Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Ботанико-фармакогностическая и фито-химическая характеристика брусники, клюквы и черники 12
1.1. Краткая характеристика семейства вересковые 12
1.1.1. Ботаническое описание 12
1.1.2. Химический состав, применение в медицине 13
1.2. Краткая характеристика и применение брусники 18
1.2.1. Ботаническое описание 18
1.2.2. Ареал 18
1.2.3. Заготовка сырья 19
1.2.4. Культивирование 19
1.2.5. Химический состав 20
1.2.5.1. Химический состав плодов 20
1.2.5.2. Химический состав листьев 21
1.2.6. Применение 22
1.2.6.1. Применение в народной медицине 22
1.2.6.2. Применение в научной медицине 23
1.2.7. Переработка 25
1.3. Ботанико-фармакогностическое описание, применение в медицине и пищевой промышленности клюквы 25
1.3.1. Ботаническое описание 25
1.3.2. Ареал 26
1.3.3. Заготовка сырья 26
1.3.4. Культивирование 27
1.3.5. Химический состав 27
1.3.5.1. Химический состав плодов 27
1.3.5.2. Химический состав листьев 28
1.3.6. Применение 29
1.3.6.1. Применение в народной медицине 29
1.3.6.2. Применение в научной медицине 29
1.3.7. Переработка 31
1.4. Ботанико-фармакогностическое описание, применение в медицине и пищевой промышленности черники 32
1.4.1. Ботаническое описание 32
1.4.2. Ареал 32
1.4.3. Заготовка сырья 33
1.4.4. Химический состав 33
1.4.4.1. Химический состав плодов 33
1.4.4.2. Химический состав листьев 34
1.4.5. Применение 35
1.4.5.1. Применение в народной медицине 35
1.4.5.2. Применение в научной медицине 37
1.4.6. Переработка 40
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 40
Часть II Экспериментальная
Глава П. Объекты и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Методы исследования 42
2.2.1 . Обнаружение некоторых групп природных соединений 42
2.2.1.1. Флавоноиды 42
2.2.1.2. Гидроксикоричные кислоты 43
2.2.1.3. Фенологликозиды 43
2.2.1.4. Антоцианы 43
2.2.1.5. Иридоиды 43
2.2.1.6. Дубильные вещества 43
2.2.2. Идентификация природных соединений 43
2.2.2.1. Флавоноиды 43
2.2.2.2. Гидроксикоричные кислоты 45
2.2.2.3. Фенологликозиды 45
2.2.2.4. Антоцианы 45
2.2.2.5. Иридоиды 46
2.2.3. Количественное определение природных соединений . 46
2.2.3.1. Флавоноиды .-. 46
2.2.3.2. Гидроксикоричные кислоты 47
2.2.3.3. Фенологликозиды 47
2.2.3.4. Антоцианы 47
2.2.3.5. Полифенольные окисляемые соединения 47
2.2.3. Элементный анализ 48
2.2.4. Токсикологическое и фармакологическое изучение черники, брусники и клюквы 50
2.2.4.1. Методы исследования фармакологических свойств 50
2.2.4.2. Токсикологическое исследование 52
2.2.5. Методы биохимических исследований 52
2.2.5.1. Катехоламины 53
2.2.5.2. Серотонин и гистамин 53
2.2.5.3. 11-Оксикортикостероиды 54
2.2.5.4. Гаммааминомаслянная, аспарагиновая и глутамино-вая кислоты 54
2.2.6. Методы статистической обработки 54
Глава III. Сравнительный рентгенофлуоресцентный анализ элементного состава и экологическая характеристика объектов исследования 55
3.1. Брусника 55
3.2. Клюква 63
3.3. Черника 68
3.4. Сравнение элементного состава плодов и листьев изучаемых растений 72
3.5. Сравнительный анализ исследуемых растений с другими видами семейства вересковые 76
3.6. Экологическая характеристика почв и листьев изучаемых растений 81
3.6.1. Почвы 81
3.6.2. Листья 85
Заключение 86
Глава IV. Изучение природных соединений листьев и плодов брусники, клюквы и черники 90
4.1. Идентификация природных соединений 91
4.1.1. Идентификация флавоноидов 91
4.1.2. Идентификация гидроксикоричных кислот 91
4.1.3. Идентификация фенологликозидов 93
4.1.4. Идентификация антоцианов 94
4.1.5. Идентификация иридоидов 94
4.2. Разработка методик количественного определения фе-
нольных соединений для изучаемых растений 95
4.2.1. Разработка методики количественного определения флавоноидов 95
4.2.2. Разработка методики количественного определения гидроксикоричных кислот 99
4.2.3. Разработка методики количественного определения фенолгликозида арбутина 102
4.2.4. Сравнительный анализ разработанного и официального методов количественного определения арбутина... 104
4.3. Количественное определение отдельных групп природных соединений 107
4.4. Стандартизация объектов исследования 108
