Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Исследования лекарственных растений и биологически актив ных веществ, перспективных для лечения и профилактики сахарного диабета. Обоснование состава сбора противодиабетического (литературный обзор) 10
1.1 Фармакологические исследования растений и биологически активных веществ 10
1.2 Обоснование состава противодиабетического сбора 17
1.3 Заключение к главе 1 23
ГЛАВА II. Материалы и методы исследований 24
2.1 Объекты исследования 24
2.2 Использованное оборудование и методы исследования 25
ГЛАВА III. Фармакогностическое изучение и разработка вопросов стандартизации сбора противодиабетического 28
3.1 Изучение макро- и микродиагностических признаков сбора 29
3.2 Качественный анализ БАВ в сборе : 48
3.3 Изучение элементного состава сбора противодиабетического 52
3.4 Разработка методики количественного определения флавоноидов в сборе противодиабетическом 56
3.4.1 Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе противодиабетическом 66
3.5 Разработка методики количественного определения арбутина в сборе противодиабетическом 69
3.6 Определение количественного содержания БАВ в сборе противодиабетическом 16
ЪЛ Определение числовых показателей и УФ-спектра сбора противодиа бетического 77
3.8 Заключение к главе III 81
ГЛАВА IV . Изучение параметров экстракции сбора противодиабетического 83
4.1 Изучение выхода БАВ в настои в зависимости от размеров частиц сырья компонентов сбора 85
4.2 Влияние способа приготовления водного извлечения сбора на качество получаемых экстрактов 94
4.3 Заключение к главе IV 98
ГЛАВА V. Фармакогностическое изучение побегов голубики 100
5.1 Анализ химического состава побегов голубики 101
5.1.1 Проведение качественного анализа 102
5.1.2 Микроэлементный состав побегов голубики 115
5.2 Количественный анализ БАВ побегов голубики 117
5.2.1 Количественное определение флавоноидов в побегах голубики 117
5.2.2 Количественное определение дубильных веществ 119
5.2.3 Количественное определение органических кислот 120
5.2.4 Количественное определение суммы фенолкарбоновых кислот 122
5.2.5 Количественное определение арбутина 124
5.3 Динамика накопления БАВ 129
5.4 Заключение к главе V 135
ГЛАВА VI. Разработка методики количественного определения флавонои дов в побегах черники и голубики 136
6.1 Количественное определение флавоноидов в побегах черники 136
6.1.1 Оптимизация пробоподготовки с использованием метода мате
матического моделирования эксперимента 138
6.2 Количественное определение флавоноидов в побегах голубики 147
6.3 Заключение к главе VI 148
Общие выводы 150
Список литературы
- Обоснование состава противодиабетического сбора
- Разработка методики количественного определения флавоноидов в сборе противодиабетическом
- Влияние способа приготовления водного извлечения сбора на качество получаемых экстрактов
- Количественный анализ БАВ побегов голубики
Введение к работе
Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения многих стран [219]. Распространенность данного заболевания по России на 2001 год составляла для инсулинозависимо-го (ИЗСД) 224,5 на 100 тыс. и инсулиннезависимого (ИНСД) 1595,4 на 100 тыс. человек соответственно [161]. На сегодняшний день в РФ на официальном учете состоит свыше 3 млн. больных, в Хабаровском крае около 16 000 человек, в городе Хабаровске 9 500 больных сахарным диабетом. Из них больных сахарным диабетом 2 типа в Хабаровском крае 15 855 человек, в городе Хабаровске 8 900 человек [159].
Каждые 10-15 лет число больных СД удваивается. Доля ИНСД среди других форм достигает 85-90% [8, 161, 165, 207, 219, 188]. При СД нарушаются большинство видов метаболизма и в разной степени поражаются многие ткани и органы. Развитие СД приводит к появлению серьезных осложнений, являющихся причиной инвалидности и высокой смертности. К наиболее частым (у 30 - 80 % больных СД) длительно протекающим заболеваниям относят: поражения сердечно-сосудистой системы, поражения нервной системы, диабетические нефропатии, поражения кожи, диабетические ретинопатии, поражения костно-мышечной системы и иммунной системы [19, 56, 67, 80, 98, 107, 116, 160].
