Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 12
1.2.Характеристика растения Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.) 12
1.2.1. Систематическое положение. 12
1.2.2. Общая характеристика семейства яснотковые (Lamiaceae или Labiatae). 13
1.2.3. Общая характеристика рода (Salvia). 13
1.2.4. Ботаническое описание вида Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.). 14
1.2.5. Морфологическое описание. 14
1.2.6. Культивирование и заготовка ЛРС. 15
1.3. Химический состав шалфея лекарственного и его биологическая активность. 16
1.3.1. Химический состав растения шалфей лекарственный. 16
1.3.2. Химический состав эфирного масла листьев шалфея лекарственного. 16
1.3.3. Антибактериальная активность масла шалфея лекарственного. 20
1.4.Особенности экстрагента, применяемого для получения углеводородного экстракта листьев шалфея лекарственного. 21
1.4.1. Описание экстрагента и изучение его токсичности. 21
1.4.2. Фармакологическое действие петролеума. 23
1.4.3. Применение петролеума в гомеопатии. 24
1.5. Применение листьев шалфея лекарственного. 25
1.5.1. Применение в академической и народной медицине. 25
1.5.2. Шалфей лекарственный в гомеопатии. 27
1.6. Анализ нормативной документации на листья шалфея лекарственного. 27
1.7. Анализ ассортимента лекарственных препаратов, содержащих шалфей. 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 39
2.1. Объекты исследования. 39
2.2.Методика получения липофильных фракций (углеводородного экстракта, спиртовых извлечений, настойки гомеопатизированной матричной гомеопатизированной и эфирного масла). 39
2.3. Методы исследования. 40
Экспериментальная часть. 44
ГЛАВА 3. Изучение физико-химических свойств липофильных фракций листьев шалфея лекарственного. 44
3.1. Определение степени окраски прозрачности и степени мутности углеводородного экстракта. 44
3.2. Смешиваемость углеводородного экстракта листьев шалфея лекарственного. 45
3.3. Кислотное число углеводородного экстракта листьев шалфея. 46
3.4. Определение сухого остатка углеводородного экстракта листьев шалфея лекарственного. 47
3.5. Определение плотности углеводородного экстракта, спиртовых извлечений и петролеума. 49
3.6. Разработка методики проведения тонкослойной хроматографии. 50
3.6.1.Выбор оптимальных условий для получения общего хроматографического портрета. 50
3.6.2. Определение дубильных веществ. 61
3.6.3. Определение флавоноидов. 63
3.7.Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование углеводородного экстрагента, спиртовых и углеводородных извлечений из листьев шалфея лекарственного.
3.8. Сравнительное СФМ исследование эфирного масла, экстрагента и извлечений из свежих и высушенных листьев шалфея лекарственного. 79
3.9. Изучение воздействия ультразвука на экстракцию. 84
3.9.1. Определение сухого остатка углеводородного экстракта, подвергнутого действию ультразвука. 84
3.9.2. Сравнительный хроматографический анализ углеводородных экстрактов. 86
3.10. Изучение настойки гомеопатизированной матричной полученной из высушенных листьев шалфея. 88
3.11. Изучение антиоксидантной активности шалфея лекарственного. 92
ГЛАВА 4. Сравнительный анализ эфирного масла, полученного из листьев шалфея лекарственного с использованием различных методов гидродистилляции и различного срока хранения. 94
4.1. Анализ эфирного масла, полученного из листьев шалфея лекарственного с использованием 1 и 2 метода гидродистилляции. 94
4.2.Сравнительный анализ эфирного масла, полученного из листьев шалфея лекарственного различного срока хранения. 96
ГЛАВА 5 Изучение углеводородного экстрагента (петролеума). 116
5.1. Изучение качественного и количественного состава петролеума. 116
5.2. ИК-спектроскопическое исследование петролеума. 125
ГЛАВА 6. Изучение фармакологической активности углеводородного экстракта листьев шалфея лекарственного и лекарственных форм на его основе. 127
6.1. Получени гомеопатизированного препарата на основе углеводородного экстракта шалфея лекарственного. 127
6.2. Гомеопатизированная и аллопатическая шалфейно-петролеумная мазь для лечения кожного пециломикоза.
Обсуждение результатов. 138
Выводы. 149
Список литературы. 152
Приложение. 173
- Особенности экстрагента, применяемого для получения углеводородного экстракта листьев шалфея лекарственного
- Методика получения липофильных фракций (углеводородного экстракта, спиртовых извлечений, настойки гомеопатизированной матричной гомеопатизированной и эфирного масла).