4.4.1. Рекомендуемые числовые показатели содержания отдельных групп фенольных соединений в плодах и листьях изучаемых растений 111
4.4.2. Рекомендуемые числовые показатели содержания отдельных групп фенольных соединений в экстрактах плодов изучаемых растений 112
Заключение 114
Глава V. Сравнительное токсикологическое и фармакологическое изучение экстрактов плодов брусники, клюквы, черники, смеси экстрактов валерианы и черники 115
5.1. Исследование токсикологических свойств 115
5.1.1. Определение основных параметров токсичности 115
5.1.2. Влияние на кожные покровы и слизистые оболочки глаза 116
5.1.3. Кожно-резорбтивное действие 116
5.1.4. Сенсибилизирующее действие 116
5.2. Исследование фармакологической активности 117
5.2.1. Исследование адаптогенных свойств 117
5.2.1.1. Антигипоксическое действие 117
5.2.1.2. Актопротекторное действие 118
5.2.1.3. Стресспротективное действие 119
5.2.2. Влияние на поведенческие реакции белых крыс 123
5.2.3. Противоболевая и противовоспалительная активность. 124
5.2.4. Влияние экстрактов плодов черники, брусники и клюквы на биохимические показатели организма интакт-ныхкрыс 125
5.3. Фармакологическое изучение экстрактов плодов черники, корней с корневищами валерианы, их смеси и диазепама 131
5.3.1. Изучение влияния на поведенческие реакции белых крыс 131
5.3.2. Антигипоксическая активность 132
5.3.3. Актопротекторная активность 132
5.3.4. Стресспротективная активность 133
3.5. Защитное действие ЭПЧГ + ЭЮШГ при комплексных и
альтернативных воздействиях 136
5.3.6. Влияние экстрактов черники, валерианы, ЭПЧГ +
ЭККВГ и диазепама на биохимические показатели у
крыс на фоне иммобилизационного стресса 138
5.3.6.1. Катехоламины 138
5.3.6.2. Гистамин и серотонин 141
5.3.6.3. Нейромедиаторные аминокислоты 143
5.3.6.4. 11-Оксикортикостероиды 144
Заключение 145
Выводы 147
Литература
- Краткая характеристика и применение брусники
- Ботанико-фармакогностическое описание, применение в медицине и пищевой промышленности черники
- Обнаружение некоторых групп природных соединений
- Сравнительный анализ исследуемых растений с другими видами семейства вересковые
Введение к работе
Актуальность темы. Брусника обыкновенная (Vaccinium vitis-idaea L.), клюква болотная (Охуcoccus palustris Pers.) и черника обыкновенная (Vaccinium myrtillus L.) относятся к широко и традиционно используемым растениям, являющимся объектами многочисленных исследований. Вместе с тем недостаточно данных как об элементном составе этих растений, произрастающих в различных регионах России, так и о влиянии антропологических и экологических факторов на содержание различных природных соединений. Кроме того, важным аспектом является углубленное исследование этих растений для расширения возможностей их применения в медицине .
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось сравнительное фармакохимическое исследование сырья брусники, клюквы и черники из разных мест произрастания и разработка на его основе новых лекарственных средств.
Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи:
- обобщить данные литературы по современному состоянию химических, фармакологических и технологических исследований листьев и плодов брусники, клюквы и черники;
- провести сравнительный качественный анализ элементного состава, фенольных соединений и иридоидов, а так же количественное определение макро- и микроэлементов, арбутина, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, антоцианов и полифенольных окисляемых веществ в листьях (побегах) и плодах исследуемых растений из разных мест произрастания, провести их экологическую оценку;
- предпринять фармако-биохимическое изучение густых экстрактов плодов брусники, клюквы и черники на токсичность, наличие адаптогенных свойств, седативную, противоболевую и противовоспалительную активность. Выявить влияние препаратов на содержание в органах и тканях животных катехоламинов, 11-оксикортикостероидов, биогенных аминов и нейромедиа-торных аминокислот; провести фармакологическое исследование смеси экстрактов валерианы и черники, определить ее влияние на биохимические показатели животных (для разработки экспериментального препарата).