В связи с этим актуально применение средств растительного происхождения для профилактики и в качестве источника дополнительной терапии СД. В настоящее время зарубежные и отечественные производители предлагают биологически активные добавки к пище (БАД) в качестве вспомогательных средств терапии СД. Федеральный реестр БАД включает 30 препаратов, снижающих риск нарушений углеводного обмена, из них 19 наименований отечественного производства [166].
Среди лекарственных средств растительного происхождения для лечения СД официально зарегистрированы 3 наименования: листья земляники, створки плодов фасоли, сбор "Арфазетин" (пачки, брикеты, фильтр-пакеты) [40].
Таким образом, номенклатура лекарственных средств растительного происхождения для лечения СД немногочисленна, поэтому расширение ассортимента фитопрепаратов, регулирующих нарушения углеводного обмена и предупреждающих развитие осложнений является актуальным направлением исследований. В этой связи интерес представляют сборы из нескольких лекарственных растений, реализующих основные направления терапии СД.
Учитывая богатство дальневосточной флоры и актуальность разработки противодиабетических средств растительного происхождения, на кафедре фармакогнозии и ботаники д.ф.н., профессором Т.А. Степановой был разработан состав сбора противодиабетического. Оригинальный сбор состоит из побегов черники, листьев крапивы, листьев брусники, побегов леспедецы, плодов шиповника, плодов калины.
Основным компонентом сбора являются побеги черники. Ареал черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) на Дальнем Востоке ограничен по сравнению с европейским [7]. Систематически близким видом черники обыкновенной является голубика (V. uliginosum L.) [152]. Ареал голубики охватывает практически все регионы нашей страны [6]. Согласно литературным сведениям листья голубики находят применение при диабете [128, 186, 212]. Проведенные в Пятигорской фармацевтической академии фармакологические исследования побегов дальневосточных образцов голубики показали, что они обладают ги-погликемическим действием [61]. В связи с этим сырье голубики можно рассматривать как перспективное для изучения с целью введения в официальную практику и как возможную замену побегов черники в сборах. Кроме того, изучение химического состава новых лекарственных растений с целью введения в научную медицину является приоритетным направлением фармацевтической практики [106].
Введение в фармацевтическую практику новых видов лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов требуют тщательного изучения вопросов их стандартизации [136].
Наиболее объективна стандартизация по содержанию биологически активных веществ (БАВ), обеспечивающих фармакологическую активность. Согласно литературным данным сырьевые источники сбора содержат флавоноиды, которые обладают антиоксидантной, антигипоксантной, мембраностабилизи-рующей, противоаллергической, противодиабетической, спазмолитической, ги-похолестеринемической, гипотензивной активностью, а также нормализуют нарушенный обмен веществ. Это обстоятельство делает обоснованным определение содержания флавоноидов в сборе и согласно принципу сквозной стандартизации в основном компоненте препарата - побегах черники.
Таким образом, разработка метода стандартизации сбора противодиабетического и фармакогностическое изучение побегов голубики представляет актуальное направление исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка методик стандартизации сбора противодиабетического и обоснование возможности использования побегов голубики как перспективного сырья ги-погликемического действия.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в сборе;
разработать методики количественного определения флавоноидов и арбутина в сборе;
установить показатели подлинности и доброкачественности сбора;
изучить выход биологически активных веществ из сбора в настои;
провести сравнительное- исследование биологически активных веществ побегов голубики и черники обыкновенной;
изучить динамику накопления биологически активных веществ по фазам вегетации в побегах голубики;
разработать методику количественного определения флавоноидов в побегах черники и голубики.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Дальневосточного государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании научно-плановой комиссии ДВГМУ (Протокол № 1 от 31.01.03 г.)
Научная новизна. Впервые проведено фармакогностическое исследование оригинального сбора противодиабетического, определены макро- и микродиагностические признаки и числовые показатели. С использованием современных методов анализа изучен качественный и количественный состав БАВ сбора противодиабетического. Установлен элементный состав сбора и водного извлечения из него. Разработаны методики количественного определения флавонои-дов и арбутина в сборе.
Изучено влияние размеров частиц сырья и способов настаивания сбора на выход БАВ в настои.
Проведено фармакогностическое изучение побегов голубики, впервые определена вариабельность содержания БАВ в побегах голубики по дальневосточному ареалу и фазам вегетации.
Практическая значимость работы. Разработаны показатели подлинности и доброкачественности сбора противодиабетического, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП).
