Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Ботанические сведения об астрагалах секции Cenanthrum, произрастающих на территории Бурятии 11
1.2. Биологически активные вещества астрагалов 17
1.3. Применение астрагалов в народной, традиционной и научной медицине
1.4. Перспективы использования А. перепончатого в качестве нового лекарственного средства
Глава 2. Фармакогностическое изучение надземной части астрагала перепончатого
2.1. Морфологические признаки растения 36
2.2. Микроскопический анализ 40
2.2.1. Анатомическое изучение и определение диагностических признаков вегетативного побега
2.2.2. Анатомическое изучение и микроскопическая характеристика генеративных органов
2.2.3. Диагностические признаки порошка астрагала перепончатого 54
2.3. Фотохимическое изучение травы астрагала перепончатого 55
2.3.1. Качественные реакции 55
2.3.2. Хроматографический анализ 58
2.3.3. Изучение веществ фенольной природы методом ВЭЖХ 63
2.3.4. Изучение гексанового экстракта астрагала методом хроматомасс-спектрометрии
2.3.5. Изучение аминокислотного состава травы астрагала 75
2.3:67 Количественное определение основных групп биологически активных веществ в траве астрагала перепончатого
2.4. Анализ элементного состава травы астрагала перепончатого 81
Выводы к главе 2 84
Глава 3. Разработка показателей качества и стандартизация травы астрагала перепончатого
3.1. Разработка показателей контроля качества сырья 86
3.1.1. Товароведческий анализ 86
3.1.2. Определение подлинности сырья 88
3.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала перепончатого спектро-фотометрическим методом
3.3. Характеристика водных извлечений из травы астрагала перепончатого
3.3.1. Подбор условий экстрагирования 94
3.3.2. Определение коэффициента водопоглощения травы астрагала перепончатого
3.3.3. Изучение стабильности травы астрагала перепончатого в процессе естественного хранения сырья
Выводы к главе 3 97
Глава 4. Ресурсная характеристика астрагала перепончатого
4.1. Распространение и фитоценотическая приуроченность 99
4.2. Оценка жизненности и оптимума ценопопуляций астрагала перепончатого
4.3. Динамика накопления флавоноидов в надземной части астрагала перепончатого
4.4. Определение соотношения разных органов в сырье 111
4:5. Урожайность~астрагала перепончатого в природных популяциях 113
Выводы к главе 4 117
Общие выводы
Список литературы
Приложение
- Биологически активные вещества астрагалов
- Перспективы использования А. перепончатого в качестве нового лекарственного средства
- Анатомическое изучение и определение диагностических признаков вегетативного побега
- Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала перепончатого спектро-фотометрическим методом
Введение к работе
В результате антропо-экологических стрессорных воздействий у современного человека возникают различные психосоматические патологические состояния. Все больше удельный вес приобретают так называемые болезни цивилизации: сердечно-сосудистые, нервно-психические, аллергические, онкологические и другие, которые часто осложняются формированием вторичного иммунодефицита [86]. В связи с этим возникает необходимость поиска средств, способных неспецифически стимулировать иммунную систему с целью повышения резистентности организма к любым патогенным факторам. Этим требованиям в определенной мере соответствуют иммуномодуляторы растительного происхождения [20].
Лекарственные средства растительного происхождения находят широкое применение в медицине. Возрастающая популярность и эффективность во многом объясняется содержанием в них биологически активных веществ, которые воздействуют на организм человека комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют негативных побочных реакций при длительном применении.
Одним из возможных подходов для решения создавшейся проблемы является поиск и фармакогностическое изучение новых лекарственных растений для расширения ассортимента иммуномодулирующих лекарственных растительных средств.
С потерей традиционных мест заготовки и культивирования лекарственных растений в Европейской части страны возникает необходимость перенесения заготовок в Сибирь и на Дальний Восток, в частности, Бурятия обладает значительными потенциальными запасами дикорастущих лекарственных растений, которые изучены недостаточно [89, ПО, 166].