Научная новизна. Впервые предпринято целенаправленное фармако-химическое исследование брусники, клюквы и черники, произрастающих преимущественно в центральных и северных регионах европейской части Российской Федерации. При помощи рентгенофлуоресцентного анализа определено содержание 5 макро- (К, Са, S, Р, С1) и 25 микроэлементов (Ва, Вг, V, Fe, I, Cd,Co, La, Mn, Cu, Mo, As, Nb, Nd, Ni, Sn, Rb, Pb, Se, Sr, Sb, Ті, Cr, Zn, Zr) в 71 образце растительного сырья и почв с мест произрастания. Проанализирован состав фенологликозидов, флавоноидов, антоцианов, гидроксикоричных кислот и иридоидов. Спектрофотометрические методики количественного определения арбутина, флавоноидов и гидроксикоричных кислот адаптированы к объектам исследований. Проведено количественное определение арбутина, флавоноидов, антоцианов, гидроксикоричных кислот и полифенольных окисляемых веществ, при этом отмечен ряд закономерностей.
Впервые предпринято сравнительное фармакологическое и биохимическое исследование густых экстрактов плодов брусники, клюквы, черники, среди которых наиболее выраженную и сбалансированную активность проявил экстракт черники, и смеси экстрактов черники и валерианы. Смесь экстрактов валерианы и черники проявляла седативную и анксиолитическую активность (без угнетающего действия на двигательные функции), нормализовала гормонально-медиаторный баланс при стрессе и обладала умеренной адаптогенной активностью.
По результатам работы оформлена заявка на патент РФ на изобретение.
Практическая значимость. Впервые для практической медицины предложена комбинация экстрактов валерианы и черники в качестве седативного, анксиолитического и актопротекторного препарата. Проведена экологическая оценка состояния фитосырья из различных регионов РФ, а так же сравнительных анализ содержания отдельных групп фенольных соединений в изучаемых растениях.
На основании проведенных исследований апробированы и внедрены:
- методики количественного определения арбутина, гидроксикорич-ных кислот, флавоноидов в лекарственном растительном сырье (Акты апробации от 01.10.04 г. ГУЗ «Вологодский областной центр контроля качества и сертификации лекарственных средств», акт внедрения в учебный процесс кафедры фармакогнозии Ярославской государственной медицинской академии);
- проект изменения №1 к ГФ XI, вып. 2, ст. 27 "Листья брусники";
- инструкция по заготовке плодов черники обыкновенной;
- проекты фармакопейных статей предприятия (ГП ВО "Вологодская фармацевтическая фабрика") черники плоды, черники листья, экстракт плодов черники жидкий, «Валеромил настойка»;
- опытно-промышленный регламент на производство препарата «Валеромил настойка» ПР-022782900-8-2004.
На основе разработанных нами опытно-промышленных регламентов на производство «Валеромила» ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика» произвела 6 экспериментальных серий «Валеромила» (по 2 серии настойки, экстракта жидкого и сиропа). Предварительная апробация сиропа «Валеромил» на кафедре терапии ЯГМА под руководством профессора А.А. Зотова дала положительные результаты. Между ЯГМА и ГП ВО «Вологодская фармацевтическая фабрика» составлен договор о выпуске «Валеромила» в форме настойки и сиропа в объеме 60000 упаковок в год в течение 3-х лет после государственной регистрации.
На защиту выносятся:
1. Данные сравнительного фармакохимического исследования брусники, клюквы и черники, произрастающих в центральных и северных регионах европейской части страны.
2. Особенности влияния антропогенных и природных факторов на накопление элементов.
3. Результаты определения элементного состава и фенольных соединений исследуемых образцов фитосырья.
4. Итоги разработки нового комбинированного препарата.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на: IV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997), межвузовской научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 40-му выпуску провизоров заочного отделения Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2000), межвузовской научно-практической конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001), 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2002), третьем конгрессе молодых ученых и студентов: «Науки о человеке» (Томск, 2002), научно-практической конференции «Фитотерапия сердечнососудистых заболеваний» (Москва, 2002), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул, 2004), научных конференциях студентов и молодых ученых Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 1993-2005 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ в Ярославской государственной медицинской академии. Номер государственной регистрации 01.20.0012868. Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ Объем и структура диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 63 таблицы, 27 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, 4 экспериментальных глав, выводов, списка литературы, включающего 266 наименований, из них 39 на иностранных языках.
