Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы И
1.1. Этиология туберкулеза 11
1.1.1. Характеристика микобактерий туберкулеза 11
1.1.2. Механизмы иммунной защиты от Mycobacteria tuberculesis 16
1.1.3. Основные проблемы неэффективности иммунитета при туберкулезе 18
1.1.4. Профилактика туберкулеза 21
1.1.5. Лечение туберкулеза 26
1.2. Роль цинка как эссенциального элемента 31
1.2.1. Биологическая функция цинка 31
1.2.2. Физиологическая роль цинка 43
1.2.3. Биохимическая роль цинка 49
1.2.4. Роль цинка в иммунном ответе 52
1.2.5. Препараты, содержащие цинк 53
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 58
2.1.1. Объекты исследования 58
2.1.2. Лабораторные животные 58
2.1.3. Культура клеток 58
2.2. Методы исследования 59
2.2.1. Исследования биологической активности с использованием клеточного биосенсора 59
2.2.2. Элементный анализ 61
2.3. Определение размерных спектров супранадмолекулярных комплексов растворов лекарственных средств 62
2.4. Детекция М. tuberculosis 64
2.5. Определение активности естественных киллеров (ЕК) 64
2.6. Статистическая обработка результатов измерений 65
ГЛАВА Ш. Результаты исследования
3.1. Изучение биологической активности фармацевтической композиции (ФК) 66
3.1.1. Обоснование выбора соли Zn (II) и хелатирующего агента (глицин) в качестве основных компонентов фармацевтической композиции 66
3.1.2. Нсаддитивные эффекты при комбинированном действии сульфата цинка и глицина на клеточный биосенсор 69
3.1.3. Влияние исследуемой ФК на активность естественных киллеров 78
3.2. Изучение лечебно-профилактического действия ФК при инфицировании Mycobacterium tuberculosis в модельных экспериментах с лабораторными животными 80
3.3. Изменения содержания микроэлементов в органах и тканях инфицированных животных 83
3.4. Разработка нового экспресс-метода стандартизации жидких лекарственных средств на примере разрабатываемой ФК 91
ГЛАВА IV. Обсуяадение результатов исследования
4.1.1. Микроэлементный подход в характеристике заболеваний 97
4.1.2. Основные подходы к лечению заболеваний микроэлементами 99
4.2. Роль комплексообразоватслей 101
4.3. Модель развития экспериментального туберкулеза 103
Заключение 109
Выводы 111
Библиографический список
- Основные проблемы неэффективности иммунитета при туберкулезе
- Исследования биологической активности с использованием клеточного биосенсора
- Обоснование выбора соли Zn (II) и хелатирующего агента (глицин) в качестве основных компонентов фармацевтической композиции
- Роль комплексообразоватслей
Введение к работе
В последние годы в развитых странах мира, в том числе и в России активно развивается медицинская микроэлементология [32, 39, 46]. Коррекция микроэлементного статуса позволяет существенно улучшать состояние больных при разнообразных заболеваниях с трудом поддающихся химиотерапии, что связано с особенностью метаболизма микроэлементов, а именно постоянством микроэлементных профилей здорового организма [2, 42, 139].
Одним из наиболее значимых микроэлементов, используемых для коррекции микроэлементного статуса является цинк. С одной стороны, сульфат цинка практически не токсичен, с другой стороны, хорошо известно применение солей цинка в качестве антагонистов к меди, хрому, кадмию. Важность коррекции микроэлементного статуса с участием цинка обусловлена распространением цинк-дефицитных состояний, а также его влиянием на предотвращение иммунодефицитов и стимуляцию синтеза антител при инфекционных болезнях [1, 28, 95, 139].
Оценка нарушения микроэлементного гомеостаза при различных заболеваниях и его коррекция микроэлементами - позволяет говорить о новом подходе к лечению, и это особенно важно там, где аллопатическая медицина, использующая препараты органической природы, недостаточно эффективна. Одним из таких заболеваний является туберкулез, от которого ежегодно в мире умирает около 3 млн. человек, несмотря на колоссальные средства направляемые на профилактику и лечение данного заболевания [138], Это в первую очередь связано с возникновением мультирезистентных штаммов микобактерий, а также с возможностью формирования полицеллюлярных, ультрамелких и L-форм Mycobacteria tuberculosis, обладающих повышенной устойчивостью к антибактериальной терапии и действию факторов клеточного иммунитета.