Богатейший опыт использования растений в народной и традиционной медицине является надежным ориентиром для выбора новых перспективных видов лекарственного сырья. Большой интерес представляет изучение средств тибетской медицины, которая имеет огромный опыт по использованию лекарственных растений в лечебной практике. К числу лекарственных растений, широко применяемых в тибетской медицине, относятся астрагалы, рекомендуемые для общего укрепления организма, выведения токсинов, заживления поврежденных тканей. Астрагал условно составляет «элиту» традиционных медицин Монголии, Китая, Кореи и Японии. Широкое применение находит он и в медицине Западной Сибири, Забайкалья, Дальнего Востока как стимулятор иммунной системы [14, 73, 147].
Таким образом, поиск сырьевых источников, создающих реальные предпосылки для получения фитопрепаратов, является актуальной проблемой, направленной на реализацию социального заказа здравоохранения.
На основании вышеизложенного, большой интерес для изучения представляет астрагал перепончатый - Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.
ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩИХ ИССЛЕДОВАНИЙ явилось обоснование возможности использования надземной части астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии, в качестве лекарственного растительного сырья.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- провести морфолого-анатомическое изучение надземных органов астрагала перепончатого и установить диагностические признаки;
- определить качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) в надземной части астрагала перепончатого;
- изучить динамику накопления действующих веществ по органам и фазам развития растения для обоснования выбора вида сырья и сроков заготовки сырья;
- определить есурсно-сырьевой потенциал астрагала перепончатого, дать краткую ресурсную характеристику;
- провести стандартизацию сырья и разработать нормативную документацию на лекарственное сырье - «Трава астрагала перепончатого».
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Методами морфолого-анатомического изучения травы астрагала перепончатого установлены диагностические признаки числовые показатели для определения подлинности лекарственного растительного сырья.
Избирательной экстракцией, в сочетании с методами бумажной, тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ, методом хроматомасс-спектрометрии определены: рутин, гиперозид, кверцетин, кофейная, феруловая, п-оксибензойная, аскорбиновая, яблочная и гексадекановая кислоты, непредельные алканы (1-октадецин, 1-доказен, гептакозан, гексакозанол), фитол, сквален, амирин; идентифицированы 25 свободных и 16 связанных аминокислот, среди которых обнаружено 9 незаменимых аминокислот; качественно и количественно определены 14 макро- и микроэлементов в траве астрагала. Определено количественное содержание в траве астрагала дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов, аминокислот, аскорбиновой и органических кислот.
С использованием полученных данных химического состава БАВ, динамики их накопления по органам и фазам развития растения, стабильности в процессе хранения, разработана методика стандартизации сырья, которая заключается в количественном определении суммарного содержания флавоноидов в траве астрагала перепончатого в пересчете на рутин-стандарт методом дифференциальной спектрофотометрии.
Определены показатели сырьевой продуктивности и запасы сырья астрагала перепончатого.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании результатов исследований разработаны показатели подлинности и доброкачественности сырья и составлен проект ФСП на сырье — «Трава астрагалаГперепончатого», разработана «Инструкция по сбору и сушке травы астрагала перепончатого».
Методика качественных реакций, ТСХ-анализа и методика количественного определения травы астрагала перепончатого апробированы и внедрены в учебный процесс кафедры ботаники ГОУ ВПО Бурятский государственный университет (акт внедрения от 17.10.06 г.).
Нормативная документация «Трава астрагала перепончатого» внедрена в производство ГУЗ «Центр Восточной медицины» (акт внедрения от 10.07.07 г.).
Водные извлечения («отвар») травы астрагала перепончатого обладают иммуномодулирующим действием (Заключение лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН от 20.06.04 г.).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ и ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертационной работы доложены на: 4-й Международной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2003); юбилейной научно-практической конференции «Фармацевтической службе республики Бурятия - 80 лет» (Улан-Удэ, 2004); четвертой региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2005); VII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов, докторантов и молодых ученых «Наука XXI веку» (Майкоп, 2005); научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения доктора медицинских наук Базарона Э.Г. (Улан-Удэ, 2006).
