Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Сведения о растениях рода зопник и их химическом составе и применении в медицине 12
1.1 Ботаническая характеристика и географическое распространение 12
1.2 Химический состав некоторых представителей рода зопник 18
1.3 Применение в научной и народной медицине 22
Выводы по главе 1 24
Экспериментальная часть 25
ГЛАВА II Объекты и методы исследования 26
2.1 Объекты исследования 26
2.2 Методы исследования 28
ГЛАВА III Фитохимическое исследование травы зопника колючего и зопника клубненосного 36
3.1 Качественные показатели на содержание биологически активных веществ 36
3.1.1 Приготовление водных извлечений 36
3.1.2 Приготовление спиртоводных извлечений 36
3.1.3 Качественные реакции 37
3.2. Хроматографическое изучение 38
3.2.1 Хроматографический анализ тритерпеновых соединений 39
3.2.2 Хроматографический'анализ флавоноидов и оксикоричных кислот 40
3.2.3 Хроматографический анализ иридоидов 46
3.2.4 Хроматографический анализ органических кислот 47
3.2.5 Хроматографический анализ сахаридного состава 49
3.2.6 Хроматографический анализ аминокислот 51
3.3 Количественное содержание биологически активных веществ 52
3.3.1 Определение содержания тритерпеноидов 52
3.3.2 Определение содержания флавоноидов 55
3.3.3 Определение содержания фенолокислот 57
3.3.4 Определение содержания полисахаридов 59
3.3.5 Определение содержания иридоидов 60
3.3.6 Определение содержание дубильных веществ 63
3.3.7 Определение содержания органических кислот 64
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ III 66
ГЛАВА IV Химическое исследование зопника колючего и зопника клубненосного на содержание биологически активных веществ 67
4.1 Получение фракций из спиртоводного извлечения травы зопника колючего и зопника клубненосного 67
4.2 Выделение биологически активных веществ зопника колючего и зопника клубненосного 70
4.2.1 Выделение биологически активных веществ из петролейно-эфирной фракции 70
4.2.2 Выделение биологически активных веществ из хлороформной фракции 72
4.2.3 Выделение биологически активных веществ из этил ацетатной фракции 73
4.2.4 Выделение и количественное определение полисахаридных
фракций 75
4.3 Идентификация биологически активных веществ зопника колючего и зопника клубненосного 78
4.3.1 Идентификация фенольных соединений 78
4.3.2 Идентификация полисахаридного комплекса 82
4.3.3 Идентификация аминокислотного состава 88
4.3.4 Идентификация и определение макро- и микроэлементов 89
4.4 Разработка методики определения суммы фенольных соединений 91
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ IV 97
ГЛАВА V Определение запасов и составление нормативной документации 98
5.1 Определение запасов травы зопника колючего и зопника клубненосного.. 98
5.2 Расчет объема ежегодных заготовок 103
5.3 Определение товароведческих показателей 104
5.4 Морфолого - анатомическое исследование признаков зопника колючего и зопника клубненосного 107
5.4.1 Изучение морфолого - анатомических признаков зопника колючего 107
5.4.1.1 Изучение внешних признаков зопника колючего 107
5.4.1.2 Микроскопическое изучение зопника колючего 108
5.4.2 Изучение морфолого - анатомических признаков зопника клубненосного 122
5.4.2.1 Изучение внешних признаков зопника клубненосного... 122
5.4.2.2 Микроскопическое изучение зопника клубненосного 122
5.5 Определение сроков годности травы зопника колючего и зопника
клубненосного 138
5.6 Определение содержания радионуклидов 139
5.7 Определение микробиологической чистоты 140
5.8 Изучение фармакологической активности экстрактов зопника колючего и зопника клубненосного 143
5.8.1 Изучение острой токсичности 143
5.8.2 Изучение желчегонной активности 144
Выводы по главе v 149
Общие выводы 150
Список литературы
- Применение в научной и народной медицине
- Приготовление спиртоводных извлечений
- Выделение биологически активных веществ зопника колючего и зопника клубненосного
- Морфолого - анатомическое исследование признаков зопника колючего и зопника клубненосного
Введение к работе
Актуальность темы.