Нашей группой было показано, что внесение в среду культивирования М. tuberculosis ионов цинка влияет на процессы их формообразования - отмечается увеличение количества одиночных форм возбудителя за счет снижения полицеллюлярных и практически полного исчезновение ультрамелких форм [30, 49]. Так же обнаружено, что среди координационных соединений металлов (кобальта, никеля, меди и цинка), обладающих бактериостатической активностью в отношении М. tuberculosis, наиболее эффективными являются препараты, содержащие цинк [26]. На существенное усиление стандартной антимикобактериальной терапии при добавлении хелатов цинка указывают и работы Карьяди [102-104}. Биологическая активность комбинированных препаратов часто проявляется неаддитивно, что свидетельствует об особой важности тщательного подхода к выбору хелатирующего агента С учетом возможности коррекции микроэлементного метаболизма при использовании соединений цинка, эффективного влияния па процессы формообразования микобактерий туберкулеза с целью увеличения их доступности для воздействия факторов клеточного иммунитета (с их одновременной стимуляцией) и антибактериальной терапии нам представлялось весьма актуальным разработать и изучить действие цинк-содержащей фармацевтической композиции.
Цель работы.
Создание новой высокоэффективной, нетоксичной 2п2т-содержащей фармацевтической композиции, предотвращающей образование нефагоцитируемых колониальных и ультрамелких форм микобактерий туберкулеза и стимулирующей активность факторов клеточного иммунитета.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработать состав фармацевтической композиции (ФК) на основе водных растворов Zn2+ и хелатирутощего агента.
Изучить биологическую активность ФК и ее компонентов с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики гибели.
Определить действие ФК на некоторые факторы клеточного иммунитета в опытах на лабораторных животных.
Исследовать наличие лечебно-профилактической активности разрабатываемой ФК при инфицировании лабораторных животных микобактериями туберкулеза.
Разработать методику пробоподготовки органов и тканей животных для последующего микроэлементного анализа методом атомно-абсорбционной спектрометрии с зеемановской коррекцией фона.
Определить микроэлементные профили органов и тканей у здоровых, инфицированных М. tuberculosis животных и животных, прошедших курс лечения разработанной ФК.
Разработать на примере изучаемой ФК лазерный экспресс-метод стандартизации и контроля качества жидких лекарственных средств (ЛС).
Научная новизна.
Теоретически обосновано конструирование фармацевтической композиции, включающей сульфат цинка и глицин, а также воду с измененным изотопным составом. Экспериментально подтверждено ее лечебно-профилактическое действие при инфицировании лабораторных животных микобактериями туберкулеза.
Изучена биологическая активность разработанной фармацевтической композиции с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики
гибели. Выявлено, что применение ФК вызывает триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора, тогда как индивидуальное действие компонентов подчиняется стандартной аррениусовской зависимости.
Показана трехкратная активация естественных киллеров при применении данной ФК.
Разработана новая методика пробоподготовки органов и тканей животных с [грименением жидкого азота для последующего микроэлементного анализа с использованием зеемановской атомно-адсорбцжжной спектрометрии.
Впервые проанализирована взаимосвязь полученных данных по изменению микроэлементного состава (Al, Cr, Mn, Ni, Си, Zn, Cd, Pb, Se, Fe) органов и тканей животных с наличием возбудителя туберкулеза.
Получены микроэлементные профили, характеризующие ткани и органы животных в здоровом и инфицированном состоянии.
Подана патентная заявка на разработанную ФК, как средство для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза (патентная заявка № 2004135345/15(038452) от 03.12 2004. Положительное решение ФИПС от 26.01.05.).
Практическая значимость работы:
Полученные в ходе проведенной исследовательской работы результаты могут быть использованы при разработке новых схем профилактики и лечения туберкулеза, поскольку разработанная композиция влияет на процессы межпопуляционных переходов и формообразования микобактерий туберкулеза, способствуя увеличению их доступности к действию иммунной системы (с одновременной ее стимуляцией) и стандартной химиотерапии.
