - (+)1,3 В; элюэнт: раствор ортофосфорной кислоты (0,0022 моль/л); скорость потока элюента: 1,2 мл/мин; объем вводимой пробы: 1 мл. Регистрацию и математическую обработку результатов анализа осуществляли с помощью универсальной компьютерной системы сбора и обработки информации «Z-lab» либо «Система обработки данных АД&КД».
Выражаем благодарность директору НТЦ "Хроматография" НПО "Химавтоматика" д.хим. н., профессору Яшину ЯМ. за предоставленную возможность в проведении данного раздела работы. Хем и люминесцентный метод. Исследовали Ре2+-индуцированную хеми-люминесценцию по Ю.А. Владимирову. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 0,05М раствора железа (II) сульфата, ускоряющего процессы окисления, определяли спонтанное свечение, амплитуды быстрой и медленной вспышки, светосумму свечения. Величины показателей выражали в условных единицах. Обработку хемилюминограмм производили с помощью специализированной компьютерной программы по P.P. Фархутдинову и В.А. Лиховских.
Количественное определение гуминовых веществ амперометрическим методом Определение осуществляли с помощью прибора «Цвет Яуза АА-01». Анализ проводили в следующих условиях: постоянно-токовый режим - АД п.т.; потенциал рабочего электрода (Up) — (+)1,3 В; элюэнт: раствор ортофосфорной кислоты (0,0022 моль/л); скорость потока элюента: 1,2 мл/мин; объем вводимой пробы: 1 мл. Регистрацию и математическую обработку результатов анализа осуществляли с помощью универсальной компьютерной системы сбора и обработки информации «Z-lab» либо «Система обработки данных АД&КД».
С целью определения биодоступности растворов гуминовых кислот при различных значениях рН и при добавлении диметилсульфоксида готовили растворы с содержанием действующих веществ 0,2% (масс) путем растворения навесок гуминовых кислот в минимальном количестве натрия гидроксида с последующим доведением кислотности полученных растворов до значений рН = 4,0; 6,0; 7,4; 8,0 раствором хлороводородной кислоты. Значение рН определяли с помощью иономера «Анион — 4100». Растворы гуминовых кислот меньшей концентрации готовили путем разбавления.
В качестве биологической мембраны использовали фрагменты кишечной стенки быка (тонкий кишечник). Для изучения проницаемости гуминовых ве 38 ществ использовали диализаторы, в которые помещали 5 мл 0,2% растворов; мембрану диализатора помещали в определенный объем дистиллированной воды. Через 24 часа внутренний раствор подвергали фотометрированию с помощью фотометра «КФК-3», используя кювету с d=10,05.
Эксперимент выполняли на 200 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста массой 180-200г, которые содержались в одинаковых условиях, на стандартной диете в виварии. Экспериментальную острую интоксикацию вызывали однократным внутрижелудочным введением отечественной смеси ПХБ «Совол», включающей 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гек-сахлорбифенилов и следовые количества гептахлорбифенилов в оливковом масле в дозе 600 мг/кг (0,1 LD50) с помощью специального металлического зонда. Контрольная группа животных получила только оливковое масло.
Введение пелоидопрепаратов по лечебной схеме начинали в день затравки (с первого дня). Вводили под кожу животных 0,2 мл 0,1% (в дозе 1 мг/кг) растворы фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот, а также эмульсию гуминовой кислоты в оливковом масле перорально. Контрольной группе животных вводили 0,2 мл физиологического раство-ра(0,9% NaCl). По истечении сроков эксперимента на 3 и 10 сутки животных забивали декапитацией. В плазме крови исследовали показатели состояния оксидантно-антиоксидантной системы.
Хемилюминесцентный анализ5. С целью изучения интенсивности свободнорадикальных процессов проводили хемилюминесцентный анализ плазмы крови с использованием отечественного хемилюминометра ХЛ-003. Исследовали Fe -индуцированную хемилюминесценцию по Ю.А. Владимирову [19, 22, 126]. Хемилюминесценцию (ХЛ) регистрировали в системе, содержащей 20 мл калий-фосфатного буфера (рН 7,45) и 1 мл плазмы крови.
Выражаем благодарность заведующему кафедрой биологической химии БГМУ, д.м.н., профессору Камилову Ф.Х. за предоставленную возможность в проведении данного раздела работы. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 50мМ раствора железа (II) сульфата, ускоряющего процессы перекисного окисления липидов. Для оценки Fe +-индуцированной ХЛ определяли спонтанное свечение, величину латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки, амплитуды быстрой и медленной вспышки, свето-сумму свечения. Обработку хемилюминограмм производили с помощью специализированной компьютерной программы по P.P. Фархутдинову и В.А. Лиховских [126]. Величины показателей выражали в условных единицах. Содержание белка в пробах определяли по Лоури [190].