Несмотря на постоянно растущий ассортимент синтетических лекарственных средств, по-прежнему актуальным является исследование малоизученных отечественных лекарственных растений, разработка и использование лекарственных препаратов на их основе. Такая востребованность связана с рядом положительных свойств фитопрепаратов: низкой токсичностью, широким спектром терапевтического действия и незначительным числом побочных эффектов. Особый интерес представляют растения, хорошо зарекомендовавшие' себя в народной медицине. Часть из них находит широкое применение и в официальной медицине. К таким растениям можно отнести некоторые виды рода зопник: зопник колючий и зопник клубненосный. Эти виды представляют наибольший интерес из всех видов зопников, произрастающих на-Северном Кавказе.
Трава зопника колючего включена в Государственный реестр лекарственных средств, как компонент сбора М. Н. Здренко, используемого при папиломатозе мочевого пузыря, анацидных гастритах [30]. В народной медицине используют траву и настой зопника клубненосного при пневмонии, бронхитах, лихорадках, острых респираторных заболеваниях, туберкулезе легких; местно - при гнойных ранах [12,108].
Однако для широкого использования указанных видов необходимо иметь современную нормативную документацию, позволяющую проводить надежную стандартизацию сырья.
Следует отметить, что для многих видов лекарственного растительного сырья продолжают действовать устаревшие государственные стандарты (ГОСТы) и фармакопейные статьи (ФС) [4,6,19]. Это же относится и к сырью зопника колючего и зопника клубненосного. Ранее действовавшая фармакопейная статья на траву зопника колючего (ФС 42-1565-92) не отвечает новым требованиям, предъявляемым к ФС, поэтому в настоящий
момент утратила свою юридическую силу, а на траву зопника клубненосного фармакопейная статья отсутствует.
Учитывая возрастающий интерес к указанным видам очевидна
необходимость в разработке современной нормативной документации (НД).
Такая разработка требует проведения комплекса фармакогностических
исследований, который включает морфолого-анатомическое,
фотохимическое и ресурсоведческое изучение зопника колючего и зопника клубненосного. Поэтому решение поставленной цели является актуальной для фармацевтической науки и практики.
Цель и задачи исследования.
Цель исследования - фармакогностическое изучение травы зопника колючего и зопника клубненосного, произрастающих на Северном Кавказе и разработка нормативной документации на данное сырье.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Провести качественное и количественное определение биологически активных веществ травы зопника колючего и зопника клубненосного (фенольных соединений, тритерпеноидов, иридоидов и др.);
Изучить компонентный состав групп биологически активных веществ (фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот и др.);
Установить морфолого - анатомические и диагностические признаки сырья зопника колючего и зопника клубненосного.
Определить запасы сырья зопника колючего и зопника клубненосного, произрастающих в разных районах Северного Кавказа.
Провести фармакологический скрининг водных извлечений и сухих экстрактов из травы зопника колючего и зопника клубненосного.
Разработать нормативную документацию на данные виды сырья.
Научная новизна исследования.
Проведено фитохимическое изучение зопника колючего и зопника клубненосного и выявлены основные группы биологически активных веществ (БАВ). Установлены закономерности накопления БАВ по фазам вегетации. Это позволило определить оптимальные сроки заготовки сырья: фаза массового цветения - начало плодоношения. Методом ВЭЖХ изучен состав отдельных групп БАВ. В траве зопника колючего установлено наличие 6 фенольных соединений (хлорогеновая, кофейная, феруловая, коричная кислоты, лютеолин - 7 - гликозид) и впервые идентифицировано.4 фенольных соединения (галловая и цикориевая кислоты, гесперидин, кверцетин); в сырье зопника клубненосного установлено наличие 5! фенольных соединений (хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты, лютеолин - 7 - гликозид) и впервые идентифицировано 5 фенольных соединений (коричная, галловая и цикориевая кислоты, гесперидин, кверцетин).
Изучен' полисахаридный состав травы зопника колючего и зопника клубненосного и установлено, что преобладающей полисахаридной фракцией являются водорастворимые полисахариды (ВРПС). Методом ВЭЖХ установлен сахаридный состав изучаемого сырья, в результате которого в траве зопника колючего установлено наличие 30 моносахаров, 7 из которых идентифицировали: арабинозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, сахарозу; в траве зопника клубненосного определено наличие 16 моносахаров, 5 из которых идентифицировали: арабинозу, глюкозу, ксилозу, лактозу, мальтозу.