В первой главе (обзор литературы) приведены краткие данные по ботаническим аспектам, химическому составу и применению брусники, клюквы и черники. В экспериментальной части изложены характеристика объектов и методов исследования (глава II), идентификация и содержание химических элементов и отдельных групп природных соединений (глава III и IV соответственно), сравнительное токсикологическое, фармакологическое и биохимическое изучение экстрактов плодов брусники, клюквы, черники, смеси экстрактов черники и валерианы..
Краткая характеристика и применение брусники
Брусника обыкновенная (Vaccinium vitis-idaea L.) — вечнозеленый кустарничек из подсемейства брусничные (Vaccinioideae) секции Vitis-idaea Dyby рода Vaccinium L. с ползучими укореняющимися и приподнимающимися побегами. Листья многолетние, кожистые, эллиптические или обратно-яйцевидные, тупые или выемчатые, слегка зазубренные или цельнокрайние, край листа завернут книзу, сверху темно-зеленые, блестящие, снизу бледно-матовые с темно-бурыми рассеянными железками. Листорасположение очередное. Цветки белые или розовые в коротких густых кистях. Плод - шаровидная или приплюснутая четырехгнездная ягода, изменяющая цвет в процессе созревания от зеленого до бордово-красного. В одной ягоде содержится от 5 до 31 красновато-бурых семян, слегка полулунной формы [35,200].
В пределах вида хорошо различаются следующие экологические расы: Vaccinium vitis-idaea var. geniunum Herd., распространенная в лесной зоне, Vaccinium vitis-idaea var. pumilus Hornem. (var. microphyllum Herd.), встречаемая в арктической зоне в лишайниковой, каменистой и пятнистой тундрах, и ssp. minor (Lodd.) Hulten. - в Северной Америке [35].
Брусника имеет обширный голарктический ареал с преимущественным распространением в северной части Евразии. Брусника распространена в России в тундре и лесотундре, по всей лесной зоне страны, поднимается в горы до высоты 3000 м над уровнем моря. Наиболее обильно она растет в светло-хвойных лесах и характерна, главным образом, для сосновых и сосно-во-еловых лесов [9,89].
Плоды брусники заготавливают в стадию полной зрелости в сухую погоду [89]. Требования, предъявляемые к свежим плодам брусники, сформулированы в ГОСТ 20450-75 [58].
Сбор листьев производят весной и осенью: весной - до цветения, в апреле - начале мая, и осенью при полном созревании ягод - в конце сентября — в октябре. Повторные заготовки на одном и том же участке возможны через 5-10 лет, после полного восстановления зарослей брусники [153].
В лекарственном сырье, заготовленном в летний период, велика примесь почерневших и побуревших листьев, снижающая его товарную ценность. В литературе это объясняется гидролизом арбутина и накоплением гидрохинона, который, окисляясь до хинона и взаимодействуя с последним, образует вещества с темной окраской [183]. Нам такое объяснение представляется сомнительным, в крайнем случае — неполным, ввиду химической стабильности арбутина. Возможно почернение листьев - результат ферментативного гидролиза иридоидов с образованием окрашенных агликонов [38,205].
Нормирующие показатели приведены в ГФ XI [61]. Количественная оценка качества сырья проводится по содержанию арбутина (должно быть не менее 4,5%).
Работы по введению в культуру брусники проводятся с 60-х годов XX века в Финляндии, Швеции, Дании и других странах Западной Европы. Закладка плантаций проводится либо черенками, либо корневищами. В странах СНГ опытные плантации брусники заложены в Белоруссии и России - на Костромской лесоопытной станции [35,133].