- Выбор оптимальных условий для получения общего хроматографического портрета
- Сравнительный анализ эфирного масла, полученного из листьев шалфея лекарственного различного срока хранения.
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время все больший интерес вызывают средства природного происхождения. Особое внимание привлекает получение и исследование углеводородных экстрактов из лекарственного растительного сырья (ЛРС).
Известны углеводородные экстракты из плодов грецкого ореха, мяты перечной, тысячелистника обыкновенного и доказана их фармакологическая активность. В выше перечисленных растительных экстрактах используются различные фракции нефти. Керосиновый экстракт из плодов грецкого ореха молочно- восковой зрелости успешно применяется в народной медицине для лечения радикулита, простатита, опухолей (Кашницкий С., 1990). Академик А.Г. Маленков с соавторами (1995) запатентовали препарат тодикамп, полученный из плодов грецкого ореха с помощью нефтяной фракции ленефр.
В настоящее время в ассортименте аптек используются лекарственные препараты, полученные на основе определенных фракций нефти. Так, например, вазелиновое масло или парафин жидкий – фракция нефти, получаемая после отгонки керосина, применяется внутрь при хронических запорах; нефть нафталанская рафинированная, мазь нафталанная, линимент нафталанской нефти, мазь серно-нафталанная, мазь цинко-нафталанная с анестезином, паста цинко-нафталанная, применяемые в качестве смягчающего, дезинфицирующих и болеутоляющих средств, парафин и вазелин - в качестве основ для мазей (Машковский М.Д.,1999; Харкевич Д.А.,2002). В России широко используется импортный гомеопатический препарат петролеум, обладающий широким спектром фармакологической активности (Патудин А.В. с соавторами (2006).
Работа посвящена изучению углеводородного (петролеумного) экстракта из высушенных листьев шалфея лекарственного(Salvia officinalis L.), в котором в качестве экстрагента и, вместе с тем, терапевтически активного начала использовался петролеум. Так как петролеум обладает противовоспалительным, противогрибковым, противопаразитарным действием, а листья шалфея – противовоспалительным действием, то можно прогнозировать фармакологическую активность углеводородных экстрактов, полученных из листьев шалфея, для создания лекарственных препаратов на его основе. Таким образом, изучение биологически активных веществ и фармакологической активности углеводородного (петролеумного) экстракта листьев шалфея для скрининга новых препаратов является чрезвычайно актуальной задачей.
Степень разработанности темы исследования. Ранее изучались углеводородные (петролеумные) экстракты грецкого ореха, мяты перечной и тысячелистника обыкновенного. Углеводородные (петролеумные) экстракты из шалфея лекарственного до настоящего момента времени совершенно не изучены. Отсутствуют литературные данные о химическом составе и фармакологической активности углеводородного экстракта шалфея. Недостаточно изучен химический состав растительного сырья – свежих листьев шалфея лекарственного. Не обоснованы преимущества использования свежих листьев шалфея лекарственного по сравнению с высушенным сырьем.
Цель настоящего исследования
Целью настоящей работы является изучение биологически активных веществ и фармакологической активности липофильной фракции листьев шалфея.
Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Изучить литературу по химическому составу, по фармакологической активности, а также методам анализа основных действующих веществ листьев шалфея.
-
Получить спиртовое извлечение и эфирное масло из свежего и высушенного ЛРС шалфея, настойку гомеопатическую матричную и углеводородный (петролеумный) экстракт из листьев шалфея и провести их анализ.
-
Изучить физико-химические свойства углеводородного (петролеумного) экстракта из листьев шалфея и петролеума (экстрагента), полученного на основе авиационного керосина.
-
Разработать оптимальные условия хроматографирования в тонком слое (ТСХ) углеводородного экстракта листьев шалфея.
-
Провести исследования углеводородного экстракта листьев шалфея и петролеума как экстрагента методами хромато-масс-спектрометрии и спектрофотометрии.
-
Изучить с использованием модельного метода антиоксидантную активность соединений, содержащихся в листьях шалфея.
-
Изучить фармакологическую активность углеводородного экстракта листьев шалфея и препаратов, полученных на его основе
Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.