В результате изучения анатомического строения установлены основные диагностические признаки сырья зопника колючего и зопника клубненосного.
Для стандартизации сырья предложены критерии оценки качества и идентификации травы обоих видов по содержанию действующих веществ
(суммы полифенольных соединений), общим числовым показателям, анатомическим признакам, микробиологической чистоте.
Определены основные районы распространения зопника колючего и зопника клубненосного в некоторых районах Северного Кавказа и выявлен их сырьевой потенциал.
Проведен фармакологический скрининг водных извлечений и сухих экстрактов из травы зопника колючего и зопника клубненосного и выявлена желчегонная активность.
Установлено родство химического состава и фармакологической, активности травы обоих видов, что позволяет рекомендовать зопник клубненосный как в качестве самостоятельного лекарственного растительного сырья, так и дополнительного сырьевого источника зопника колючего для приготовления сбора М.Н.Здренко.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику.
В результате проведенных исследований двух видов рода зопник расширена сырьевая база лекарственных растений для научной медицины.
Разработаны методики идентификации и количественного определения основных групп биологически активных веществ травы зопника колючего и зопника клубненосного с использованием современных физико-химических методов анализа.
Изучены запасы сырья и определен объем возможных ежегодных заготовок в некоторых регионах Южного Федерального округа (Ставропольском, Краснодарском краях, Ростовской области, Кабардино-Балкарской и Карачаево-Черкесской Республике), позволяющие планомерно заготавливать сырье с учетом охраны природных ресурсов.
Обоснована целесообразность и перспективы применения травы зопника колючего и зопника клубненосного в медицинской практике в
качестве сырья для получения лекарственных препаратов, обладающих желчегонным действием.
На основании проведенных исследований разработаны проекты ФС «Зопника колючего трава» и «Зопника клубненосного трава», которые приняты к рассмотрению в Институте стандартизации лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора (письмо № 2653 от 17.10:2007г.). Приняты к рассмотрению «Инструкция по заготовке и сушке травы зопника колючего» и «Инструкция по заготовке и сушке травы зопника клубненосного» в ГУ ВИЛАР (письмо № 1218 от 25.09.07 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№
госрегистрации 01.200.11264).
Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты химического исследования состава травы зопника колючего и зопника клубненосного с использованием методов ТСХ-анализа, ВЭЖХ, УФ- спектроскопии.
Экспериментальные данные по качественному и количественному определению фенольных соединений в траве зопника колючего и зопника клубненосного.
Характерные морфолого-анатомические и диагностические признаки травы зопника колючего и зопника клубненосного.
Ресурсоведческие исследования по определению запасов зопника колючего и зопника клубненосного, произрастающих на территории Северного Кавказа.
Методика стандартизации травы зопника колючего и зопника клубненосного.
Результаты фармакологического скрининга сухих экстрактов из травы зопника колючего и зопника клубненосного.
Апробация и публикация результатов исследования
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на 62-й и 63-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск 2007; 2008). По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 167 страницах компьютерного набора, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 167 источников, в том числе 23 иностранных авторов, и приложения. Диссертация содержит 50 таблиц и 37 рисунков.
Применение в научной и народной медицине
Растения семейства яснотковых, благодаря наличию в них таких биологически активных веществ, как эфирное масло, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, полисахариды, азотистые соединения, тритерпеноиды и др., успешно применяются для лечения сердечно-сосудистых, нервных, легочных, инфекционных, желудочно-кишечных и других заболеваний [12,74,96,122].
Трава зопника колючего входит в состав сбора М. Н. Здренко, используемого при папиломатозе мочевого пузыря, анацидных гастритах [30, 112].
Зопник колючий широко используется в народной медицине. Проявляет антибактериальную активность [108].
В народной медицине отвар, настой, настойку применяют при бронхитах, туберкулезе легких, пневмонии, острых респираторных инфекциях, хроническом и гипацидном гастритах, язве желудка, анемии, геморрое, астении, малярии, отеках, гипертонической болезни. Настой проявляет тонизирующее, диуретическое, повышает иммунитет и ускоряет свертываемость крови; наружно настой применяют при гнойных ранах [108].