Выбраны оптимальные способы приготовления водного извлечения из сбора для обоснования Инструкции по применению.
Разработанную методику количественного определения и норматив содержания флавоноидов в побегах черники предлагается включить в соответствующую Фармакопейную статью.
Обоснована перспективность дальнейшего исследования побегов голубики с целью внедрения в фармацевтическую практику.
Материалы диссертации использованы при подготовке Правил пользования лесным фондом на территории Хабаровского края. Проект ФСП на сбор противодиабетический передан ООО «Компания «Хабаровская фармация».
s Данные диссертационной работы используются в учебном процессе. Получены акты внедрения.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на IV международной научной конференции "Азиатско-тихоокеанский регион в глобальной политике, экономике и культуре XXI века" (Хабаровск, 22-23 октября 2002 г.); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию Хабаровского края "Природные ресурсы Хабаровского края: проблемы науки и образования" (Хабаровск, 11-12 ноября 2003 г.); II международной конференции «Лесные биологически активные ресурсы (березовый сок, живица, эфирные мала, пищевые, технические и лекарственные растения)» (Хабаровск, 21 - 23 сентября 2004г.); 61-й 62-й и 63-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004; 2005; 2006 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.
Основные положения, выносимые на защиту: результаты изучения комплекса БАВ сбора противодиабетического и голубики; предложения по стандартизации сбора; обоснование методики количественного определения флавоноидов и норматива их содержания в сборе противодиабетическом и побегах черники; данные по выходу основных групп БАВ в настои из сбора; результаты сравнительного анализа качественного и количественного содержания действующих веществ в сырье черники и голубики; данные по изменчивости количественного содержания основных БАВ в побегах голубики по фазам вегетации.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 177 страницах машинописного текста, иллюстрирована 58 рисунками и 43 таблицами. Результаты экспериментов обработаны статистически.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальной работы, общих выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 220 источников.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.
В главе I (литературный обзор) приводятся сведения по изучению лекарственных растений для лечения и профилактики сахарного диабета и его осложнений, дано обоснование состава сбора с позиции химического состава и фармакологического действия сырьевых компонентов.
Обоснование состава противодиабетического сбора
Как было указано во введении, на кафедре фармакогнозии и ботаники проводится изучение оригинального сбора противодиабетического.
Основой выбора лекарственных растений для лечения сахарного диабета является наличие определенных свойств, к которым относятся гипогликемиче-ское, диуретическое, антигипоксическое, антиоксидантное, антисклеротическое, адаптогенное, ангиопротекторное, иммунотропное [3, 16, 34, 47, 54, 83, 115, 117, 125, 128]. Важную роль в нормализации процессов обмена при сахарном диабете играют витамины и микроэлементы [21, 23, 27, 91, 105, 155]. Среди микроэлементов растений наиболее существенная роль принадлежит хрому (активирует взаимодействие инсулина с рецепторами) и цинку (стимулирует синтез инсулина и нормализует иммунные процессы) [25, 26].
В результате анализа литературных данных по химическому составу1 и фармакологической активности лекарственных растений с учетом их сырьевой базы на Дальнем Востоке была составлена следующая композиция: побеги черники 3 листья крапивы 2 листья брусники 2 побеги леспедецы 2 плоды шиповника 2 плоды калины 1
Побеги черники, доминирующий компонент, содержат богатый феноль-ный комплекс. Фенольные соединения представлены простыми фенолами и их производными (гидрохинон, арбутин, метиларбутин, асперулозид, монотропео-зид), фенолкарбоновыми кислотами и их производными (кофейная, хлорогеновая, хинная), флавоноидами (кемпферол, рутин, астрагалин, гиперин, кверцитрин, изокверцитрин, авикулярин, мератин), дубильными веществами пирокате-хинового ряда, антоцианами (цианидин, дельфинидин, петунидин). Из тритерпенових соединений обнаружены [3-амирин, олеаноловая и урсоловая кислоты. Также присутствуют витамины группы В, аскорбиновая кислота. В побегах черники накапливаются микроэлементы: марганец, барий, селен, хром, медь [122, 157].