Установленные изменения микрозлементньтх профилей органов и тканей инфицированных животных (печень, кровь, легкие), в комплексе с другими показателями могут быть использованы при диагностических исследованиях на туберкулез.
Разработан экспресс-метод стандартизации и контроля качества растворов ЛС по определению размерных спектров супранадмолекулярных (СИМ) комплексов воды на основе лазерной дифракции.
Методика стандартизации растворов ЛС внедрена в учебный процесс (специальность фармацевтическая химия) кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанная фармацевтическая композиция на основе сульфата цинка, глицина и
воды с измененным изотопным составом демонстрирует выраженный триггерный эффект
на клеточном биосенсоре, свидетельствующий о неспецифической активации защитных свойств эукариотической клетки, за счет синергитического действия компонентов.
Микроэлементные профили в органах и тканях лабораторных мышей инфицированных микобактериями туберкулеза могут служить маркером заболевания животных.
Разработанная фармацевтическая композиция стимулирует активность естественных киллеров, являющихся одним из факторов клеточного иммунитета и снижает вероятность инфицирования лабораторных животных микобактериями туберкулеза.
4. Разработанный лазерный экспресс-метод анализа растворов путем определения
размерных спектров СНМ комплексов воды может быть использован для стандартизации
и контроля качества растворов лекарственных средств.
Апробация работы:
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Итоговая конференция СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2003), XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2004), I Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биоэлементы» (Оренбург, 2004), V международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), 1-ый съезд РОСМЭМ «Актуальные вопросы медицинской элементологии» (Москва, 2004), XI Международная конферепция «Новые медицинские технологии и квантовая медицина» (Москва, 2005).
Основные проблемы неэффективности иммунитета при туберкулезе
Мононуклеарные фагоциты представляют один из наиболее важных компонентов клеточного иммунитета [51]. Хорошо известны следующие антимикобактериальпые эффекторпые функции макрофагов осуществляющиеся по I,-аргинин зависимому цитотоксическому пути: фагосомо-лизосомные комплексы, генерация реактивных переносчиков кислорода (РПК) при кислородном взрыве, образование реактивных азотных посредников (РПА) [69, 70].
Лизосомы представляют собой весьма сложный комплекс органелл, содержащих в мембранах большое число ферментов, способных разрушать самые разные макромолекулы [61, 108]. Оптимальные условия для функционирования этих ферментных систем обеспечиваются благодаря слабой кислотности среды внутри лизосом (рН 5). В поддержании подобной кислотности важная роль принадлежит АТФ-зависимому ионному насосу [135]. Считается общепризнанным, что микроорганизмы, фагоцитированные макрофагами или другими подобными клетками, разрушаются в фагосоме этих клеток под воздействием разных лизосомальных ферментов, попадающих в данный субклеточный регион в результате фаголизосомального комплексирования. Процесс подобного комплексирования тонко регулируется и, вероятнее всего, представляет собой один из наиболее важных антимикробных механизмов фагоцитов [51,86].
Микобактерий туберкулеза продуцируют большое количество аммония [65]. Это летучее и слабое основание накапливается в культуральных фильтратах микобактерий в количествах от 20 мМ и выше, что и придает суиранатанту вирулентных культур М tuberculosis способность ингибировать образование фаголизосомальных комплексов. Кроме того, хлорид аммония нарушает движения лизосом и ощелачиваст интрализосомальнуго среду [75, 105]. Таким образом, выработка значительных количеств аммония обеспечивает М. tuberculosis потенциальную возможность избежать токсического действия среды в лизосомальных вакуолях посредством ингибирования возникновения фагосомно-лизосомных комплексов и снижения активности лизосомальных ферментов из-за ощелачивания [135].