Настой из травы зопника клубненосного используют при диарее, дизентерии, пневмонии, бронхитах, лихорадках, острых респираторных заболеваниях, туберкулезе легких, женских болезнях, геморрое; отвар - при гепатитах; местоно - при гнойных ранах. На Алтае используют при мастите, зобе, белях, головной боли, глухоте; ванны - при отеках ног.
Суммарный препарат из травы зопника клубненосного был рекомендован к клиническим испытаниям при состояниях повышенной возбудимости центральной нервной системы: неврозы, эпилепсия, невротическая бессонница; седативное средство при гипертонической болезни. Экстракт проявляет антибактериальную и антифунгальную активность; эфирный экстракт in vitro - противоопухолевую активность.
Корни (клубневидные утолщения) зопника клубненосного в тибетской и монгольской медицине применяют при туберкулезе легких, венерических заболеваниях; кроме того, в тибетской медицине используют при бронхитах, как общеукрепляющее, местно - при болезнях горла, хронических сифилитических язвах, гнойных ранах; в монгольской - как детокенкационное средство, заменитель Smilax china L. В Сибири отвар - при уретрите; в Бурятии - при туберкулезе легких, бронхитах, тяжелых костных заболеваниях, местно - при нарывах в ушах, отвар - при инфицированных ранах, порошок - ранозаживляющее. В пищу - в печеном, вареном и жареном виде, как добавка в каши. В Монголии отваренные приправа к мясу. В тибетской медицине - при хронической диарее. В народной медицине настой - при гастритах, язве желудка, диарее, асците. Предложен комплексный препарат, содержащий флавоноиды, иридоиды, фенолкарбоновые кислоты, обладающий центральным седативным, диуретическим и кардиотоническими свойствами. Листья зопника клубненосного в Монголии применяют как суррогат чая.
Цветки зопника клубненосного в тибетской медицине являются заменителем корней Bergenia crassifolia (L.) в сборе, применяемом при лечении хронических заболеваний легких. Семена проявляют противотрихомонадную активность [17, 108, 140].
1. Обобщая литературные данные по химическому составу растений рода Phlomis L., можно отметить, что в некоторых видах были обнаружены и исследованы фенольные соединения (флавоноиды, кумарины, фенолокислоты), эфирные масла, тритерпеновые соединения, обладающие разносторонней биологической активностью и низкой токсичностью.
2. Не разработаны методики количественного определения основных действующих веществ, отсутствует нормативная документация, регламентирующая качество травы зопника колючего и зопника клубненосного и определяющая методы стандартизации сырья. Поэтому представляется целесообразным изучить химический состав травы зопника колючего и зопника клубненосного.
3. Зопник колючий и зопник клубненосный распространены повсеместно на территории России, в том числе и на Северном Кавказе, образуя обширные заросли. Однако в литературе отсутствуют данные о запасах и возможных объемах ежегодных заготовок.
Таким образом, можно сделать заключение о том, что фармакогностическое исследование травы зопника колючего и зопника клубненосного, выяснение возможности комплексного использования сырья представляет несомненный интерес.
Приготовление спиртоводных извлечений
Анализ литературных данных показал недостаточность изученности химического состава травы зопника колючего и зопника клубненосного, так же отсутствие стандартизации сырья по содержанию биологически активных веществ. В связи с этим представляло интерес изучить химический состав травы зопника колючего и зопника клубненосного с целью выявления основных групп биологически активных веществ.
Для предварительной идентификации биологически активных веществ сырья были проведены качественные реакции с водными и спиртовыми извлечениями из травы зопника колючего и зопника клубненосного. 5,0 г измельченного сырья заливали 50 мл дистиллированной воды и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечения фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды и операцию повторяли. Водные извлечения, полученные после трехкратной экстракции объединяли, упаривали до 25 мл и использовали для определения углеводных производных, дубильных веществ, тритерпеновых соединений, органических кислот, аминокислот. 5,0 измельченных до 1-2 мм сухой травы исследуемых растений экстрагировали спиртом этиловым 70% в количестве 30 мл, нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Извлечения фильтровали, сырье заливали снова 30 мл воды и операцию повторяли. Водные извлечения, полученные после трехкратной экстракции, объединяли, упаривали до 50 мл.