Извлечения из побегов черники оказывают гипогликемическое действие, которое обусловлено наличием гликозида «неомиртиллина» [76, 163]. Побеги черники обладают противовоспалительным, противомикробным, желчегонным, диуретическим, иммунотропным, кардиотоническим, антигипоксическим, ан-тиоксидантное действием, нормализуют обмен веществ [168, 203]. Водные извлечения используются при болезнях печени и поджелудочной железы, настой листьев показан при острых респираторных заболеваниях. Фенольные соединения проявляют антиоксидантные свойства, арбутин оказывает мочегонное и противовоспалительное действие. Урсоловая кислота обладает диуретическим, противовоспалительным действием, положительно влияет на обмен веществ при диабете [16]. Побеги черники входят в состав сборов и Б АД, применяющихся при нарушениях углеводного обмена, в частности в состав официналь-ного противодиабетического сбора «Арфазетин» [100, 147, 166].
Листья брусники содержат фенольные соединения, которые представлены арбутином, метиларбутином, гликозидом гидрохинона, фенолкарбоновыми кислотами и их производными (хлорогеновая, кофейная, изохлорогеновая, не охлорогеновая, феруловая, о-пирокатехиновая), дубильными веществами, фла-воноидами (производные кверцетина, кемпферола и лютеолина). Кроме того, в листьях брусники присутствуют урсоловая и аскорбиновая кислоты, иридоиды. Листья концентрируют железо, медь, барий, серебро, цинк, селен, марганец, могут накапливать хром [122, 157].
Листья брусники оказывают противовоспалительное, противомикробное, вяжущее, диуретическое, антиоксидантное, антигипоксическое действие [197]. Лечебное действие при воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей обусловлено арбутином и флавоноидами [115]. Фитонциды листьев подавляют рост золотистого стафилакокка. Листья брусники стимулируют выведение с мочой остаточного азота, мочевины, креатинина как в результате мочегонного эффекта, так и вследствие анаболического действия гиперозида [90]. Препараты обладают вяжущим, антисептическим и капилляроукрепляющим действием, благодаря содержанию в них флавоноидов, витаминов, урсоловой кислоты, дубильных веществ и катехинов, а также оказывают деминерализующее действие, стимулируют фагоцитоз и защитные силы организма [122]. Жидкий экстракт листьев проявляет диуретическое и седативное действие. В опытах на кроликах в модели сахарного диабета было установлено его гипогликемическое действие [186]. Отвар листьев используют при заболеваниях мочевыводящих путей, сахарном диабете, остеохандрозе, гастритах, ревматизме, простудных заболеваниях и др. [100, 168].
Листья крапивы имеют широкий спектр применения при различных патологиях [17, 34, 49, 90, 127, 138]. Химический состав листьев крапивы представлен витаминами (витамины группы В, пантотеновая, аскорбиновая, никотиновая кислоты, каротиноиды, витамин К), флавоноидами (производные кверцетина, кемпферола, изорамнетина), дубильными веществами, фенолкарбоно-выми и органическими кислотами (галловая, хлорогеновая, производные п-кумаровой, кофейной, феруловой кислот, щавелевая, янтарная, фумаровая, лимонная, муравьиная, хинная кислоты) [63, 70, 153, 201].
Разработка методики количественного определения флавоноидов в сборе противодиабетическом
Согласно оригинальным данным, сбор содержит разнообразные флаво-ноиды — производные кверцетина, кемпферола, лютеолина и др. Выше было показано, что флавоноиды обладают широким спектром биологической активности, который включает и гипогликемическую активность. Поэтому, мы считаем целесообразным проводить оценку качества сбора противодиабетического по количественному содержанию суммы флавоноидов.
Достаточно доступным, надежным и распространенным методом определения флавоноидов является метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Этот метод широко используется для анализа и стандартизации сборов [32, 53, 82, 84, 118, 156, 182, 184].
В ходе разработки методики экспериментально было изучено влияние различных условий экстрагирования сбора на выход флавоноидов (концентрация спирта этилового, размер частиц сырья, продолжительность и кратность экстракции), определены спектральные характеристики и условия комплексообразования (количество алюминия хлорида, влияние подкислителя, время комплексообразования и устойчивость комплекса).
В качестве стандартного раствора был выбран раствор рутина. Как видно по рисунку 28, максимум комплекса, образуемый флавоноидами сбора с алюминия хлоридом (409±1 нм) имеет значение, близкое к максимуму комплекса рутина с тем же комплексообразователем (412 нм). Кроме того рутин содержится в трех сырьевых компонентах сбора противодиабетического.