Плоды брусники содержат: 1. Гидроксикоричные кислоты - І-О-транс-цинамоил-І-Р-О-глюкопи-раноза [254]. 2. Фенолгликозиды и их производные - арбутин (0,29-0,38%), гидрохинон [226]; 3. Антоцианы (от 1,0% до 2,2%) - 3,5-дигликозид мальвидина, 3-ксилогликозид цианидина [159] 4. Дубильные вещества (до 0,4%) [29]; 5. Водорастворимые полисахариды (около 2,4%), состоящие из галактозы, глюкозы, арабинозы, ксилозы, рамнозы и галактуроновой кислоты (Е.Г. Мартынов и Е.А. Строев), фруктозу (2,8-5,1%), глюкозу (2,4-5,8%), сахарозу (0,53%) [116]. 6. Растворимые пектины (0,13-0,44%), протопектины (0,16-0,52%). 7. Органические кислоты, свыше 2,5% - лимонная, яблочная, бензойная, хинная, винная, салициловая, щавелевая, молочная, а-кетоглутаровая, у-окси-а-кетомасляная, 3-окси-а-кетомасляная, глиоксиловая [8,159,226]. 8. Витамины - аскорбиновая кислота (до 30 мг%) [226], витамин Е (1 мг%), каротиноиды (до 0,1 мг%),, витамины группы В (0,03 мг%), в том числе тиамин (0,01 мг%), рибофлавин (0,02 мг%) [32,35,89,159,226]. 9. Элементы - Na (от 7,0 до 33,0 мг%), К (от 54,0 до 73,0 мг%), Са (от 40,0 до 184,0 мг%), Mg (от 7,0 до 380,0 мг%), Р (от 16,0 до 20,0 мг%), Fe (от 0,4 до 42,0 мг%), Мп (от 6,0 до 82,0 мг%), Ag (0,0016 мг%), Ва (0,1505 мг%), Сг (0,0025 мг%), Си (от 2,40 до 3,22 мг%), Мо (0,002 мг%), Ni (0,0065 мг%), Sr (0,1118 мг%), Ті (0,0245 мг%), W (0,0053 мг%), Zn (0,0159 мг%), В (от 0,12 до 0,45 мг%), Pb (от 0,0055 до 0,0158 мг%), Sn (от 0,0025 до 0,0067 мг%).
Ботанико-фармакогностическое описание, применение в медицине и пищевой промышленности черники
Плоды черники содержат следующие соединения: 1. Флавоноиды (гиперозид, астрагалин, кверцитрин, изокверцитрин, авикулярин, рутин). 2. Гидроксикоричные кислоты (кофейная, хлорогеновая). 3. Фенолгликозиды и их производные (арбутин, метиларбутин, гидрохинон). 4. Иридоиды (асперулозид, монотропеозид). 5. Антоцианы (460-985 мг/100 г) представляют собой глюкозиды, га-лактозиды и арабинозиды дельфинидина, петунидина, цианидина, мальвиди-на и пеонидина [7,159] более 15 веществ [234], в том числе 3-глкжозид, 5-глюкозид и 3-рамнозилглюкозид дельфинидина, галактозид цианидина (ида ин), мальвидин-З-О-ос-Ь-арабинопиранозид, пеонидин-З-О-а-Ь-арабинопира-нозид, пеонидин-З-О-р-О-галактопиранозид, петунидин-З-О-а-Ь-арабино-пиранозид. 6. Дубильные вещества (до 12%) с преобладанием пирокатехиновой группы [159]. 7. Сахара (5,3-7,4%), в том числе глюкоза (1,5-4,2%), фруктоза (3,1-5,0%), сахароза (0,1-0,5%), комплекс водорастворимых полисахаридов (2,5%) (в составе комплекса идентифицированы галактоза, глюкоза, арабиноза, ксилоза, рамноза и галактуроновая кислота) [116]. 8. Органические кислоты (до 7%), в ряду которых яблочная, янтарная, хинная, бензойная, молочная и щавелевая; 9. Витамины: аскорбиновая кислота (до 60 мг%), каротин (0,75-1,6 мг%), витамины группы В (до 0,04%), в частности тиамин (0,045 мг/100 г) и рибофлавин (0,08 мг/100 г), никотиновой кислоты (2,1 мг/100 г). [159]. 10. Элементы: Na (6 мг%), К (51 мг%), Са (16 мг%), Mg (6мг%), Р (13 мг%), Fe (7 мг%) [69,115], отмечены следы радия; содержание марганца в зависимости от мест сбора находилось в пределах 0,044-0,071% [131] 11. Прочие соединения: лейкоантоцианы, катехины (галлокатехин, эпи-катехин, эпигаллокатехин, эпигаллокатехингаллат), урсоловая кислота, пектины (0,14-0,69%). Запах плодов черники обусловлен наличием транс-2-гексеналя, этил-3-метилбутирата и этил-2-метилбутирата [256].