Качественные реакции проводились, используя общепринятые фармакопейные методики: к 1 мл спирто-водному извлечению добавляли Змл 95% этанола и 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% этаноле. Наблюдали окрашивание раствора в зеленовато — желтый цвет (флавоноиды); к 2 мл водного извлечения прибавляли 6 мл 95% этанола, перемешивали, появлялся белый студенистый осадок, при встряхивании образующий хлопья (полисахариды); к 2 мл водного извлечения прибавляли 2 мл реактива Фелинга, перемешивали и нагревали на водяной бане в течение 3-5 минут, через некоторое время образовывался красно-оранжевый осадок (полисахариды); 2 мл водного извлечения добавляли 4-5 капель раствора железоаммониевых квасцов, появляется черно-зеленое окрашивание (дубильные вещества); в одну пустую пробирку приливали 5 мл 0,1н кислоты хлористоводородной, в другую - 5 мл 0,1 н натрия гидроксида. Затем в обе пробирки добавляли по 1 мл водного извлечения. Пробирки интенсивно встряхивали. В обеих пробирках образовалась пена, равная по объему и стойкости, и не исчезающая в течение 30 — 40 минут (тритерпеновые соединения); к 1 мл водного извлечения добавляли 5 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты и нагревали на водяной бане при температуре 70С в течение 5 минут. Полученный гидролизат по каплям наносили на фильтровальную бумагу и опрыскивали 0,1% раствором нингидрина в 95% этаноле. Бумагу нагревали в сушильном шкафу при температуре 100 - 105 С в течение 2 — 3 минут и наблюдали появление красно— фиолетовых пятен (аминокислоты); к 2 мл спирто-водного извлечения прибавляли 3 мл реактива Трим-Хилла (состоящего из 5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, 10 мл 0,2% раствора меди сульфата и 100 мл кислоты ледяной уксусной). Полученный раствор нагревали до кипения, через 1-2 мин появляется интенсивное голубое окрашивание (иридоиды).
Учитывая; что хроматографический анализ может дать представление о наличии конкретных соединений в исследуемом сырье, для, более детального анализа был использован-хроматографический анализ.
Для хроматографического изучения- биологически активных , соединений-травы- зопника. колючего и зопника клубненосного предварительно проводили фракционирование спиртоводного извлечения из изучаемых объектов.
Для.этого по 5,0 г высушенного сырья, проходящего сквозь сито с диаметрами, отверстий 1-2 мм- экстрагировали 70% спиртом этиловым на водяной бане с обратным холодильником до полного истощения- сырья (контроль проводили методом ТСХ). Объединенные- извлечения упаривали под вакуумом до водного остатка, охлаждали, фильтровали (отделяли хлорофилл) и фильтрат использовали для жидкостной экстракции органическими растворителями» с учетом увеличения полярности растворителя: хлороформ — этилацетат —» бутанол.
Водный раствор спиртоводных извлечений переносили в делительную воронку и взбалтывали с равным объемом органического растворителя. Водный раствор обрабатывали более полярным органическим растворителем. После разделения слоев органический растворитель отделяли. Указанную процедуру повторяли 6-7 раз. Органические извлечения, объединяли. Таким, образом, были получены хлороформная, этилацетатная, бутанольная и водная фракции.