Сульфатиды, продуцируемые микобактериями, представляют собой лизосомотропные полиаиионные гликолипиды, производные мультацелата трегалозо-2 сульфата. Они рассматриваются в настоящее время как еще один из факторов, ипгибирующих образование фаголизосомальных комплексов [51, 124]. Респираторный взрыв
Считается, что важная роль в защите макроорганизма от бактериальных инфекций принадлежит реактивным переносчикам кислорода (РГТК) [87, 153]. Так было обнаружено, что Н2О2, выделяемая макрофагами мыши, активированными лимфокинами, убивает М. microni [161]. Было предпринято множество исследований киллерных механизмов кислородных радикалов относительно М. tuberculosis. Однако, в этих исследованиях было выявлено, что кислородные радикалы не всегда в состоянии ингибировать и убить микобактерий туберкулеза [52, 70]. Механизм, позволяющий выживать М. tuberculosis осуществляется с помощью таких компонентов микобактериальной клетки, как липоаробиноманнан (LAM) и феноликогликолипид 1 (PGL-1). Микобактерии туберкулеза в большом количестве производят LAM, который является главным компонентом их клеточной стенки. Подобная локализация ставит LAM на первую линию атаки, направленной против антимикробных механизмов макрофагов. Было показано, что LAM успешно избегает действия РПК [69, 89]. LAM ингибирует активность протеинкиназы С-фермента, играющего важную роль в активировании кислородного взрыва в фагоцитах. Также LAM оказывает влияние на IFN-y, относящийся к важным факторам активирования макрофагов и их способности усиливать продукцию РПК. LAM ингибирует транскрипционную активность индуцирующего IFN-y гена [81].
Один из механизмов выживания М. tuberculosis и спасения от токсического действия РПК - их уклонение от связывания с поверхностными компонентами макрофагов, например с Fc-рецепторами, провоцирующими кислородный взрыв. Вместо этого паразитирующие в макрофагах микобактерии связываются с комплиментарными рецепторами CR1 и CR3, молекулы интегриновой группы которых, не инициируют продукцию РПК у макрофагов в состоянии покоя [147, 156]. Таким образом, использование интегриновых рецепторов может служить обычной схемой выживания микобактерии.
Исследования биологической активности с использованием клеточного биосенсора
Spirostomum ambigua O.F.Muller, 1786 (использовался штамм проф. Леонидова, ГНИЙ "Биоэффект") - одна из наиболее широко распространённых спиральноресничных инфузорий (Spirostomidae, Heterotricha, Ciliophora), классический объект исследований в биологии клетки и при биоиндикации. В природных условиях сапротрофит-детритофаг, часто обнаруживается в сильно загрязнённых и крайне микроанаэробных точках. Имеет лентовидную, несколько дорзо-вентрально уплощенную форму тела, около 1 мм длиной, соотношение длины тела к его ширине примерно 1:10, макронуклеус четковидный, ротовой аппарат доходит до задней трети тела. Будучи потревоженным, клетка даст мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2-3 раза. Параметры сокращения зависят от температуры. Используемый штамм культивировали при концентрации 30-50 клеток/мл при температуре 20-24 С. Штамм характеризовался высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении.
Установка для исследования температурной зависимости кинетики гибели
Установка состояла из следующих частей: 96-луночный планшет для иммуноферментного анализа, размещенный на твердотельном термостате фирмы "Биоком" (Москва) либо стеклянная ячейка с девятью лунками и проточным термостатированием. Контроль за стационарным значением температуры и однородностью нагрева по всей площади планшета осуществлялся с помощью безинерционного четырехканального электротермометра Т4К производства НПФ "ДНК Технология" (Москва). Наблюдение за поведением инфузории вели визуально с помощью бинокуляра или видеоприставки к бинокуляру соединенной с монитором. Для освещения использовали маломощные лампы ( 10 Вт) дневного света. В каждую из лунок планшета вносили по 300 мкл (или 60 мкл) исследуемого раствора или дистиллированной воды (контроль). Далее в каждую из лунок отсаживали (без барбатирования) по одной инфузории 5". ambigua стеклянной пипеткой с диаметром носика более 1 мм. Время жизни клетки рассчитывали как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатировали либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием сократительной реакции на механическое раздражение. Для каждой концентрации токсиканта определяли время жизни (т\) как среднее из 3-8 измерений. Относительная ошибка измерения времени жизни не превышала 15-20%.