Для изучения влияния экстрагента на выход флавоноидов экстрагировали три различных образца сбора водой и спиртом этиловым разной концентрации (40%, 70%, 95%) в соотношении 1:100. Извлечения, полученные с использованием воды и спирта этилового 40%, представляли собой мутные растворы, так что в дальнейшем мы отказались от применения этих растворителей. Экстракты, полученные на 70 и 95 % спирте этиловом были подвергнуты хроматогра-фическому исследованию с целью сравнения флавоноидного состава. На хро-матограммах зоны флавоноидов в обоих экстрагентах соответствовали друг другу. Интенсивность флюоресценции зон флавоноидов соответствующих извлечению, полученному на спирте этиловом 95 %, была меньше чем в другом случае. Как видно из данных таблицы 3, наибольшее количество флавоноидов обнаруживается при экстрагировании спиртом этиловым 70%, статистическая обработка результатов эксперимента подтвердила значимость выбранных параметров (t3Kcn tKp) Влияние размеров частиц сырья изучали при соотношении сырья и экстра-гента 1:50. Результаты представлены в таблице 4. Из данных таблицы и статистического анализа видно, что размер частиц оказывает влияние на выход флавоноидов в спиртовое извлечение: оптимальным условием является экстрагирование сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм.
Продолжительность экстрагирования при соотношении сырья и экстраген-та 1:100, как следует из таблицы и статистического анализа, не оказывает достоверного влияния на выход флавоноидов в экстракт: равновесная концентрация достигается уже через 15 минут.
Следующим этапом разработки условий пробоподготовки было решение вопроса о кратности экстракции и соотношении сырья и экстрагента. Первоначально мы провели многократную повторную экстракцию в соотношении 1:50 и измерили содержание флавоноидов в каждой порции извлечения. Было установлено, что основное количество флавоноидов извлекается в течение первых трех экстракций и в последующих порциях их количество находится на уровне погрешности методики (рис. 29).
Изучение влияния соотношения сырья и экстрагента на выход флавоноидов показало, что достоверно больше флавоноидов переходит в экстракт при соотношении 1:100 (табл. 5). В связи с этим, дальше мы определяли оптимальную комбинацию кратности экстракции и соотношения сырья и экстрагента. Были проведены четыре варианта экстракции: 1) 2-х кратная экстракция порциями по 50 мл экстрагента (вариант 1); 2) экстракция последовательно порциями 100 и 50 мл (вариант 2); 3) 3-х кратная экстракция порциями по 50 мл (вариант 3); 4) экстракция последовательно порциями 100, и дважды по 50 мл (вариант 4).
Данные представлены в таблице 5. Полученные данные свидетельствуют о преимущественном выходе флавоноидов при дробной экстракции по вариантам 3 и 4. поскольку статистически достоверных различий между этими вариантами нет, мы выбрали вариант 3 как более экономичный.
В ходе отработки условий реакции комплексообразования мы проверили влияние на оптическую плотность концентрации спирта, количества алюминия хлорида и подкислителя.
Мы провели сравнение оптической плотности комплексов флавоноидов в среде спирта этилового 95 % и 70 %. Большая оптическая плотность наблюдалась при использовании спирта этилового 95 %. Дополнительным аргументом в пользу выбора этого растворителя являются данные литературы, согласно которым, проведение реакции комплексообразования в среде спирта этилового 95 % обеспечивает близкие спектральные свойства комплексов флавоноидов различных подгрупп [11].
Известно, что частичная диссоциация флавоноидов в растворе сравнения приводит к некорректным показателям оптической плотности [12]. Поэтому, для переведения флавоноидов в растворе сравнения в недиссоциированную форму, нами был подобран подкислитель. Основываясь на опыте-кафедры в разработке методик количественного определения флавоноидов и литературных данных [20, 39, 79, 140, 169], мы изучили влияние уксусной и разбавленной хлористоводородной кислот на рН растворов, приготовленных в разведении 5:25.
Влияние способа приготовления водного извлечения сбора на качество получаемых экстрактов
В целом можно отметить, что измельченность сырья в выбранных пределах оказывает достоверное влияние на выход дубильных веществ из сырья черники, брусники, шиповника и калины, на выход экстрактивных веществ — из побегов черники, листьев брусники и крапивы, флавоноидов - из плодов шиповника, органических кислот - из брусники. В сырье брусники большее число групп БАВ при экстракции подвержено влиянию размеров частиц, что вероятно связано с гистологической структурой сырья. Для других объектов колебания со / держания БАВ очень незначительны и не позволяют выявить влияние измель-ченности на переход веществ в настои.