По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, 1 статья в периодическом издании, рекомендованная ВАК МО и науки РФ.
СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ НАУЧНОГО СОВЕТА ПО ФАРМАКОЛОГИИ И ФАРМАЦИИ. Настоящая работа выполнена в соответствии с программой и планом научно 9 исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация» на 2003-2006 гг, утвержденной президиумом СО РАН. НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:
- результаты фармакогностического изучения астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии;
- результаты исследований по стандартизации сырья - травы астрагала перепончатого;
- обоснование возможности использования травы астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии, в качестве лекарственного растительного сырья.
Биологически активные вещества астрагалов
В растениях сем. Бобовые широко распространены флавоноиды и хинолизидиновые алкалоиды [22; 84; 85]. Относительно химии флавоноидных соединений Astragalus L. хорошо известны работы Д. Дунгэрдоржа [65; 67; 68], в которой приведён флавоноидный агликоновый состав растений этого рода. Автор указывает на следующие агликоны: кемпферол, кверцетин, рамноцитрин и куматакенин, присутствующие в растении в свободном виде. Данные по флавоноидному составу астрагалов приведены в сообщениях В.И. Сидельниковой [129], М.А. Макбуль и К.Ф. Блиновой [105], Гужвы с соавторами [55, 56, 57, 58, 59], А.В. Киселёвой [88].
Изучен флавоноидный состав А. клочковатолистного и А. сомнительного [174]. В надземной части А. сомнительного обнаружены флавоноиды: кверцетин, рутин, гиперин, мирицетин, кемпферол, лютеолин, цинарозид, а в надземной части А. клочковатолистного — кверцетин, рутин, 3-метиловый эфир кверцетина, кверцитрин, кемпферол, 3-глюкозид кемпферола, апигенин, рамнетин, 3-галактозид рамнетина, изорамнетин, 3-глюкозид изорамнетина, 3-галактозид изорамнетина. Сотрудниками Пятигорского фармацевтического института были выделены и определены вещества кумариновой природы фенолкарбоновые кислоты из A. onobrychis [60].
Высоким содержанием флавоноидов (более 3%) характеризуются А. бороздчатый, А. донниковый, А. даурский, А. молочнобелый, А. датский, А. кустарниковый, А. морщинистоплодный. А. пушистый, А. разноцветный, А. саралинский, А. лисий, А. лисохвостый, А. южносибирский, А. приподнимающийся, А. эспарцетовый, А. шерстистоцветковый и А. яичкоплодный [7; 8; 12; 88; 90; 93; 121; 129]. У этих видов самое высокое содержание флавоноидов отмечено в цветках, немного меньше — в листьях и минимальное — в стеблях [22; 29; 114]. Установлена взаимосвязь между содержанием в A. caprinus [207] фенольных соединений с антиоксидантной активностью. Было выявлено 36 соединений фенольной природы. Хромато графическое разделение показало три класса соединений: флавоноиды, катехины и фенолкарбоновые кислоты. Авторы делают предположение, что хорошая адаптивная возможность A. caprinus связана с большим разнообразием фенольных соединений. В Центральном Сибирском ботаническом саду проведены исследования, в результате которых для 8 видов астрагалов (сек. Cenantrum) определены гликозидные "флавоноидные профили". Общими оказались: кверцетин, кемпферол и изорамнетин [130].