Гибели клетки предшествует формирование промежуточного состояния (с изменением морфом етрических характеристик, оптических свойств, зернистости цитоплазмы) а также целый комплекс специфических поведенческих реакций. В норме, S. ambigua совершает свободное передвижение в толще раствора с характерным чередованием сжатия/вытягивания клетки. В среде, содержащей компоненты фармацевтических препаратов, такое передвижение может сопровождаться конвульсивными подергиваниями, фиксацией около стенки ячейки, прецессионными движениями и другими характерными отклонениями от нормального плавания в трехмерной среде.
Для контроля дрейфа температуру раствора рассчитывали как среднее между значениями на момент посадки инфузории в лунку и на момент гибели по данным 2 датчиков электротермометра. Относительная ошибка измерения температуры не превышала 3%. На всем использованном интервале температур и времени инкубации не было отмечено ни гибели, ни угнетения активности, ни морфологических изменений клеток штамма в дистиллированной воде. Пробоподготовка образцов для элементного анализа
Сразу после умерщвления животных изымали органы и ткань и замораживали в жидком азоте. Зачем их измельчали в тефлоновом гомогенизаторе с добавлением жидкого азота, огбирали навеску (0,5-1 г) и инкубировали в царской водке (5 мл) в течении 1 суток в тефлоновых бомбах. Далее минерализацию образцов проводили под давлением в микроволновой печи MDS2000 при следующем режиме: 2 мин. 20 сек. - при 80% мощности, 5 мин. - при 100% мощности.
Определение содержания микроэлементов методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией (ААС-ЭА)
Содержания микроэлементов в образцах определяли с помощью атомно-адсорбционного спектрометра «SpectrAA-800» с электротермической атомизацией и эффектом Зесмана по протоколу фирмы "Varian" с модификациями по результатам международной интеркалибрации с лабораторией MEL МАГАТЭ (Монако). Источником излучения служили одноэлементные лампы полого катода SpectrAA фирмы "Varian". Ток ламп для элементов Cd, Си, Ni - 4,0 мА; для Pb, Mn, Zn - 5,0 мА; для Сг - 7,0 мА. Ширина гцели монохроматора составляла 0,5 нм, за исключением измерений Сг, Мп (0,2 нм) и Zn (],0 нм). .Были использованы режим коррекции базовой линии и горячий впрыск - 50 С, кроме Ni и Мп - 60 С.
Обоснование выбора соли Zn (II) и хелатирующего агента (глицин) в качестве основных компонентов фармацевтической композиции
Явление изменчивости микобактерий туберкулеза было обнаружено вскоре после их открытия. Уже в 1888 г. Мечников сообщил, что в культурах, кроме типичных палочек Коха, встречаются полиморфные формы микроорганизмов в виде коротких, соединенных попарно звеньев и гигантских образований с колбовидньши разветвлениями. Затем появились сообщения о возможности существования у микобактерий туберкулеза фильтрующихся форм [51]. Было установлено, что ультрамелкие формы и L-формы обладают повышенной устойчивостью к химиотерапии и могут реверсировать в палочковидные формы [23]. Образование полицеллюлярных, колониальных форм является общей для многих организмов адаптивной реакцией на неблагоприятные внешние воздействия, включая и химиотерапию [14, 21]. Межсубпопуляционные видоизменения позволяют поднимать еще одну проблему неэффективности, как иммунитета, так и лекарственной терапии при инфицировании М. tuberculosis [49].
В нашей группе было показано, что при росте культуры М. tuberculosis полицеллюлярным колониальным формам принадлежит на определенных стадиях развития до 90% биомассы клеток. Внесение в среду культивирования хелатных комплексов, включающих сульфат цинка и глицин приводило к изменению массовых соотношений субпопуляций в полиморфной культуре М. tuberculosis и перераспределению биомассы в сторону образования палочковидных форм. Кроме снижения более чем в 10 раз концентрации колониальных, полице ллюлярных форм, происходило также практически полное исчезновение ультрамелких форм [30].
Изменения формы микобактерий туберкулеза сопряжены с изменениями концентрации металлов в биомассе в частности цинка. Межсубиопуляциопныс переходы можно схематично описать как квазихимическую реакцию (схема 1).