В семенах черники установлено наличие до 31% высыхающего жирного масла, содержащего линолевую, пальмитиновую и стеариновую кислоты; до 18% протеина [159]. Химический состав листьев
В листьях черники содержатся: 1. Флавоноиды (от 2,20% до 2,98%), в том числе рутин, кверцитрин, изо-кверцитрин, кемпферол, астрагалин, гиперозид, авикулярин, мератин [17,159,206]. 2. Гидроксикоричные кислоты (3,66% хлорогеновой кислоты). 3. Фенолгликозиды и их производные, в частности арбутин (0,47-1,00%), метиларбутин, гидрохинон (0,47%). 4. Антоцианы (до 12 соединений [259] производных цианидина, дельфи-нидина и петунидина [159]). 5. Иридоиды (монотропеозид и асперулозид) [159]. 6. Дубильные вещества (18-20%). 7. Сахаристые вещества. 8. Органические кислоты (галловая, бензойная, лимонная, яблочная, щавелевая, винная, салициловая, гентизиновая, хинная) [159] 9. Витамин С (до 250 мг%). 10. Элементы: К, Na, Mg, Са, Fe, S, Р, СІ, І (1,9-2,4 мг/кг), Мп (0,144-0,375%), А1 (до 0,088%), Си (до 0,00092%) [131]. 11. Прочие соединения: сапонины (2,2-2,8%), алкалоид миртин, тритерпе-ноиды (Р-амирин, олеаноловая и урсоловая кислоты), (±)-эпикатехин, (+)-галлокатехин и (-)-эпигаллокатехин [89].
В листьях черники обнаружены следы эфирного масла и хинолизиди-новых алкалоидов [159]. При применении плодов черники используются терапевтические эффекты, характерные для следующих фармакологических групп: - противовоспалительные, - противодиарейные, - нормализующее обменные процессы, - регенеративные, - поливитаминные, общеукрепляющие средства. Плоды черники применяют для лечения гингивитов, ангин, фарингитов и прочих воспалительных процессов в полости рта и на слизистых оболочках, в комплексной терапии ревматизма [176,104,222].
Обнаружение некоторых групп природных соединений
Изучение элементного состава растений представляло для нас интерес по следующим соображениям.
Во-первых, токсичные элементы, в настоящее время являются одними из основных загрязнителей окружающей среды. В связи с чем, определение элементного состава анализируемого сырья позволит получить представление об его безопасности и предоставит определенный срез экологического состояния регионов заготовки.
Во-вторых, в организме человека относительно постоянно содержание примерно 70 элементов. Доказана биогенность более 30 из них. Они являются незаменимыми нутриентами, не синтезируемыми в организме, значение которых сравнимо со значением витаминов. В случае содержания в сырье, использованном для получения одной дозы препарата, биогенных элементов в количествах, сопоставимых с суточной потребностью организма человека, следует учитывать их биологическую активность [127,137].
Для определения содержания элементов мы использовали рентгенофлуо-ресцентный метод. Его физической основой является связь длины волны испускаемого характеристического излучения (энергии) при переходе электронов на энергетических уровнях атома под воздействием частиц с высокой энергией с порядковым номером элемента (закон Мозли).
Аппаратную реализацию метода осуществляли следующим образом. Анализируемый образец помещали в активационную установку (блок детектирования рентгеновского излучения полупроводниковый БДРК - 25 и дозиметр рентгеновского излучения ДРГЗ - 01), где проводили облучение рентгеновским излучением (источники излучения - тип ИРИК-АТ (ТУ 95.858-81) на основе радионуклида кадмия-109 с активностью 1-3 х 10 и тип ИГИА-1-2 на основе радионуклида америция-241 с активностью 4,3 х 10 Бк). При определении кон центраций легких элементов (от Si до Мп) использовали закрытые источники на основе радионуклеидов железа-55 (с энергией фотонов 5,9 кэВ), при определении концентрации элементов от К до Мо - кадмия-109 (с энергией фотонов 5,9 кэВ) и при определении концентраций элементов от Мо до U — америций-241 (с энергией 22,5 кэВ). Из активационной установки вторичное излучение поступало на амплитудный анализ в полупроводниковый детектор на основе кремний-литиевых и германиевых кристаллов. Детектор охлаждали жидким азотом при температуре, равной 195С, осуществляя преобразования поглощенной энергии рентгеновских квантов в электрические импульсы, амплитуда которых пропорциональна энергии квантов (использовали усилитель импульсов спектрометрический УИ-35-01, вводное устройство спектрическое ВУС-2, многоканальный анализатор амплитуд АИ-1024). Полученные аппаратурные спектры выводились на самопишущий потенциометр К-201.