С начала 70-х годов ташкентскими учёными во главе с М.И. Исаевым подробно изучается класс тритерпеновых соединений, семейства астрагалов [1; 2; 3; 4; 5; 9; 70; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 155; 184; 198; 213]. Исследованы циклоартановые метилстероиды Astragalus amarus, A. alopecurus и A. Orbiculatus [177; 178; 179; 187]. Из А. приподнимающегося выделено 15 соединений, среди которых идентифицировано два новых тритерпена [189; 197; 201; 221]. Тритерпеновые гликозиды А. сходного идентифицированы как астрагалозиды I-VIII, ацетиластрагалозид, соясапонин, изоастрагалозид I, II, соясапогенол и З-O-ct-D- глюкопиранозид циклоастрагенола [179; 196]. Также они обнаружены в надземной части А. австрийского, А. альпийского, А. датского, А. даурского, А. кустарникового. А. лисьего, А. сходного, А. эспарцетного [21; 29]. Дана структурная формула тритерпеновых гликозидов из Astragalus trigonus и A. verrucosus [189]. Японскими учёными описано 11 соединений тритерпеновой природы, выделенных из корней выращенного в культуре А. перепончатого: acetylastragaloside I, astragaloside I-IV, agroastragaloside I, II, isoastragaloside I, 3-O-p-D-xylopyranosyl-cycloastragenol, agroastragaloside III (I) and agroastragaloside IV (2) [223], а также охарактеризованы: полисахариды, аминокислоты, полифенолы, флавоноиды и кумарины [59; 60; 66; 89; 163; 199; 207; 216].
Из надземной части A. sieberi выделено и идентифицировано два новых циклоартановых сапонина [187; 214]. Тритерпены циклоартанового ряда выделены из: A. verrucosus [202; 203], А. cephalotes var. brevicalyx [184], A. shikokianus [221], A. trojanus [178], А. sieversianus [127; 128], A. trigonus [201].
Алкалоиды содержатся почти во всех видах астрагалов, но наибольшим их содержанием характеризуется А. даурский [29]. Редкий алкалоид смирновин выделен из А. тибетского. В A. canadensis обнаружены соединения с функциональной нитро-группой [181; 219; 220]. В астрагалах обнаружены: каротин, витамины С, Вь В2, Е [103]. В некоторых видах астрагалов флоры Монголии выявлены антиоксиданты липидной природы [100]. Растения рода Астрагал обладают высоким содержанием азотистых веществ - 6,85 % азота; при среднем весе семени 9,5 мг содержание сырого белка 42,81 % [25; 26]. По сведениям К.Ф. Блиновой и К.Л. Стуккей [27], у некоторых представителей астрагалов содержатся кумарины: в А. приподнимающемся: в надземной части - 0,16, в корнях - 1.29 %; в А. датском: в надземной части - 0,13, в корнях - 1,5 %; в А. перепончатом: все растение - 2 %; в А. донниковом: в надземной части - 0,08; в корнях -0,18; в А. молочнобелом: в надземной части - 0,08 %. Растения служат лучшими накопителями макро- и микроэлементов. Сведения о содержании элементов в сырье востребованы, что связано с его загрязненностью. Согласно литературным данным, биологическая активность астрагалов обусловлена, в основном, за счет микроэлементов Se, Fe, Мп и Си [53; 211].
Результаты анализа на элементный состав некоторых видов астрагалов, проведённого Алания М.Д. с соавторами [10] показали, что наиболее высокое количество калия отмечается у A. brachycarpus , А. borissovae , A. cicer , A. cornutus , A. falcatus , A. galegiformis , А. glycyphyllos , A. glycyphylloides и A. kadshorensis . Обнаружено сранительно высокое содержание железа в следующих видах (%): А. brachycarpus - 0,48, A. galegiformis - 0,35, A. glycyphyllos - 0,35, А. brachytropis - 0,34, A. brachyceras - 2,5, A. calycinus - 0,22. A. falcatus -0,13, и A. oreades - 0,15.
Перспективы использования А. перепончатого в качестве нового лекарственного средства
По данным Всемирной организации здравоохранения в настоящее время фоном для роста огромного числа заболеваний служит сниженный иммуностатус [20]. Среди фармакологических средств зо иммуностимуляторов наиболее распространены растительные препараты женьшеня, элеутерококка, лимонника, родиолы [57; 101; 107; 171]. Существуют и другие эффективные растения, еще не изученные и не использованные в настоящее время, но на протяжении многих веков применяемые в восточной медицине. Интересен опыт традиционной медицины Тибета, в которой большое внимание уделяется средствам, способствующим очищению организма [19]. Препараты растительного происхождения обладают достаточно выраженным иммуномоделирующим действием [61; 133] и характеризуются малой токсичностью [120; 139].