Научная новизна работы. Впервые получены петролеумные (углеводородные) экстракты из листьев шалфея лекарственного. Описаны физические свойства полученных экстрактов. Методом хромато-масс-спектрометрии изучен состав упомянутых выше экстрактов. Проведен сравнительный анализ химического состава липофильных фракций - спиртового извлечения, эфирного масла и петролеумного экстракта листьев шалфея. Предложены условия для проведения анализа изучаемых фракций методом ТСХ.
Впервые получена мазь, содержащая углеводородный экстракт из листьев шалфея лекарственного, и изучена ее фармакологическая активность in vivo. Изучен качественный состав петролеума, используемого в качестве экстрагента. Получены гранулы гомеопатизированные и мазь гомеопатизированная для лечения кожного пециломикоза.
Теоретическая значимость работы. Доказана на примере шалфея лекарственного эффективность использования петролеума как нового экстрагента при получении препаратов из ЛРС. Методом хромато-масс-спектрометрии доказана изменчивость качественного состава компонентов эфирного масла, полученного как из свежего и высушенного сырья листьев шалфея лекарственного, так и из сырья, хранившегося длительное время. Представленный в работе экспериментально-практический материал может служить теоретической базой для исследования и создания лекарственных препаратов на основе углеводородного (петролеумного) экстракта из листьев шалфея лекарственного.
Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований разработан проект фармакопейной статьи (ФС) на Петролеум и проект ФС на свежие листья шалфея лекарственного. Разработанные проекты переданы для утверждения в установленном порядке. Материалы исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (Акт внедрения).
Методология и методы исследования. Объектами исследования служили углеводородный экстракт листьев шалфея из высушенного сырья, спиртовые извлечения и эфирное масло, полученные из свежих и высушенных листьев шалфея, а также настойка гомеопатическая матричная из высушенного сырья. При выполнении работы использованы методы хромато-масс-спектрометрии, хроматографии в тонком слое сорбента, спектрофотометрии и амперометрии. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ГФХI.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 4 статьи в журналах рекомендуемых ВАК и 1 патент РФ.
Степень достоверности результатов. Для проведения экспериментальных работ использовано современное сертифицированное оборудование; установлена воспроизводимость и правильность результатов исследований; сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными.
Апробация работы. Основное положение диссертационной работы доложено на XXI, ХХII, ХХIII и XXIV Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2011–2014), на научной конференции одаренных студентов и молодых ученых в Самарканде (2011), на Итоговой Всероссийской студенческой научной конференции с международным участием «Татьянин День» (Москва, 2012), на национальном Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2013), на научно-практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (Москва, 2013,2014). Апробация диссертации прошла на кафедре фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова Минздрава России (Москва, 2014).
Личный вклад автора. При непосредственном участии автора были определены цели и задачи исследования, разработаны методологические подходы к их выполнению; был проведен анализ научной и популярной литературы. Диссертант принимал непосредственное участие в работе по идентификации и определению количественного содержания основных биологически активных соединений в исследуемом объекте. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций и нормативных документов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия (фармацевтические науки). Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом: «Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств». Номер государственной регистрации 01201261653.
Основные положения, выносимые на защиту
Результаты исследований качественного состава углеводородного экстракта из листьев шалфея лекарственного и экстрагента.
Результаты исследований качественного и количественного состава терпеноидов в настойке гомеопатической матричной, полученной из высушенных листьев шалфея лекарственного.
Результаты исследований качественного и количественного состава эфирного масла, полученного из свежих и высушенных листьев шалфея лекарственного.
Результаты исследований качественного и количественного состава спиртовых извлечений из свежих и высушенных листьев шалфея лекарственного.
Результаты исследования фармакологической активности углеводородного (петролеумного) экстракта из листьев шалфея и лекарственных препаратов, полученных на его основе.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 38 рисунков, приложение 1,2,3. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 6-ти экспериментальных глав, библиографии из 207 наименований, из которых 72 на иностранных языках.
Особенности экстрагента, применяемого для получения углеводородного экстракта листьев шалфея лекарственного
В качестве экстрагента для получения углеводородного экстракта из листьев шалфея лекарственного использовался «Петролеум», который представляет собой высококипящую фракцию нефти [106,111,172,173].
Гомеопаты используют «PETROLEUM», называемый еще «Каменным или горным маслом», для лечения широкого спектра заболеваний [37,113].