Получив экспериментальные данные, мы рассчитали выход БАВ из сырья в настой относительно их исходного содержания в сырье. Результаты представлены в таблице 22.
Среди изученных объектов листья брусники характеризуются высоким содержанием и выходом большинства групп БАВ в водное извлечение: экстрактивные, дубильные вещества - до 97%, арбутин - в среднем 94%. Из побегов черники лучше всего извлекаются органические кислоты (83 %) и экстрактивные вещества (до 83%), из побегов леспедецы - экстрактивные вещества (78 %), из листьев крапивы - дубильные вещества (88 %), из плодов шиповника - органические кислоты (88 %), из плодов калины - экстрактивные вещества и орга нические кислоты (88 %). Относительно низкий выход экстрактивных веществ обнаруживается для сырья крапивы (68-77%), дубильных веществ - для побегов черники (57-68 %), органических кислот - для листьев брусники (61-81 %). Переход в настои флавоноидов является наименьшим для побегов леспедецы и плодов калины и составляет 58-68 %, в то время как содержание этих веществ в сырьевых объектах различается в 14 раз (см. табл. 15). Относительно низкий выход флавоноидов в настои крапивы, леспедецы и калины может быть связан с химической природой этих веществ. Известно что, лучшими экстрагентами, в большинстве случаев, для флавоноидов являются спирто-водные смеси.
В целом выход большинства групп БАВ из сырья находится на высоком уровне - 70-90 %. Относительный выход экстрактивных веществ в настои колеблется от 68 до 97 %. Выход дубильных веществ находится в интервале 57— 93 %, флавоноидов - 65-89 %. Для дубильных веществ наблюдается больший разброс значений перехода в настой, чем для других групп БАВ, что может быть связано с более выраженным влиянием на эту группу БАВ морфологических особенностей сырья и фактора измельченности. Аскорбиновая кислота в і настои плодов извлекается на 65-74 %. Переход органических кислот из побегов черники и плодов находится примерно на одинаковом уровне 77-89 %. Отмечается разница в выходе простых фенольных соединений из листьев брусники (89-96 %) и побегов черники (65-72 %). Вероятно, эта разница обусловлена гистологическими особенностями сырья и свойствами веществ, составляющих эту группу.
Результат эксперимента показал, что фактор измельченности в данных условиях экстракции оказывает неоднозначное влияние на выход в настои комплекса БАВ: в случае отдельных БАВ достоверное влияние оказывают размеры частиц сырья, в других случаях этот фактор не проявляется в силу морфологических и гистологических особенностей ЛРС и химической природы веществ. Влияние гистологической структуры сырья, локализации веществ, а также, очевидно, сочетание основных БАВ с сопутствующими веществами проявляется в различиях по выходу одних и тех же БАВ при одинаковой измельченности частиц, но из разных видов сырья.
В среднем достоверные изменения выхода в настои БАВ в зависимости от измельченности сырья составляют 13 % и не имеют принципиального значения. Поэтому размеры частиц сырья для приготовления сбора выбирали исходя из технологических показателей.
Известно, что с уменьшением размеров частиц ухудшаются органолепти-ческие показатели настоев, увеличивается мутность и уменьшается стабильность водных извлечений [151]. Получение порошкованного сырья (0,5-1 мм) сопровождается увеличением отходов (пыли) и требует больше затрат электроэнергии и времени. Поэтому стремление увеличить выход БАВ в настой, уменьшая размеры частиц сырья, не всегда оправдано.
Приготовление сбора из сырья крупного помола приводит к расслаиванию, что вынуждает потребителя тщательно перемешивать сбор перед приготовлением, для обеспечения однородности дозирования.
По совокупности вышеперечисленных обстоятельств экономического И і технологического характера и с учетом полученных экспериментальных данных были выбраны оптимальные размеры частиц компонентов сбора противо-диабетического: для листьев крапивы, побегов черники и леспедецы - 3 мм, для листьев брусники, плодов калины и шиповника - 2 мм.