А. перепончатый известен как тонизирующее и балансирующее органы растение, обеспечивает мощное стимулирование иммунной системы [20]. В соответствии с традиционной китайской медициной классифицируется как теплый, сладкий тоник, который улучшает функционирование селезенки и легких. Рекомендуется для общего укрепления организма, выведения токсинов и заживления поврежденных тканей. Иммуномоделирующее действие астрагала распространяется на все звенья иммунитета. Он повышает количество стволовых клеток в костном мозге и лимфатических узлах, способствует дифференцировке этих клеток в иммунокомпетентные, которые после этого мигрируют в ткани, способствует переключению этих клеток из пассивного состояния в активное [74]. Увеличивает количество антител в крови и повышает производство интерферона белыми кровяными клетками, используется для лечения экземы, кожных язв и абсцессов [61]. В клинических тестах А. перепончатый продемонстрировал способность увеличивать срок жизни людей, больных раком, прошедших химиотерапию или облучение [35].
Корень астрагала увеличивает выносливость, стимулирует кровообращение, улучшает метаболизм, оказывает тонизирующее и сосудорасширяющее действие [32]. Его называют китайским женьшенем. Важной особенностью астрагала является высокое содержание селена, стимулирующего кроветворение [100]. Действие астрагала обусловлено увеличением активности клеток-киллеров, уничтожающих опухолевые и вирус-инфицированные клетки [74]. Оно подавляет аутоиммунные и аллергические реакции; защищает от вирусов, бактерий и патогенных грибов, нормализует микрофлору жуледочно-кишечного тракта. Происходит стимуляция функции Т-лимфоцитов, способствующая выработке интерферона. Кроме того, астрагал увеличивает фагоцитарную активность моноцитов и макрофагов. Пополнение арсенала лекарственных средств поможет решить задачу по устранению и лимитированию иммунодефицита.
Заключение. Из обзора древних медицинских трактатов следует, что А. перепончатый является одним из источников тибетского растительного сырья «срад ма». Учитывая факты применения астрагала перепончатого во многовековой народной медицине, а также использования в научной медицине, целесообразно изучение состава биологически активных веществ и ресурсной базы астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии.
В качестве объекта для исследования использовались образцы надземной части астрагала перепончатого: листья, стебли, цветки, заготовленные в 2003-2006 гг. в Селенгинском, Заиграевском, Хоринском, Еравнинском, Прибайкальском районах Республики Бурятия и пригородной зоне г. Улан-Удэ («Верхняя Березовка») по фазам развития растения: начало вегетации; бутонизация и начало цветения; массовое цветение; плодоношение.
В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации. Исследования качественного состава А. перепончатого проводили методами одномерной и двумерной хроматографии на бумаге (БХ), марки Filtrak FN-12,16 (ГДР), тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «Silufol» UV 254 (ЧССР), «Sorbfil» ПТСХ П-А-УФ-254.
Системы растворителей: 1. 15 % раствор кислоты уксусной; 2. н-бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ) (4:1:2); 3. хлороформ-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1); 4. спирт этиловый- раствор аммиака (4:1); этилацетат- уксусная кислота (8:2); 5. н-бутанол- муравьиная кислота-вода (18:2:9); 6. этилацетат-муравьиная кислота-вода (10:2:3); 7. гексан-ацетон (7:3); 8. гексан-этилацетат (8:2); 9. хлороформ-спирт этиловый (19:1).
Хроматографирование выполняли в определенной системе растворителей при комнатной температуре в герметически закрытых стеклянных камерах. Соотношение растворителей брали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из 5 измерений.