К сожалению, в РФ не производится данный препарат, поэтому вместо него используется авиационный керосин. Мнение ученых о нем довольно противоречивые. По-видимому, это связано с различными марками керосина, условиями его хранения, с различным способом введения его в организм: вдыхание паров, прием внутрь, втирание в кожу. Следует отметить, что керосин является прекрасным растворителем, и при неправильном хранении в него могут попадать токсические вещества, изменяя картину фармакологического эффекта и токсического воздействия. Керосин - это тот же продукт перегонки нефти в диапазоне температур 180-300С. По внешнему виду - это светло-желтая жидкость, с красивой голубой флюоресценцией и своеобразным запахом. В воде керосин нерастворим, растворяется в 90 спирте до 1 - 1,5%, легко растворим в эфире, серной кислоте и хлороформе. Удельный вес керосина - 0,75-0,85. Температура, при которой он начинает кипеть 90С [18,79]. Целебные свойства керосина известны человеку с давних времен. Изучение доступной литературы показывает, что в начале ХХ века керосин широко использовался для лечения животных и человека. В 1936 году Н.И. Вещезеров в экспериментах доказал, что керосин, введенный в желудок животным, не оказывает тяжелых токсических воздействий [24]. В 1939 году М.И. Эммануэль [цитировано по 64] применял керосин для лечения больных людей. Имеются сведения об его использовании во время Первой мировой войны как основного средства лечения ран, а также как противопаразитарного препарата. Зарегистировано, что однократное употребление керосина внутрь не влечет за собой тяжелых токсических явлений. Однако, повторные приемы больших его количеств (до 1 литра) сопровождаются выделением белка в моче, сильным жжением и болями в области желудка, обморочным состоянием, дрожанием и симптомами гастроэнтероколита [24].
Также отмечены токсические эффекты, вызванные химическими ожогами керосином у людей [84,102], случай острого отравления ребенка керосином без смертельного исхода, отравления людей бензином и керосином [25,64].
В работах академика Маленкова А.Г., члена-корреспондента
Самылиной И.А., академика Чебышева Н.В., Стреляевой А.В. доказано, что токсичность авиационного керосина сопоставима с токсичностью этанола [66,95,118]. 1.4.2. Фармакологическое действие петролеума.
Благодаря содержанию в керосине раздражающих, дезинфицирующих и биологически активных веществ, он издавна применяется в народной медицине.
Керосин применяется в разных лечебных направлениях. Например, в Германии, фармацевтическая фирма "Веледа" выпускает очищенный керосин под названием "Петролеум", который можно применять для растирания при ревматических заболеваниях суставов (при артритах). Он обладает положительным раздражающим и отхаркивающим действием при кашле и тяжелых бронхитах (может применяться и для детей). При этом рекомендуется принимать 1 каплю очищенного керосина или "Петролеума" на 1 стакан молока или чая до трех раз в день.
Существует народный способ лечения воспаления миндалин (при ангине) очищенным керосином: этим способом можно лечить ангину только в самом начале этой болезни. В профильтрованный керосин или "Петролеум" обмакивают кусочек ваты, намотанный на конец палочки. Затем этой ваткой смазывают миндалины во рту. Необходимо смазывать глубоко; насколько ватка на палочке может достать, и делать это каждые 30-60 минут в течение одного дня. Ангина быстро проходит [20,87,92,99].
Еще его применяют как средство борьбы со вшами. Для этого вымытые волосы смачивают керосином, на голову надевают платок и выдерживают в течение 30 минут. Затем волосы тщательно и интенсивно расчесывают гребнем для удаления гнид и лишь, затем промывают теплой водой с мылом и высушивают. Этот способ известен на Руси уже столетиями и используется до сих пор особенно там, где отсутствуют специальные лекарственные препараты. Для этой же цели применяют мыльно-керосиновую эмульсию (керосин - 45г, зеленое мыло - 30г, горячая вода - 25 мл.).
Методика получения липофильных фракций (углеводородного экстракта, спиртовых извлечений, настойки гомеопатизированной матричной гомеопатизированной и эфирного масла).
Объектами исследования являлись:
1. Углеводородный экстракт листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), полученный из высушенного сырья.
2. Настойка гомеопатизированная матричная листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), полученная из высушенного сырья.
3. Спиртовое извлечение из листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), полученное из высушенного сырья.
4. Спиртовое извлечение из листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), полученное из свежего сырья.
5. Эфирное масло, полученное различными методами гидродистилляции из свежего, высушенного и сырья с длительным сроком хранения.
6. Экстрагент - петролеум (фракция нефти, выкипающая при температуре 180-300С), полученный на основе авиационного керосина.