Предварительную обработку проб и изготовление препаратов для измерения проводили следующим образом:
Около 50,0 г сырья исследуемого растения высушивали в сушильном шкафу при температуре 105С до постоянной массы [182]. После остывания 2,0г. подготовленного сырья высыпали в чистую фарфоровую чашку, добавляли 0,25 мл 50%-ного спиртового раствора клея БФ-6 и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Полученную массу закладывали в пресс-форму, уста-навливаемую в гидравлический пресс под давлением 200-250 кг/см , прессовали таблетку, которую подсушивали в сушильном шкафу и запаивали в маркированный полиэтиленовый пакет.
Для определения концентрации тугоплавких элементов (кобальта, молибдена и др.) образцы сырья озоляли в муфельной печи при температуре 420-440С в течении 4-х часов.
Качественное обнаружение и количественное определение концентраций элементов связано с пропорциональной связью между их концентрацией и интенсивностью характеристического рентгеновского излучения.
Токсикологическое и фармакологическое изучение черники, брусники и клюквы Для исследования токсикологических и фармакологических свойств нами приготовлены густые экстракты плодов черники, брусники и клюквы. В качестве экстрагента использовали 70% спирт этиловый. Экстракты жидкие получали методом мацерации в течение 7 суток (измельченного высушенного сырья - 500 г, спирта 70% (ФС 42-3071-00) до получения 1 л экстракта). Упаривание экстрактов жидких до экстрактов густых, в целях максимального сохранения действующих веществ, проводили при температуре 40С в вакууме.
При исследовании фармакологических свойств, проведенных на кафедре фармакологии Ярославской государственной медицинской академии (зав. кафедрой профессор В.В. Попков), использовали беспородных взрослых животных: 349 белых крыс и 125 белых мышей обоего пола. Колебания массы животных одной группы крыс были в пределах 10-20 г, мышей 1-2 г. С лабораторными животными работали в соответствии с действующими «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [122]. Все животные находились в одинаковых условиях обитания и кормления (стандартный брикетированный корм).
Большой спектр терапевтического действия исследуемых растений позволяет предположить наличие адаптогенной активности. Для исследования адаптогенных свойств растений использовался трехэтапный скрининг [196]. На первом этапе препарат испытывался на моделях гипоксии и мышечных нагрузок. При этом происходил отсев экспериментальных препаратов, полученных из исследуемых растений, с низкой или сомнительной адаптогенной активностью. Если у исследуемого экстракта в обоих испытаниях обнаруживался высокий защитный индекс (КПА 0,2), то он переходил на второй этап, на котором моделировался иммобилизационный стресс, т.к. обязательным свойством адап-тогена является стресспротективная активность
Сравнительный анализ исследуемых растений с другими видами семейства вересковые
Обобщая результаты изучения элементного состава растений, необходимо выделить следующее:
1. Методом рентгенофлуоресцентного анализа брусники, голубики, толокнянки, черники и клюквы нами определено 5 макро- (калий, кальций, сера, фосфор, хлор) и 25 микроэлементов (барий, бром, ванадий, железо, йод, кадмий, кобальт, лантан, марганец, медь, молибден, мышьяк, неодим, никель, олово, рубидий, свинец, селен, стронций, сурьма, титан, хром, церий, цинк, цирконий), имеющих определенное значение в хемосистематическом, экологическом, токсикологическом и медицинском аспектах.
2. Установлено, что преобладающим фактором, определяющим элементный состав изученных образцов, являются механизмы гомеостаза, затем следует элементная загрязненность почв и пылевые выпадения из атмосферы.
3. Обнаружено, что во временном промежутке в пять лет в исследуемых растениях повысилось содержание токсичных элементов, в первую очередь кадмия и свинца.
4. Закономерностей изменения элементного состава изучаемых растений в зависимости от региона произрастания не выявлено.
5. Отмечена прямая зависимость концентрации токсичных элементов от близости места произрастания к промышленным предприятиям и федеральным дорогам в пределах одного региона.