Выделение биологически активных веществ зопника колючего и зопника клубненосного
150,0 і г высушенной и измельчённой до размера частиц 2-5 мм травы, \ помещали в круглодонную колбу вместимостью 4л и заливали сырьё 96% спиртом, этиловым (при соотношении сырьё - экстрагент 1:10). Экстракцию проводили на сухожаровой бане LTHS 4000 в течение 1 часа. Экстракт охлаждали при комнатной температуре и фильтровали через вату в коническую колбу вместимостью 4л. Затем в колбу для экстрагирования прибавляли 1500 мл 70% спирта этилового. \ Экстракцию проводили дважды в прежних условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. Объединенные извлечения упаривали на роторном испарителе ИР 1М (ЭРА-М) с помощью вакуума до водного остатка в объёме 200 мл. \ Остаток спиртоводного извлечения (200 мл) исследуемого объекта количественно переносили в делительную воронку вместимостью 500- мл и многократно обрабатывали петролейным эфиром (порциями по 100 мл), пока \ петролейноэфирные извлечения не становились бесцветными (7-8 раз). ) Объединённые полученные извлечения фильтровали и экстрагент отгоняли под вакуумом на роторном испарителе до образования смолообразного остатка на дне \ І круглодонной-колбы. Масса1 петролейно-эфирной фракции составила- 1,72 г для.-зопника колючего и 1,69 г длязопника клубненосного:
Затем остаток спиртоводного извлечения в делительной воронке многократно? обрабатывали хлороформом (порциями по 80; мл) до получения бесцветной хлороформной? фракции (5-6 раз). Объединенные хлороформные извлечения фильтроваликв предварительно взвешенную круглодонную колбу вместимостью 500і мл тхлороформ? отгоняли? на? роторном испарителе под. вакуумом; Смолообразный остаток подсушивали, в колбе- с помощью вакуума; ш взвешивали.. Масса хлороформной фракции составила- 0 26 г дляізопникашолючего и- 0,2 Г г для» зопника клубненосного:
Далее остаток спиртоводного извлечения нагревали: иаг водяной бане для-удаления растворителя , переносили: в ранее; используемую делительную воронку и многократно; взбалтывали с этилацетатом;.(7-8 раз. порциями по 70- мл); Остаток этилацетатнош фракции полученный- после отгонки: экстрагента высушивали? в вакуум-сушильном шкафу, охлаждали: до комнатной] температуры? и взвешивали; Масса этилацетатной фракции составила 0;84; г. для зопникаіколючего № 0/75: г для зопника клубненосного;
Затем: остаток спиртоводного извлечения обрабатывали: 5-6- раз .бутанолом порциями по 50 мл. Объединённые, бутанольные извлечения фильтровали; и отгоняли под вакуумом на роторном испарителе, добавляя воду очищенную для понижения температуры; кипения бутанола. Бутанольные. извлечения сушили = в вакуум-сушильном шкафу и; взвешивали; Масса бутанольного извлечения составила 0;51 г для зопника колючего и 0,43 г для зопника клубненосного.
Таким- образом, из травы зопника. колючего и зопника клубненосного были получены фракции спиртоводного извлечения, содержащие биологически активные вещества разной полярности, что облегчало дальнейшее:выделение индивидуальных действующих веществ»(рисунок 10): Воздушно — сухое сырье
Петролейно-эфирные фракции изучаемых объектов представляли собой темно-зеленый смолообразный,остаток массой 1,72 г для-зопника колючего и 1,69т для зопника клубненосного. , Предварительное изучение БАВ«фракции проводили методом, тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол-254» и «Єилуфол-366» в системе растворителя хлороформ-метанол-(8:2). На, хроматограмме обнаружили одну зону адсорбции.1 с Rf =0;92, имеющую зеленую окраску в видемом- свете и оранжевую в УФ-свете при Х=Ъ 66 нм (хлорофилл).
При обработке хроматограмм 10%- фосфорномолибденой или фосфорновольфрамовой.кислотами-с последующим нагреванием-пластины.при 100-105С в сушильном шкафу в течение 3-5 мин. обнаружили-дополнительные зоны адсорбции, имеющие сине-фиолетовую окраску в видимом свете со-значениями-Rf= 0;83; 0,74 и 0,67. Характерная синевато - сиреневая окраска зон- адсорбции позволила нам отнести данные соединения к соединениям тритерпеновою.структуры (рис. 11).
Морфолого - анатомическое исследование признаков зопника колючего и зопника клубненосного
С целью установления подлинности сырья изучено анатомическое строение и определены его диагностические микроскопические признаки.
Исходным материалом исследований служили надземные органы зопника колючего и зопника клубненосного,1 собранные в фазу цветения.
Для приготовления: микропрепарата листа применялся модифицированный метод - кипячение листьев в 0;5% растворе щелочи (по стандартной методике концентрация щелочи составляет 3-5%) с последующим промыванием проточной; водой; Изменение концентрации щёлочи обусловлено сильным разбухание оболочек и: вымыванием содержимого клеток, которое наблюдалось при использовании 3-5% растворов щёлочи.
Для выявления одревесневших элементов стебля проводили окраску микропрепарата концентрированной1 серной кислотой- и флороглюцином. Приготовленные микропрепараты листа и цветка» помещали в воду или желатин глицериновую смесь. Изучение приготовленных микропрёпаратов проводили с: помощью; микроскопов «Биолам-С» (увеличение х20, х40; х90) и «Biolar». Микрофотосъемку проводили на интерференциальном микроскопе «Biolar» с помощью микрофотонасадки МФН-11 (увеличение х70; х-100). Фотографирование проводили на пленку «Кодак-100».