7. Препараты, полученные на основе углеводородного экстракта из листьев шалфея лекарственного.
Углеводородный экстракт из листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) готовили методом мацерации в соотношении сырья и экстрагента 1:10 по массе. Брали точную навеску (50 г.) высушенных листьев шалфея лекарственного, соответствующих частной фармакопейной статье ГФ XI издания [34,115].
Мацерацию проводили в течение 2-х недель при периодическом перемешивании каждые 3 дня, затем фильтровали через бумажный фильтр и анализировали физико-химические свойства [21,42]. Спиртовые извлечения из шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) готовили методом мацерации в соотношении сырья и экстрагента 1:10. При изготовлении использовали свежие и высушенные листья шалфея лекарственного в количестве 50г [23,54,112]. Получение гомеопатизированных настоек проводилось в соответствии с ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные» по методу 4. Эфирное масло для исследований получали методом гидродистилляции. Исходное свежее и высушенное сырье - листья шалфея - помещали в перегонную колбу и осуществляли гидродистилляцию: методом Гинзберга и методом Клевенджера [34,198]. В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации. Определение смешиваемсти (ОФС 42-0049-07 ГФ XII издания), а определение кислотного числа и сухого остатка углеводородного экстракта и спиртовых извлечений из листьев шалфея лекарственного проводили согласно методике ГФ XI издания. При определении смешиваемости использовались растворители марки «ХЧ»: хлороформ, гексан, этиловый эфир уксусной кислоты, спирт этиловый . Окраску определяли согласно ОФС 42-0050-07 ГФ XII издания. В статью включены методы контроля качества лекарственных средств по показателям «цветность» и «цветность раствора» [32-34]. Определение прозрачности и степени мутности проводили согласно ОФС 42-0051-07 ГФ ХII издания путем сравнения испытуемой жидкости с растворителем визуально [32].
Определение плотности проводили согласно методике изложенной в ГФ XII издания в ОФС 42-0037-07. При определении плотности мы действовали согласно методу №1, который используется для определения плотности жидкостей с точностью до ± 0,001 г/см3 с помощью пикнометра [32]. Идентификацию БАВ (терпеноидов, флавоноидов, дубильных веществ) проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Silufol UF-254» (Чехословакия), «Sorbfil» (Россия) в системах растворителей: бензол:этилацетат (7:3); хлороформ; бензол:этилацетат (5:1); петролейный эфир:диэтиловый эфир (4:1); хлороформ:спирт (7:3); Безводная муравьиная кислота:этилацетат:толуол (10:30:60); вода:безводная муравьиная кислота:этилацетат (6:6:88); 15% уксусная кислота. В качестве растворов -свидетелей использовались : РСО 1,8-цинеола, РСО -пинена, РСО мирцена, РСО галловой кислоты, рутин 0,025% в 60% спирте, кверцетин 0,025% в 96% спирте [51,134,177].
Другие реактивы и стандартные образцы, необходимые для проведения ТСХ, готовили в соответствии с требованиями ГФ XI издания, Вып. 2 [34]. Компонентный состав полученных образцов эфирного масла, углеводородного экстракта, настойки гомеопатизированной матричной, углеводородного экстрагента (петролеума) изучали методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Исследование проводили на приборе фирмы Agilent Technologies, состоящем из: 1) газового хроматографа 7890 (колонка HP-5, 50 м x 320 мкм x 1.05 мкм) и 2) масс-селективного детектора 5975 C с квадрупольным масс-анализатором. Температурная программа хроматографирования: при 40С - изотерма 2 мин; далее программируемый нагрев до 250С со скоростью 5С/мин; при 250С - изотерма 15 мин; далее программируемый нагрев до 320С со скоростью 25С/мин; при 320С изотерма 5 мин. Инжектор с делением потока 1:50. Температура инжектора 250С. Температура интерфейса 280С. Газ носитель - гелий; скорость потока -1 мл/мин. Хроматограмма образцов - по полному ионному току. Условия масс-спектрометрического анализа: энергия ионизирующих электронов 70 эВ; регистрация масс-спектров в положительных ионах в диапазоне (m/z) от 20 до 450 со скоростью 2.5 скан/сек. Программное обеспечение - ChemStation E 02.00. Идентификацию компонентного состава (качественный анализ) проводили по библиотеке полных масс-спектров NIST-05 и соответствующим значениям хроматографических линейных индексов удерживания (I). Относительное содержание (%) компонентов смеси (количественный анализ) вычисляли из соотношения площадей хроматографических пиков (методом простой нормировки) [57,107,108,171,201]. Оптические спектры поглощения петролеума, экстрактов и эфирного масла были выполнены на однолучевом спектрофотометре Hitachi U 1900в, при комнатной температуре и атмосферном давлении (кварцевая кювета имеет длину оптического пути 10мм). Данные регистрировали и записывали с интервалом 2 нм со скоростью сканирования 1200 нм в минуту в диапазоне от 800 до 200 нм [184].