Определение содержания ТБК - реагирующих продуктов. Тиобар-битуровая кислота — реагирующие продукты (ТБК-РП) определяли с помощью набора реактивов «ТБК-АГАТ» (фирма ООО «АГАТ-МЕД», Москва). В пробирки вносили по 3 мл 1,4% ортофосфорной кислоты, 0,25 мл образца (в контроль — дистиллированную воду), по 1 мл 0,6% раствора ТБК. После охлаждения в холодной воде в пробирки добавляли по 4 мл н-бутанола, после чего центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, отбирали 3 мл суперна-танта, измеряли оптическую плотность при длинах волн 535 и 570 нм опытной пробы против контрольной. Расчет осуществляли по формуле: С = D535-D57o / 0,156 16, где: С - содержание ТБК-ПР в опытной пробе мкмоль/л (г ткани); D535 и D57o_ оптическая плотность опытной пробы при 535 и 570 нм; 0,156 — коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый альдегид -ТБК в мкмоль/см; 16 — коэффициент разведения образца.
Сравнительная характеристика элементного состава компонентов гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей
В спектре гиматомелановых кислот также имеются несколько пиков, отличающихся высокой характеристичностью при интервале 170 м.д. которые являются сигналами атомов углерода сложноэфирных фрагментов, имеющих различное окружение. Пики в области 210-225 м.д. характеризуют присутстсвие карбонильного атома углерода (типа кетонного) связанного с алифатическим фрагментом. Это согласуется с ИК-спектрами экстрактов, в которых наблюдается интенсивная полоса при 1381см" , отвечающая деформационным колебаниям С=0 в сложноэфирных группах. Наличие сигналов СН2- и СН- групп, находящихся рядом с фрагментом COOR, позволяет предположить наличие фрагмента типа у-лактонов.
В интервале химических сдвигов 97-55 м.д. располагаются сигналы карби-нольных атомов углерода углеводных фрагментов.
Таким образом, в фульвовых и гиматомелановых кислотах пелоидов присутствуют олефиновые фрагменты молекулярной структуры, спектры показывают наличие в фульвовых кислотах хиноидных фрагментов, а также преобладающее количество аллильных групп. В спектрах гуминовых и гиматомелановых кислот наиболее выражены пики, которые отнесены к атомам углерода первичного и вторичного характера. Гуминовые кислоты содержат в структуре ароматические фрагменты.
Таким образом, по результатам элементного и спектроскопического анализа структуры гуминовых веществ пелоидов следует, что фульвовые кислоты состоят из алифатических разветвленных фрагментов, содержат вторичные и третичные атомы углерода, связанные с гидроксильными группами. Последний факт свидетельствует о том, что данная фракция включает в себя углеводные фрагменты гуминовых веществ. Гиматомелановые кислоты характеризуются ненасыщенными атомами углерода, способным к окислению, а также содержат кислород в сложноэфирных группах. Гуминовые кислоты — фракция, содержащая ароматические и алифатические фрагменты. Карбоксильные атомы углерода характеризуются в спектрах всех фракций сигналом в области значений химических сдвигов 167-170 м.д. сильнопольный сдвиг которых свидетельствует на присутствие в а-положении электроноакцепторных заместителей типа NH2 или ОН.
В спектре гиматомелановых кислот также имеются несколько пиков, отличающихся высокой характеристичностью при интервале 170 м.д. которые являются сигналами атомов углерода сложноэфирных фрагментов, имеющих различное окружение. Пики в области 210-225 м.д. характеризуют присутствие карбонильного атома углерода (типа кетонного) связанного с алифатическим фрагментом. Это согласуется с ИК-спектрами экстрактов, в которых наблюдается интенсивная полоса при 1381см"1, отвечающая деформационным колебаниям С=0 в сложноэфирных группах. Наличие сигналов СНг- и СН— групп, находящихся рядом с фрагментом COOR, позволяет предположить наличие фрагмента типа у-лактонов.