6. Определено, что содержание токсичных элементов в плодах изучаемых растений близко к предельно допустимым концентрациям СанПиН 42-123-4089-86 "Предельно - допустимые концентрации, тяжелых металлов и мышь -88-яка в продовольственном сырье и пищевых продуктах" и СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов". В побегах, стеблях и листьях брусники, клюквы и черники содержание токсичных элементов несколько завышено и превышало ПДК.
7. Установлено, что использование в качестве экологически благоприятной замены изучаемых растений листьев толокнянки или голубики не представляется возможным ввиду их несоответствия по тем же показателям
8. В связи с реальной тенденцией к ухудшению экологической обстановки целесообразно уже в настоящее время подготовить переход от употребления плодов к использованию продуктов их переработки, не содержащих токсиканты в значимых количествах.
9. Ввиду превышения содержания в листьях изучаемых растений мышьяка для БАД на растительной основе (СанПиН 2.3.2.1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2.1280-03), при проведении фармакологических исследований экспериментальные препараты на их основе не изучались.
10. Подземные органы растений исключены из последующих исследований по причине высокого содержания токсикантов (относительно надземных органов), очевидно, медленной возобновляемости (по сравнению с плодами и листьями), а так же с учетом того что они не находят применения в медицине.
В заключении необходимо обозначить аспект статистической достоверности полученных данных.
В приведенных выше результатах рентгенофлуоресцентного анализа не указаны доверительные интервалы и относительные погрешности для полученных величин. Их отсутствие означает, что показатели, приведенные в таблицах, являются в основном результатами одного определения. Отказ от статистического установления истинных значений измеряемых величин путем проведения рекомендуемых десяти определений, с последующей обработкой результатов, объясняется и частично компенсируется следующим: 1. Высокой себестоимостью проведения рентгенофлуоресцентного анализа.
2. Большим количеством анализируемых образцов, что с одной стороны, не позволяет провести исследование каждого образца в рекомендуемом объеме, а с другой, позволяет выявлять промахи (грубые ошибки в значениях измеряемой величины) при сравнении с результатами других определений. При подозрении на промах анализ проводился повторно.
3. Проведением анализа при строгом соблюдении одних и тех же условий (температура, влажность, напряжение электрической сети и др.).
4. Чрезвычайно низкой приборной погрешностью. Пределы обнаружения при проведении рентгенофлуоресцентного анализа составляют 10 14 - 10 "15 г [182], а содержание элементов в исследуемых образцах находилось в пределах 10 " - 10 " г. Самым низким было содержание олова в плодах клюквы 2x10 " г, что позволяет пренебречь приборной погрешностью.
5. Возможностью игнорировать систематическую погрешность при сравнительном анализе результатов, полученных одним методом и на одном приборе.
6. Большим фактическим материалом, накопленным на кафедре фармакогнозии ЯГМА [69, 87, 88, 92, 109, 112-115, 138, 158, 162, 180,207], показывающим, что доверительная вероятность истинности измеряемой величины при проведении рентгенофлуоресцентного анализа растительных образцов, составляет 0,95 для порядка двадцати элементов и 0,99 для остальных.
Следовательно для корректной интерпретации полученных данных правильнее применить выражение: «проведена оценка измеряемых величин», что вполне достаточно для достижения целей предпринятого нами исследования.
В настоящее время мы переходим от обзорной работы с применением рентгенофлуоресцентного анализа (как экспрессного и информативного), к углубленным исследованиям, с применением атомноабсорбционного анализа. Последний более трудозатратен, но точен, воспроизводим, и исключает потери летучих элементов при пробоподготовке. Количество образцов и определяемых элементов сокращено, но по каждому производится статистическая обработка полученных данных. Мы не приводим результатов вышеуказанных исследований, так как они выходят за рамки диссертационной работы.
![Синтез, свойства и биологическая активность производных галоген(Н)антраниловых кислот, 3,1-бензоксазин-4(3Н)-онов, хиназолинонов и изучение взаимосвязи структура - активность [Электронный ресурс]](/i/i/4391/182559.png "Синтез, свойства и биологическая активность производных галоген(Н)антраниловых кислот, 3,1-бензоксазин-4(3Н)-онов, хиназолинонов и изучение взаимосвязи структура - активность [Электронный ресурс] Курбатов Евгений Раисович")