Изучение воздействия ультразвука на экстракцию проводили в течение разного времени (10 и 60 минут), используя ультразвуковой прибор CITIZEN SW 1500 [15,39,72].
Выбор оптимальных условий для получения общего хроматографического портрета
Тонкослойная хроматография (ТСХ) – это наиболее простой вариант хроматографии. Ее преимущество заключается в том, что при небольших затратах можно быстро и эффективно разделить различные смеси при их минимальном объеме, а также в том, что пластинки для хроматографии производятся промышленным способом.
Согласно исследованиям Карасавиди А.О., изложенным в его диссертации, для определения терпеноидных соединений в эфирном масле шалфея лекарственного наиболее оптимальными системами растворителей являются: хлороформ, гексан:эфир (8:2), бензол:хлороформ (25:75), гексан:этилацетат (9:1), гексан:этилацетат (96:4), бензол:этилацетат (85:15), бензол:метанол (1:1). Причем наилучшее разделение компонентов наблюдалось в системе гексан:эфир (8:2) [40,41]. Выбор систем растворителя проводился с учётом их доступности, безопасности и эффективности. В качестве неподвижной фазы использовались пластинки «Silufol» и «Sorbfil». Для получения достоверных результатов мы соблюдали все необходимые условия хроматографирования. Хроматографирование проводилось в камерах с вертикальным элюированием. Камеры насыщались парами растворителя в течении 2-4 часов, для увеличения эффективности разделения и сокращения времени хроматографирования. Нанесение проб и рабочих стандартных образцов (РСО) проводили микрошприцами. Расстояние от нижнего края пластинки до линии старта – 10 мм, боковых краёв пластинки до точки нанесения пробы – 15 мм. Между наносимыми пробами не менее 10 мм (для избежания краевых эффектов). Фронт пробега растворителя или системы растворителей зависел от используемой пластинки. Обработку полученных хроматограмм проводили вручную. Сравнительный анализ углеводородного экстракта и спиртовых извлечений из листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L) проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» (5х15 см) и «Sorbfil» (10х10 см) в различных системах растворителей. Хроматографирование изначально проводили в подвижной фазе бензол:этилацетат (7:3). Схема хроматографического исследования приведена ниже в табл.3.6.1.1. При хроматографировании с использованием пластинки «Sorbfil» в системе растворителей бензол: этилацетат (7:3). Наблюдалось 10 зон адсорбции в месте нанесения спиртового извлечения из высушенных листьев шалфея лекарственного; 5 зон адсорбции - углеводородного экстракта из листьев шалфея лекарственного и 3 зоны адсорбции -спиртового извлечения из свежих листьев шалфея лекарственного.
Зоны располагались по всей пластине и детектировались 1% раствор п-диметиламинобензальдегидом в 75% растворе серной кислоты.
Как видно из хроматограммы (рис.3.6.1.1.) в углеводородном и спиртовых извлечениях из высушенных и свежих листьев шалфея лекарственного обнаруживаются пятна с Rf 0,72, соответствующие РСО цинеолу.
Также нами был проведен хроматографический анализ углеводородного экстракта из листьев шалфея лекарственного, где условия хроматографирования несколько изменились в качестве подвижной фазы -использовался хлороформ, в качестве неподвижной фазы использовали пластинки: «Silufol» и «Sorbfil». По окончании хроматографирования пластинку с сорбентом обрабатывали путем опрыскивания 1% раствором п-диметиламинобензальдегида в 75% растворе серной кислоте с последующим нагреванием при температуре 105-110С до обнаружения окрашенных зон (табл.3.6.1.3.).