Элементный состав травы определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре «SOLAAR М 6» (США) при спектральном диапазоне 180-900 нм по стандартным аналитическим программам этой фирмы. Спиртовый экстракт, этилацетатную и бутанольную фракции анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова» Новосибирск, Россия) с колонкой (2 х 75 мм), упакованной сорбентом «Silasorb SPH», 5 мкм, с эффективностью 4000 т.т. по пику хризена (k1 = 10) с компьютерной обработкой данных.
Анализ гексанового извлечения травы астрагала проводили на хроматомасс-спектрометре «Agilent GC 6890, MSD 5973» (США). Колонка DB 5 ms, 30 м; внутренний диаметр - 0,25 мм; градиент температуры колонки при разделении от 50 до 300 С при скорости нагрева 10 град/мин, далее 25 мин при 310 С, температура инжектора 290С, квадруполя 150 С. Объем вводимого в колонку образца 1 мкл с разделением потока 1:2. Пики детектировали в режиме полного сканирования масс-спектров, идентификацию пиков проводили по базе данных «NIST/MS», включающей 150000 масс-спектров.
Аминокислоты определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия) по общепринятым методикам. Обсчет и идентификацию хроматограмм проводили на бортовом компьютере, которым снабжен анализатор. Содержание каждой идентифицированной аминокислоты определяли в наномолях в 1 мг навески, а затем проводили перерасчет количественного содержания аминокислот в мг % к абсолютно сухому веществу.
Анатомическое изучение и определение диагностических признаков вегетативного побега
Проведено исследование гербарного материала и свежесобранного сырья астрагала. Предварительно были проведены микрохимические реакции. Крахмал в исследуемых частях растения не обнаружен (реакция с раствором Люголя отрицательна). Жирные масла отсутствуют (реакция с Суданом III отрицательна). Характерное окрашивание Сахаров а -нафтолом наблюдалось в коре и проводящей системе стебля (паренхимные клетки и клетки флоэмы окрасились в малиновый цвет). Положительная реакция была получена на дубильные вещества с раствором железа (II) сульфата (синее окрашивание вдоль сосудисто-волокнистых пучков в листьях и в проводящей системе стебля).
Строение листа. Для исследования листа были приготовлены препараты с верхней и нижней стороны листа и поперечные срезы. При рассмотрении листа с поверхности под микроскопом с обеих сторон листовой пластинки видны клетки эпидермиса - изодиаметрические, с извилистыми стенками, клетки с верхней стороны листа мелкие и извилистость стенок более выражена (рис. 2, 3). Оболочки стенок относительно тонкие. Устьица расположены редко (2-3 на 0,3 мм"). Клетки верхней эпидермы листа (Рис. 3) имеют более извилистые и тонкие клеточные стенки; более мелкие, чем клетки нижнего эпидермиса. На нижней стороне листа устьиц больше (4-8 на 0,3 мм ).
Тип устьичного комплекса аномоцитный (ранункулоидный) - устьице не имеет побочных клеток. Число околоустьичных клеток от 3 до 4, они равны собственно эпидермальным и не отличаются от них по форме. Эпидермальные клетки над жилкой листа вытянуты. Важным диагностическим признаком являются трихомы. А. перепончатый на нижней эпидерме листа имеет простые одноклеточные (реже двуклеточные) однорядные волоски. Длина волосков 360-370 мкм.
На поперечном срезе листа обнаружено, что листочек и его мезофилл имеют дорсовентральное строение (Рис. 4, 5, 6). Мезофилл дорсальной стороны листочка состоит из трех-четырех рядов палисадной хлоренхимы. С вентральной стороны располагается 4-5 рядов губчатой паренхимы. Верхняя эпидерма состоит из клеток с сильно выпуклыми наружными стенками. В выступах жилок под эпидермисом с нижней стороны расположен один ряд уголковой колленхимы. Проводящая система жилок представлена коллатеральными пучками со спиральными трахеидами.