Схема I. Изменение субпопуляционного состава культуры микобактерий туберкулеза при внесении в среду культивирования комплекса, включающего сульфат цинка и глицин до концентраций І мМ и 20 мМ. V—ультрамелкие формы ( 0,5 мкм), С—одиночные формы (4 — 8 мкм), РС ассоциаты (80 мкм).
В соответствии со вторым законом термодинамики и следующим из него принципом Ле-Шателье возможно влияние на процессы формообразования, сдвигая "равновесие" в сторону образования "С-форм". Так внесение в среду инкубации Zn2\ будет влиять на межсубпопуляционные переходы в сторону смещения М- tuberculosis к палочковидным формам, более доступным для фагоцитоза и лекарственной терапии. Такое применение сульфата цинка может быть перспективно для профилактики и увеличения эффективности антибактериальной химиотерапии туберкулеза. Именно соль цинка (II) (а не иных металлов способствующих указанному смещению равновесия согласно схеме 1) выбрана потому, что сульфат цинка практически не токсичен [1, 461. На основе схемы 1 нами проведено моделирование (в соответствии с кинетической теорией межпопуляционных клеточных переходов [49] изменения численности палочковидных форм микобактерий после инфицирования при различных концентрациях цинка. При значениях кинетических констант полученных в результате работы нашей группы возможно значительное снижение концентрации возбудителя на тридцатый день после инфицирования при трехкратном увеличении поступления цинка в организм (Приложение I).
Известно, что чаще всего в группу риска по туберкулезу попадают люди получающие недостаточное питание [511, а следовательно испытывающие как дефицит витаминов, так и микроэлементов, в частности цинка [102]. Роль цинка в настоящее время достаточно хорошо изучена. Цинк входит в структуру активного центра нескольких сотен металлоферментов [1]. Цинк жизненно важен для функционирования тимуса и нормального состояния иммунной системы организма. Являясь, к тому же, компонентом ретинолпереносящего белка, вместе с витамином А и витамином С препятствует возникновению иммунодефицитов, стимулируя синтез антител [46].
Вместе с тем, хорошо известно, что при непосредственном введении соли цинка Б организм большая часть ее выводится [1, 49]. Для улучшения биодоступности сульфата цинка в качестве лиганда был выбран глицин. Метаболит широкого спектра действия, специфический регулятор активности нервных клеток - глицин является естественным тормозным медиатором, взаимодействует с глицинэргическими рецепторами. Глицин используется в целом ряде метаболических превращений, происходящих в живой клетке [53]. Необходимо особо выделить участие глицина в синтезе глутатиона - трипептида, являющегося источником восстановленных SH-групп. Активация синтеза глутатиона приводит к увеличению компенсаторных возможностей клетки в период окислительного стресса и модулирует работу иммунной системы [53]. Еще один важный аспект — прямая неспецифическая конъюгация ксенобиотиков. Глицин применяется в медицине как антистрессовое, ноотропное, нормализующее обменные процессы средство.
В практике исследования токсичности лекарственных средств широко применяются диаграммы «Доза-Ответ» [33]. Для изучения исследуемой композиции использовали клеточный биосенсор Spirostomum ambigua, который применяется и для изучения биологической активности компонентов лекарственных препаратов, демонстрируя высокую корреляцию результатов биотестирования с клинической практикой [15]. В этом методе используется диаграмма «Доза-Ответ» (концентрация-время жизни) и зависимость времени жизни клеточного биосенсора от температуры.
Роль комплексообразоватслей
Заражение человека туберкулезом происходит в большинстве случаев через дыхательные пути, реже через желудочно-кишечный тракт. Наблюдаются случаи заражения через поврежденную кожу и слизистые оболочки [65]. Возможно и внутриутробное заражение плода у больной туберкулезом матери [52, 51]. При первичном инфицировании микобактерий встречаются с фагоцитами, распознаются ими как инородные тела и подвергаются фагоцитозу. Макрофаги фиксируют микобактерий на клеточной мембране, затем инвагинируют их в клетку с образованием фагосомы. Фагосома сливается с лизосомой, образуя фаголизосому, в которой и происходит разрушение микобактерий. Однако, по ряду причин указанных выше такой механизм не всегда эффективен. Попадая в неактивированный макрофаг, микобактерий могут сохранять жизнеспособность и даже размножаться. В результате макрофаг разрушается, и микобактерий оказываются вне клеток.