При хроматографировании наблюдалось 4 зоны абсорбции в области нанесения спиртового извлечения из высушенных листьев шалфея лекарственного и 1 зона абсорбции в области нанесения углеводородного экстракта из высушенных листьев шалфея лекарственного.При хроматографировании в данной системе мы наблюдали достаточно четкое разделение зон углеводородного и спиртового экстрактов из высушенных листьев шалфея лекарственного (табл.3.6.1.4). Однако, проведя аналогичное исследование на пластине «Sorbfil» было получено наиболее полное разделение (табл.3.6.1.5).Наилучшее разделение компонентов наблюдалось на пластинке «Sorbfil», на которой выявлено 6 пятен в зоне нанесения спиртового извлечения и 5 пятен (рис.3.6.1.3)в зоне углеводородного экстракта, тогда как на пластинке «Silufol» выявлено 4 пятна в зоне нанесения спиртового извлечения и 1 пятно в зоне углеводородного экстракта. При дневном свете на хроматограмме в зоне нанесения раствора-свидетеля обнаруживается пятно зеленовато-коричневого цвета с Rf 0,82.
Также было проведено хроматографирование в системах растворителей: гексан; петролейный эфир:диэтиловый эфир (4:1); хлороформ:спирт (7:3), но к сожалению, четкого разделения не наблюдалось, а чаще даже зоны адсорбции были завышены (табл.3.6.1.6).
Сравнительный анализ эфирного масла, полученного из листьев шалфея лекарственного различного срока хранения.
В ходе изучения качественного состава образцов эфирного масла, полученных как из свежего растительного материала, так и из высушенного сырья, и сырья, подвергшегося длительному хранению, идентифицировано и проведено сравнение более чем по 113 компонентам смеси. Данные представлены в табл. 4.2.1. Совокупность идентифицированных компонентов эфирного масла условно разбита на две группы: группа I - соединения, относящиеся к определённому биосинтетическому типу терпенов; группа II - соединения, которые не относятся к классу терпенов и терпеноидов (неизопреноидные компоненты). Группу III составили неидентифицированные компоненты. Класс терпенов (группа I) в числе идентифицированных компонентов эфирного масла шалфея лекарственного представлен монотерпенами и монотерпеноидами, относящимися к биосинтетическим типам:
тип туйана - стереоизомерные - и -туйоны; стереоизомерные туйолы; сабинол; -туйен; сабинен; 1-изопропил-4-метиленбицикло[3.1.0]гекс-2-ен;
тип ментана - 1,8-цинеол; лимонен; п-цимол; -терпинен; -фелландрен; -терпинен; терпинолен; дегидро-п-цимол; цис--терпинеол; 4-терпинеол; -терпинеол; -терпинилацетат; ментол; тимол; карвакрол; цис- и транс-карвеолы; карвилацетат; карвон; п-мент-6-ен-2-он; фелландраль;
тип пинана - -пинен; -пинен; транспинокарвеол; транс-пинокарвилацетат; 3-пинанон; 3,6,6-триметил-2-норпинанон; миртенол; миртенилацетат; 2,6,6-триметилбицикло-[3.1.1]гепт-2-ен-4-илацетат;
тип камфана и изокамфана - камфора; борнеол и изоборнеол; борнилацетат; 5-кетоборнилацетат; а-кам-фоленаль; 1,7,7-триметилтрицикло-[2.2.1.0,2,6]гептан (трициклен); камфен (; 2-метил-5-(2-метил-3-метиленбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-2-пентен-1-ол (санталол);
тип изоборнилана и фенхана - а-фенхен; фенхон;
тип метилированного циклогексана - Р-циклоцитраль;
тип ациклических - Р-мирцен; линалоол; линалоол эпоксид; линалилацетат; 5-метил-2-(1-метилэтилиден)-4-гексеналь; 2-изопропилиден-3-метил-гекса-3,5-диеналь; 2,6-диметил-3,7-октадиен-2,6-диол; г/иогераниол (нерол); неролидол;
Сесквитерпены и сесквитерпеноиды представлены компонентами, входящими в биогенетическое древо гермакрана, и относящиеся к биосинтетическим типам:
тип кадинана - а-копаен; 1-изопропил-7-метил-4-метилен 1,2,3,4,4а,5,6,8а-октагидронафта-лин; 1-изопропил-4,7-диметил 1,2,4а,5,6,8а-гексагидронафталин; 5-ка-динен; кадина-1,3,5-триен; а калакорен;