Диаметр сосудов достигает 9,8 мкм. К ксилеме прилегает слой клеток с утолщенными неодревесневающими оболочками. Одревесневшие стенки сосудов ксилемы при воздействии сафранина окрасились в красный цвет. С вентральной стороны пучок армирован тяжем склеренхимы. Под эпидермой над проводящим пучком расположен участок уголковой колленхимы.
Черешок сложного листа в поперечнике подковообразной формы. Снаружи покрыт эпидермой с утолщенными наружными тангентальными стенками.
Эпидермис черешка состоит из вытянутых клеток, прямоугольного очертания, реже почти прямоугольных, длиной 39,25 - 42 мкм и шириной 8,50 - 10,25 мкм. Встречаются устьица ранункулоидного типа. Эпидермис подстилают 1-2 слоя клеток колленхимы по всей окружности, ниже расположены 3-4 слоя тонкостенной ассимиляционной паренхимы, в паренхиме встречаются одиночные призматические кристаллы. На поперечном срезе видны многочисленные проводящие пучки, асположенные по периферии сечения; самый крупный - открытого типа (рис. 7, 8). Сосудистые элементы древесины располагаются правильными рядами от клеток камбия, производящими их, чередуясь с рядами либриформа.
Правильный рядковый порядок характерен и для проводящих элементов луба. Над пучками развиваются участки склеренхимных волокон. По всему сечению крупноклеточная паренхимная ткань пронизывает черешок. В центральной части черешка имеются два открытых коллатеральных пучка, крупный, проходящий ближе к дорсальной стороне, и мелкий, проходящий ближе к вогнутой части черешка, с двух сторон от них находятся по два коллатеральных пучка. Наряду с коллатеральными пучками встречаются пучки, в которых флоэма охватывает ксилему не полностью.
Из проведенного анатомо-диагностического исследования листа и черешка А. перепончатого можно заключить, что исследуемый вид относится к мезоксерофитам: стенки клеток эпидермиса сильно извилистые, клетки мезофилла листа плотно прилегают друг к другу, клетки внутренней паренхимы черешка близко прилегают друг к другу.
Строение стебля исследовали на серии поперечных и тангентальных срезов. Эпидермис стебля двухслойный; представлен клетками прямоугольной формы с прямыми стенками, вытянутыми по длине стебля (рис. 9 а, б). Под эпидермисом находятся два слоя пластинчатой колленхимы. Ниже располагается многорядная крупноклеточная паренхима. В средней части на поперечном срезе (рис. 10 а, б) стебель имеет типичное пучковое строение. Проводящие пучки располагаются друг от друга на расстоянии 0,5 - 0,7 мм. Всего по контуру 8 крупных и 8 пар мелких коллатеральных пучков.
Над слоем флоэмы находится широкий слой склеренхимы, сосуды со спиральным и точечным утолщением располагаются в виде трехрядных радиальных тяжей. Диаметр сосудов ксилемы 40 мкм; диаметр сосудов флоэмы 5 мкм.
Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала перепончатого спектро-фотометрическим методом
Одним из критериев доброкачественности сырья является стандартизация травы астрагала перепончатого по доминирующим веществам. Предварительный хроматографический анализ водно-спиртовых извлечений из надземной части астрагала перепончатого показал, что в них содержатся флавоноиды: рутин, гиперозид, кверцетин и др.
Для количественной оценки флавоноидов, поглощающих в УФ- и видимой областях (рис. 26), наиболее подходит метод спектрофотометрии с использованием комплексообразующих реагентов. Известно, что хлорид алюминия образует комплексные соединения с флавоноидами, при этом наблюдается батохромный сдвиг I полосы поглощения флавоноидов от 330-350 до 390-415 нм [94].