Цельное сырье: Цельные или частично измельченные стебли с листьямщ цветками- и незрелыми плодами. Єтебель четырёхгранный, серовато-войлочно-опушённый, растопыренно-ветвистый. Листья сверху шероховатые,,снизу беловато-пушистые или войлочные. Нижние листья продолговато-ланцетные; пильчатые, длинночерешковые, верхние более узкие, почти цельнокрайние, с короткими черешками. Цветки собраны в пазухах листьев 3-10-цветковыми мутовками, отдалёнными друг от друга и снабжёнными многочисленными шиловидными прицветниками, превышающими- чашечку. Зубцы чашечки с шиловидным остроконечием. Венчик лилово-розовый. Верхняя- губа венчика крупная, дугообразно согнутая, сжатая с боков. Боковые лопасти нижней губьь продолговатые, намного меньше округлой средней лопасти. Тычинок 4. Их нити имеют при основании линейные придатки. Столбик двулопастной, лопасти неравные. Плоды — орешки, на верхушке голые,,от светло-бурого до черного цвета. Запах слабый, своеобразный, вкус водного извлечения!— слегка горьковатый.
Измельченное сырье. Кусочки стеблей, листьев.и цветков, проходящих сквозь сито с диаметром, отверстий 5 мм. Цвет кусочков стеблей и листьев, серовато-зеленый, цветков — лилово-розовый. Запах слабый, своеобразный, вкус водного извлечения - слегка горьковатый.
Микроскопическое изучение зопника колючего
Лист. При» изучении микропрепаратов листа, представляющих фрагменты верхней и нижней эпидермы, нами» установлены следующие особенности. Цитологический-состав верхней эпидермы включает основные клетки, кроющие и железистые трихомы. Цитологический состав нижней эпидермы включает основныеv клетки, побочные клетки, кроющие трихомы И замыкающие клетки устьиц. Для систематики рода Phlomis L. большое значение имеет характер опушения и форма волосков. Потому нами- их диагностике1 было уделено особое внимание. При детальном исследовании эти волоски были дифференцированы на три типа: кроющие простые, кроющие многоклеточные, железистые.
На верхней эпидерме (рис.19) представлены) кроющие простые, многоклеточные и железистые волоски. Кроющие простые являются одноклеточными выростами отдельных основных клеток эпидермы. Многоклеточные волоски представляют собой звездчатую структуру, составленную немногочисленными длинными лучами (в составе до трех апикальных клеток) более-менее одинаковой формы. Структура железистых волосков включает одноклеточную ножку и двуклеточную головку. Верхняя»эпидерма опушена слабо. Кроме того, в ее состав, входят крупные основные клетки с извилистыми антиклинальными стенками. Отсутствие устьичных аппаратов в-верхней эпидерме определяет гипостоматичность листа.
Устьичный энцикл нижней эпидермы (рис:20) диацитного типа: побочные клетки в количестве двух примыкают к замыкающим клеткам устьиц и их, общая-стенка перпендикулярна устьичной щели. Устьица многочисленные. Многоклеточные-кроющие волоски составлены 7-8 длинными апикальными клетками, лучисто-расположенными-с образованием звездчатой формы. Основные побочные клетки в составе - нижней эпидермы, более мелкие, их антиклинальные1 стенки сильно извилистые.
На поперечном сечении лист имеет широко-желобчатую форму. Намиї установлено принадлежность листа к дорзовентральному типу ПО характеру залегания тканей в мезофилле и к гипостоматическому типу по расположению устьиц. Под верхней эпидермой- располагаются клетки палисадной хлоренхимы, а: под нижней клетки рыхлой хлоренхимы. Четкого1 отличия между двумя типами хлоренхимы не существует. Клетки живые- тонкостенные, паренхимные: Клетки палисадной, хлоренхимы имеют более тесное- расположение и более цилиндрическую форму. Клетки рыхлой хлоренхимы более изодиаметричные, более крупные и располагаются друг относительно друга с образованием системы межклетников, которая осуществляет транспирациюі и газообмен. Основная, масса хлоропластов» располагается в палисадной хлоренхиме, где проходит основной-фотосинтез.