тип эудесмана - а-селинен и сесквитерпеновый лактон эудесма-5,11(13) диен-8,12-олид;
тип аромадендрана - ледол; 1,1,4,7-тетраметил-1а,2,3,5,6,7,7а,7Ь-октагидро-1Я-циклопропа[е]азулен (леден); леден оксид; аромадендрен (1454; 0.06/0.03); аромадендрен оксид; 1,1,4,7-тетраметилдекагидро-4аЯ-циклопропа[е]азулен-4а-ол (палюстрол); спатуленол;
тип бурбонана - а-бурбонен;
биогенетическое древо гумулана представляют следующие идентифицированные компоненты - а-кариофиллен; р-кариофиллен; р-кариофиллен оксид; 10,10-диметил-2,6-диметиленбицикло[7.2.0]ундекан; гумулен; 1,5,5,8-тетраметил-12-оксабицикло[9.1.0]додека-3,7-диен; 2,5,9-триметилциклоундека-4,8-ди-енон;
В ряду дитерпенов и дитерпеноидов идентифицированы компоненты, относящиеся к биосинтетическому типу лабдана, - лабда-8(20),12,14-триен (биформен); лабда-8(20),14-диен-13-ол; лабд-14-ен-8,13-диол (склареол);
Неизопреноидные компоненты (группа II) - 1,1-диметил-2-(2-метил-2 пролпенил)циклопропан; 2-гексеналь; 2,4-диметил-2,4-гептадиен; 5-метил 1,3,6-гептатриен; 1-октен-3-ол; 4-метилбицикло[2.2.2]октан-1-ол; 1,2,2,3 тетраметил-3-циклопентен-1-ол; 6-метил-5-(1-метилэтилиден)-6,8-нонадиен 2-он; геранилацетон; гексагидрофарнезилацетон); 2,2,6-триметил-6-(4-метил 3-циклогексен-1-ил)тетрагидро-2H-пиран-3-ол; п-винилгваякол; п-эвгенол; 6-аллил-4-метокси-1,3-бензодиоксол (миристицин); жасмон; 2,5,8-триметил 1,2-дигидронафталин; Неидентифицированные компоненты (группа III). Таким образом, качественный состав образцов эфирного масла, полученного из свежего, высушенного сырья и сырья хранящегося в течение длительного времени в целом идентичен. Однако в образцах эфирного масла из высушенного сырья в значительном числе случаев наблюдается увеличение относительного содержания некоторых компонентов, содержащих кето-группу или ароматическое ядро, например, стереоизомерные туйоны, камфора, -камфоленаль, 5-метил-2-(1 метилэтилиден)-4-гексеналь, а также п-цимол, тимол, карвакрол и 6-аллил-4 метокси-1,3-бензодиоксол (миристицин). При этом в эфирном масле из высушеннго сырья довольно часто наблюдается снижение относительного содержания компонентов, содержащих гидроксильную, эпоксидную функции или О-ацетильную группу, а также некоторых компонентов, относящихся к моно-, би- и трициклическим терпенам, претерпевающих окисление двойных связей, например, линалоол, линалилацетат, борнеол и стереоизомерные борнилацетаты, 5-кетоборнилацетат, стереоизомерные туйолы, цис-сабинол, 4-тер-пинеол, -терпинеол, аромадендрен оксид, -кариофиллен оксид, 1,5,5,8-тетраметил-12-оксабицикло-[9.1.0]-додека-3,7-диен, а также -пинен, -терпинен, -терпинен, аромадендрен, -копаен, -кадинен, 1-изопропил-7 116 метил-4-метилен-1,2,3,4,4a,5,6,8a-октагидронафталин, - и -кариофиллены. Примечательно, что в эфирном масле, полученном из сырья длительного хранения наблюдается появление сесквитерпенового лактона эудесманового типа - эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид, - образование которого можно объяснить процессами окислительной циклизации.
В ходе спектрофотометрического исследования образцов эфирного масла шалфея лекарственного, полученных из высушенного сырья и сырья с длительным сроком хранения различий в сигналах поглощения обнаружено не было. В обеих пробах зарегистрированы 2 максимума поглощения – при 273 и 235 нм (рис.4.2. 1).
![Синтез, свойства и биологическая активность производных галоген(Н)антраниловых кислот, 3,1-бензоксазин-4(3Н)-онов, хиназолинонов и изучение взаимосвязи структура - активность [Электронный ресурс]](/i/i/4391/182559.png "Синтез, свойства и биологическая активность производных галоген(Н)антраниловых кислот, 3,1-бензоксазин-4(3Н)-онов, хиназолинонов и изучение взаимосвязи структура - активность [Электронный ресурс] Курбатов Евгений Раисович")