Дифференциальные спектры поглощения 1 - ГСО рутина и 2 - флавоноидов астрагала с алюминия хлоридом Определение оптимальных условий извлечения суммы флавоноидов из травы астрагала изучали на одном образце сырья. Решались вопросы выбора экстрагента, соотношения сырье-экстрагент, степени измельчения, времени экстракции, температуры (табл. 16). Проведенные исследования показали, что максимальное извлечение флавоноидов из травы астрагала достигается при размере частиц сырья 1 мм, соотношении сырье-экстрагент 1:50 спиртом 60 % при нагревании на водяной бане до 60 С в течение 1 часа. При дальнейшей разработке методики необходимо было отработать условия проведения фотометрической реакции комплексообразования суммы флавоноидов спиртового извлечения травы астрагала со спиртовым раствором алюминия хлорида (рис. 27). Было установлено, что максимальная оптическая плотность достигается при использовании 1 мл извлечения с 2 мл 2 % спиртового раствора алюминия хлорида. Устойчивое окрашивание извлечения из травы с алюминия хлоридом наступает через 40 мин и сохраняется в течение 2 часов. Таблица17
Методика. Около 1,0 г (точная навеска) сырья помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл спирта 60 %, колбу взвешивают с погрешностью ± 0,01 г, присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы спиртом 60 %. Фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2 % спиртового раствора алюминия хлорида, доводят объём колбы спиртом 95 % до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. В качестве раствора сравнения используют смесь 1 мл раствора А, помещённого в мерную колбу вместимостью 25 мл, 1-2 капель кислоты уксусной разведённой, и доведённую спиртом 95 % до метки. Оптическую плотность полученных растворов измеряют через 40 мин на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 405 нм. Параллельно, в указанных выше условиях, измеряют оптическую плотность 0,05% ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин и абсолютно сухое сырьё (X) в процентах рассчитывают по формуле: D-m0- 1 50-25- 100- 100 Х= D0- 100 -25 т- 1 -(100-W) где D — оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m — масса сырья, г; т0- масса ГСО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %
Нами было проведено изучение водных извлечений («настой», «отвар») в зависимости от технологии приготовления, коэффициента водопоглощения (К/в) сырья, степени измельчения и соотношения сырье -экстрагент.
Сырье астрагала перепончатого состоит из разных частей растения различного морфолого-анатомического строения. По ГФ X издания, ст.349 сырье измельчают: листья, цветки - до частиц размером не более 5 мм, стебли - не более 3 мм, плоды и семена - не более 0,5 мм. Размер частиц измельченности сырья играет важную роль для интенсификации процесса экстрагирования. Проведено изучение степени измельчения сырья. Содержание экстрактивных веществ определяли по методике ГФ XI издания (табл. 21).
Разработка показателей качества травы астрагала перепончатого изучалась на пяти экспериментальных сериях. Для характеристики травы астрагала предложены следующие показатели: описание внешнего вида, подлинность, числовые показатели. Данные показатели качества регламентируются проектом ФСП на траву астрагала (Приложение 2).
Нами проведено изучение стабильности пяти серий травы астрагала, хранящихся в естественных условиях. При хранении в обычных условиях показатели качества: определялись через каждые шесть месяцев. При хранении в естественных условиях установлен срок годности для травы астрагала - 2 года. Результаты представлены в таблице 3.4.1. (Приложение 3). Выводы к главе 3 1. Определены числовые показатели травы астрагала перепончатого: экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 35 %; влажность - не более 10 %, золы общей не более 8 %; золы нерастворимой в 10 % HCI - не более 2 %; органической примеси — не более 1,5 %, минеральной примеси — не более 0,5 %; пожелтевших и побуревших примесей не более 2 %. Установленные числовые показатели и реакции подлинности легли в основу проекта Фармакопейной статьи предприятия на траву астрагала перепончатого. 2. Разработана методика стандартизации травы астрагала перепончатого методом дифференциальной спектрофотометрии. Относительная ошибка определения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не превышает ± 5 %. 3. При изучении оптимальных условий получения водного извлечения из травы астрагала перепончатого определено, что способ получения водного извлечения в виде отвара с учетом коэффициента водопоглощения 1:6, степени измельчения сырья — 1 мм, гидромодуля 1:20 наиболее эффективен.