В интервале химических сдвигов 97-55 м.д. располагаются сигналы карби-нольных атомов углерода углеводных фрагментов. Таким образом, в фульвовых и гиматомелановых кислотах пелоидов присутствуют олефиновые фрагменты молекулярной структуры, спектры показывают наличие в фульвовых кислотах хиноидных фрагментов, а также преобладающее количество аллильных групп. В спектрах гуминовых и гиматомелановых кислот наиболее выражены пики, которые отнесены к атомам углерода первичного и вторичного характера. Гуминовые кислоты содержат в структуре ароматические фрагменты.
Таким образом, по результатам элементного и спектроскопического анализа структуры гуминовых веществ пелоидов следует, что фульвовые кислоты состоят из алифатических разветвленных фрагментов, содержат вторичные и третичные атомы углерода, связанные с гидроксильными группами. Последний факт свидетельствует о том, что данная фракция включает в себя углеводные фрагменты гуминовых веществ. Гиматомелановые кислоты характеризуются ненасыщенными атомами углерода, способным к окислению, а также содержат кислород в сложноэфирных группах. Гуминовые кислоты — фракция, содержащая ароматические и алифатические фрагменты. 3.4. Парамагнитные свойства гуминовых веществ пелоидов
Существенная роль свободных органических радикалов семихиноидного типа в биохимических процессах органических веществ почв показана большим числом экспериментов [64, 78, 149, 180, 184].
Метод электронного парамагнитного резонанса обладает высокой чувствительностью и дает обширную информацию о строении веществ, содержащих свободные радикалы [91, 134]. Данный метод основан на взаимодействии вещества, обладающего парамагнитным спином с магнитным полем. Известно, что при помещении парамагнетиков в магнитное поле, парамагнетик втягивается в это поле, что связано с наличием у них магнитных моментов. Магнитные моменты создаются неспаренными электронами. Проявление магнитного момента у электрона связано с вращением электрона вокруг своей оси (спиновое движение), в результате чего возникает магнитное поле, направленное вдоль оси вращения. Если в ходе химических окислительно-восстановительных реакций у молекулы оказывается нечетное число электронов, то такая молекула приобретает свойства парамагнетика. В сложных биологических системах, состоящих из огромного числа разных молекул, относительное содержание парамагнитных молекул невелико. Связано это, в частности с тем, что большинство свободных радикалов обладают повышенной реакционной способностью и легко вступают в химические реакции с различными внутриклеточными соединениями, в результате чего их времена жизни оказываются, как правило, очень короткими. Поэтому традиционными магнитометрическими методами практически невозможно следить за химическими превращениями парамагнитных молекул в сложных биологических системах. Только метод ЭПР позволяет избирательно детектировать и изучать электронное строение различных парамагнитных частиц в биологических системах.
Основными параметрами спектров ЭПР являются интенсивность, форма и ширина резонансной линии, g-фактор. Интенсивность резонансной линии определяли площадью под кривой поглощения, которая пропорциональна числу парамагнитных частиц в образце.
Определение антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей амперометрическим методом
Полученные результаты (рис.14) свидетельствуют о том, что введение в реакционную систему гуминовых веществ пелоидов приводит к снижению скорости окисления модельного субстрата вследствие обрыва цепи на молекулах ин-гибирующей примеси, (реакция (5)), при этом антиоксидантная активность отдельных фракций выражена не одинаково.
Скорость ингибированного окисления отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов определяли по начальному участку зависимости начальной скорости окисления 1,4 - от концентрации фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов. Начальная скорость без ингибитора составила 27-10" моль-л/сек. Степень торможения (а) окислительного процесса гуминовы-ми веществами определяли по формуле:
Введение в реакционную смесь раствора фульвокислот приводит к снижению начальной скорости окисления модельного субстрата вследствие линейного обрыва цепи (рис.15). Полученные результаты позволяют заключить, что фуль-вовые кислоты ингибируют процесс инициированного окисления в диапазоне концентраций от 0,23 до 7,89 г/л, рассчитанная степень торможения при концентрации фульвовых кислот 7,89 г/л составляет 59%. Скорость окисления 1,4-диоксана перестает зависеть при дальнейшем увеличении концентрации фракции.
Введение гиматомелановых кислот в окисляющийся 1,4-диоксан приводит к снижению скорости поглощения кислорода, причем наибольший эффект ИНГИ 73 бирования наблюдается при концентрации 5,4 г/л. (рис. 16). Данная зависимость имеет предельный характер: при концентрации гиматомелановых кислот, превышающей 5,4 г/л скорость окисления не зависит от количества введенной фракции.
Влияние гиматомелановых кислот на окисление 1,4-диоксана (1) и зависимость параметра ингибирования F (2) от концентрации.