Естественные киллеры (ЕК) играют решающую роль в защитных реакциях против М. tuberculosis, особенно на ранних этапах туберкулезной инфекции [51]. В ответ на действие интерлейкина 12 (ИЛ-12), продуцируемого рядом иммунных клеток, ЕК вырабатывают IFN-y, что позволяет быстро активировать антимикобактериальную активность макрофагов, еще до экспансии и дифференциации специфических Т-лимфоцитов [77]. Особенно важно отметить, что лишь активированные макрофаги обладают способностью убивать поглощенные ими М. tuberculosis, тогда как М, tuberculosis быстро размножаются в фагоцитировавших их неактивированных макрофагах. Цитоплазма этих макрофагов представляет собой благоприятную "среду" для подобного размножения микобактерий [52, 107]. Таким образом, неактивированные макрофаги являются своеобразным "депо" для развития и распространения инфекции.
Но даже активированные макрофаги не всегда эффективны. Избежать их экспансии микобактерий туберкулеза могут за счет полиморфизма. С одной стороны, в ответ на агрессию иммунной системы они могут образовывать полицеллюлярные ассоциаты, против которых макрофаги бессильны, с другой стороны - образование дормантных ультрамелких и L-форм, присутствие которых макрофаги «не замечают» [23]. По всей видимости, вероятность образования полицеллюлярных ассоциатов или ультрамелких форм зависит от количества микобактерий. Так при большой концентрации возбудителя образование ассоциатов наиболее вероятно, тогда как при низких концентрациях более очевиден переход в сторону L-форм и ультрамелких форм. Такие межсубпопуляционные видоизменения являются способом ухода как от действия химиопрепаратов, так и иммунной системы {схема 3.). После окончания курса химиотерапии, или в результате ослабления защитных сил организма возможно реверсирование микобактерий туберкулеза в активное палочковидное состояние. В результате исследований, проведенных в нашей группе, было обнаружено, что изменения формы микобактерий туберкулеза сопряжены с изменениями концентрации металлов в биомассе, в частности цинка [9, 30]. Использование ионов цинка представляется перспективным как для смещения равновесия в сторону палочковидных форм, так и для усиления иммунного ответа (схема 3.)
Для количественной оценки эффективности применения 2п2+-содержащего препарата нами было проведено моделирование изменения концентрации палочковидных форм микобактерий согласно кинетической схеме межпопу ля ционных переходов, сопряженных с выделением/поглощением цинка в биомассе (схема 3.). На схеме отражено деление палочковидных форм и гибель микобактерий, как спонтанная, так и индуцированная при 7п2+-зависимом иммунном ответе.
Решением данной кинетической схемы будет уравнение в неявном виде, из которого численно можно получить вид зависимости m(t, [Zn]), где m - численность (или биомасса) палочковидных форм, t - время, [Zn] - концентрация цинка. Условия построения модели и сё численного решения приведены в Приложении 1. Как следует из рис. 17, при избыточном по отношению к норме содержании цинка наблюдается спад в численности микобактерий с недельной кинетикой. При трехкратном избытке цинка на 30 деггь наблюдается значительное (более 95%) уменьшение численности возбудителя, что и было показано нами экспериментально при инфицировании мышей (табл. 5. 6). Однако при недостатке цинка численность микобактерий туберкулеза растет, удваиваясь к 90 дню после инфицирования. Следует подчеркнуть, что критическими для данной модели является параметр п - число палочковидных форм, формирующих недоступные для макрофагов микобактериальные ассоциаты и колонии, а также константа равновесия перехода одиночных палочковидных форм в дормантные ультрамелкие, как описано в Приложении 1. Основной результат данного моделирования является тот, что именно «депонирование» биомассы микобактерий в формы, недоступные для фагоцитоза и лекарственной терапии есть основной фактор развития микобактерий туберкулеза в организме, возникающий при нарушении микроэлементного статуса.