Количественный анализ БАВ побегов голубики
Для целей сравнительного анализа с результатами, полученными Г. Я. Мечиковой, для побегов черники обыкновенной мы использовали идентичные методы. Пересчет флавоноидов проводили на ГСО рутина.
Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм. Около 1г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 150 мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем содержимое колбы охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Экстракцию повторяли еще 2 раза по 15 мин, используя 50 мл 70% спирта. Фильтровали извлечение в ту же мерную колбу. Объем извлечения доводили 70% спиртом до метки и перемешивали (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 5 мл раствора А, 0,1 мл уксусной кислоты, 5 мл 10%) раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводили объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали рас твор, состоящий из 5 мл извлечения, 0,1 мл разведенной уксусной кислоты и доведенный 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряли оптическую плотность раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина.
Приготовление стандартного образца: около 0,05г (точная навеска) ГСО рутина (ФС 42-2508-87), высушенного при 130-1400 С, растворяли при нагревании на водяной бане в 60 мл 70% этанола в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводили объем раствора тем же растворителем после охлаждения до метки. Срок годности раствора 1 мес.
Как видно по таблице 32, содержание флавоноидов варьирует от 2,58 до 4,94 %, среднее значение составляет 3,75 %. Коэффициент вариации равен 15%. Ранее проведенные исследования побегов черники обыкновенной показали, что количество флавоноидов варьирует от 1,12 до 2,53 %, средний показатель равен 1,84 %. Коэффициенты вариации количества флавоноидов голубики и черники составляют 15 и 20 соответственно. Сравнение данных по критерию Стыодента показали, что содержание флавоноидов в побегах голубики достоверно больше, чем в побегах черники (/эксп = 11; tKp = 2,1).
Для количественного определения суммарного содержания фенолкарбоновых кислот использовали извлечение, полученное для определения флавонои-дов. 1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили 70% этиловым спиртом до метки. Измеряли оптическую плотность полученного раствора, используя в качестве раствора сравнения - спирт этиловый 70 %, в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Содержание фенолкарбоновых кислот в пересчете на стандартное вещество и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляли по формуле:
у- т0 250 1 25 100 100 Ц, от 100 1 50 (100-Ж) где D — оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора стандартного вещества; m - масса сырья в граммах; то -масса стандартного вещества в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Для сравнения с данными по чернике оптическую плотность измеряли при длине волны 284 нм и пересчет проводили на РСО галловой кислоты. Для получения более корректной количественной характеристики о содержании основных групп веществ пересчет осуществляли по РСО кофейной кислоте при длине волны 320 нм.
Результаты определения суммы фенолкарбоноывх кислот в образцах голубики представлены в таблице 35. Результаты исследований показали, что среднее содержание фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту составляет - 5,0 %. Содержание фенолкарбоноывх кислот в отдельных образцах различается в 4 раза, коэффициент вариации составляет 30 %. Количественное содержание фенолкарбоновых кислот в пересчете на галловую кислоту коррелирует с результатами расчета по кофейной кислоте (г=0,93).
Сравнение результатов с данными по чернике, в пересчете на галловую кислоту, показали значимые различия в среднем содержании фенолкарбоновых кислот в пользу голубики. В побегах черники в среднем содержится 7,5 % фенолкарбоновых кислот. Разброс результатов находится на одном уровне, что отражено в значении коэффициентов вариации (15-14 %).
Для определения арбутина мы использовали альтернативную фармакопейной методику, описанную в литературе, адаптированную для нашего объекта [183]. Данная методика предлагает проводить очистку извлечения от сопутствующих веществ (дубильных, флавоноидов) на колонке с алюминия оксидом.
Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм. Около 1г (точная навеска) измельченного сырья помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл 40% этилового спирта. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали при умеренном кипении на водяной бане в течение 30 мин. Извлечение охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Повторяли экстракцию три раза, используя 50 мл 40% этилового спирта. Вторая экстракция в течение 30 мин, третья и четвертая экстракция в течение 15 мин. После охлаждения извлечения фильтровали в ту же мерную колбу, и раствор доводили до метки 40 % этанолом (раствор А). 5 мл раствора А помещали в колонку с алюминия оксидом и элюировали 20 мл 40% этилового спирта. Элюат собирали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объем раствора до метки 40% спиртом этиловым и перемешивали (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 282 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали 40% спирт этиловый, пропущенный через колонку с алюминия оксидом.