Этот экспериментальный факт свидетельствует об изменении механизма обрыва цепи, а именно - преобладании линейного механизма гибели гидроксипе-роксильных радикалов 1,4-диоксана на молекуле гиматомелановой кислоты.
Степень торможения ингибирующего действия гиматомелановых кислот возрастает при увеличении концентрации от 0,2 г/л - 54% введенного препарата в реакционную смесь до 97 % при концентрации 2,00 г/л, при дальнейшем увеличении концентрации гиматомелановых кислот степень торможения окислительного процесса не изменяется и составляет 97%.
Изучение влияния гуминовых кислот на окисление модельного субстрата (рис. 17) показало, что в области концентраций от 1 до 30 г/л с увеличением концентрации вводимой добавки происходит закономерное снижение скорости окисления 1,4 — диоксана, что служит очевидным доказательством антиоксидантного действия гуминовых кислот. При дальнейшем увеличении концентрации экстракта в модельной системе до 70 г/л происходит увеличение скорости окисления 1,4-диоксана, что свидетельствует о появлении прооксидантных свойств гуминовых кислот в рассматриваемом диапазоне концентраций. [ГК], г/л
Максимальная степень торможения окисления 1,4-диоксана раствором гуминовых кислот составляет 80,8 % при концентрации 30 г/л. При дальнейшем увеличении концентрации степень торможения снижается до 20%.
Влияние гумусовых кислот на окисление 1,4-диоксана (1) и зависимость параметра ингибирования F (2) от концентрации. Гумусовые кислоты проявляют антиоксидантные свойства в диапазоне концентраций от 1 до 37,5 г/л (рис. 18), а при дальнейшем увеличении концентрации наблюдаются прооксидантные свойства, что обусловлено, большим содержанием в них гуминовых кислот. Степень торможения окислительного процесса гумусовыми кислотами составляет 70% при концентрации 37,5 г/л.
Таким образом, введение в систему гуминовых, гиматомелановьтх, фульво-вых и гумусовых кислот приводит к снижению скорости поглощения кислорода. При этом наибольшей антиоксидантной активностью обладают гиматомелано-вые кислоты. Гуминовые и гумусовые кислоты уступают гиматомелановым на 20 и 40% соответственно. По степени торможения окислительного процесса фульвовые кислоты уступают гиматомелановым на 61%. При более низких концентрациях (от 1 до 4 г/л) наблюдается более интенсивное снижение скорости ингибирования. Данный факт может служить доказательством зависимости антиоксидантного действия от концентрации, при минимальных концентрациях гуминовые вещества более активны. Так же данный факт объясняет преобладание антиоксидантного эффекта над прооксидантным в данном диапазоне концентраций исследуемых веществ. При увеличении концентрации экстрактивных композиций начинает превалировать прооксидантный эффект, который также зависит от концентрации веществ.
Наличие в структуре гуминовых и гумусовых кислот пелоидов ароматического углеводородного скелета с содержанием гидроксильных и метоксильных функциональных групп способствует инверсии ингибирующих свойств, вследствие чего скорость окисления 1,4-диоксана в присутствии данных фракций гуминовых веществ начинает возрастать при дальнейшем увеличении их концентрации (от 30 г/л). Это свидетельствует о проявлении прооксидантного действия в данном интервале концентраций.
Гумусовые кислоты обладают схожими антиоксидантными свойствами с гуминовыми кислотами, но менее активно замедляют процессы ингибированного окисления, поскольку имеют более сложное строение, когда функциональные группы находятся внутри глобулярной структуры. Фульвовые кислоты обладают наименьшими антиоксидантными свойствами, так как в их структуре преобладают карбоксильные группы, которые менее активно взаимодействуют с радикалами, образующимися в результате окисления.
Между параметром ингибирования и концентрацией исследуемых кислот в интервале 0,25-30 г/л наблюдается линейная зависимость и, следовательно, предложенное уравнение удовлетворительно выполняется для всех изученных веществ (коэффициент корреляции 0,95). Величина 1п/гт была опреде лена по тангенсу угла наклона зависимости параметра ингибирования F от концентрации гуминовых веществ для каждого образца (рис. 15-18). Линейная зависимость между параметром ингибирования и концентрацией исследуемых кислот в интервале от (0,25-30) г/л свидетельствует о том, что в этом интервале концентраций преобладает квадратичный обрыв цепи инициированного окисления 1,4-диоксана.
Похожие диссертации на Изучение структурных компонентов и физико-химических свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей как источника антиоксидантных лекарственных средств
-
