Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Лихорадка Западного Нила: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики 11
1.2. Применение иммуномагнитных сорбентов при санитарно-эпидемиологическом мониторинге патогенов во внешней среде 27
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Материалы, взятые в работу 35
2.1.1 Клинический и полевой материал 35
2.1.2. Биологическое сырье 35
2.1.3. Диагностические тест-системы, использованные при проведении лабораторных исследований 35
2.1.4. Оборудование и аппаратура (основные) 37
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Эпидемиологический анализ заболеваемости 39
2.2.2. Места сбора полевого материала 39
2.2.3. Сбор и хранение полевого материала 39
2.2.4. Подготовка проб полевого материала к исследованию 40
2.3. Выявление РНК вируса ЛЗН методом ОТ-ПЦР . 41
2.4. Методы выделения иммуноглобулинов 42
2.5. Получение иммунопероксидазного конъюгата... 43
2.6. Физико-химические методы 43
2.7. Лиофилизация биологического материала 44
2.8. Методы математической и статистическо обработки полученных результатов 44
Глава 3. Основные эпидемиологические особенности лихорадки западного Нила на территории юга российской федерации 46
3.1. Условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила 46
3.2. Результаты исследования полевого материала на ЛЗН, собранного на территории Юга России 58
3.3. Эпидемическая обстановка по заболеваемости лихорадкой Западного Нила на Юге России 60
Глава 4. Совершенствование мониторинга за лихорадкой западного Нила на примере ставропольского края 67
4.1. Исследование клинического и полевого материала в ИФА и ПЦР, собранного на территории Ставропольского края 67
4.2. Разработка иммуномагнитного сорбента для мониторинга вируса лихорадки Западного Нила в объектах внешней среды в ИФА и ОТ-ПЦР 88
4.2.1. Получение иммуномагнитного сорбента 88
4.2.2. Изучение эффективности применения иммуно-магнитной сепарации при исследовании объектов внешней среды на наличии вируса лихорадки Западного Нила в ИФАи ПЦР 92
Заключение 106
Выводы 119
Список литературы 121
Приложение 156
- Применение иммуномагнитных сорбентов при санитарно-эпидемиологическом мониторинге патогенов во внешней среде
- Диагностические тест-системы, использованные при проведении лабораторных исследований
- Результаты исследования полевого материала на ЛЗН, собранного на территории Юга России
- Разработка иммуномагнитного сорбента для мониторинга вируса лихорадки Западного Нила в объектах внешней среды в ИФА и ОТ-ПЦР
Введение к работе
Актуальность темы. В современном мире неуклонно растет понимание высокой социально-экономической значимости широкого распространения различных инфекционных болезней. Особенностью современной эпидемиологической обстановки является не только активизация многих инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д и соавт., 2006; Локтев В.Б., 2007; Кутырев В.В., 2008: Львов Д.К., Савченко СТ., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Жаркенов А.Ф. и соавт., 2009; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009).
Проблема лихорадки Западного Нила (ЛЗН) в настоящее время остается актуальной в связи с постоянным расширением ареала этой инфекции. Крупные вспышки ЛЗН (Онищенко Г.Г., 2000, 2001; Бутенко A.M., 2007; Львов Д.К., Савченко СТ., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Платонов А.Е., Карань Л.С., Гаранина СБ. и соавт., 2009), тяжелое течение болезни с преобладанием серозных менингитов, документированная передача вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) при переливании крови являются новыми фактами в изучении этой актуальной арбовирусной инфекции. Вспышки и эпидемии ЛЗН и даже единичные случаи рассматриваются в Международных медико-санитарных правилах ВОЗ (2005) как чрезвычайная ситуация здравоохранения международного масштаба. Сезонные миграции птиц способствуют трансконтинентальному переносу ВЛЗН (Львов Д.К.,2002; Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и соавт., 2002; Забашта М.В., Москвитина Э.А., За-башта А.В., 2006 и др.).
Не возникает сомнений в том, что территория Юга России является эндемичной по широкому спектру природно-очаговых инфекций бактериальной и вирусной природы, требующих особого внимания в силу того, что этиологические агенты большинства из них относятся к возбудителям I-II групп патогенности, а обострение обстановки по некоторым из них может привести к чрезвычайной эпидемической ситуации международного значения (Малецкая О.В., Грижебовский Г.М., Бейер А.П. и соавт., 2009).
Ставропольский край (СК) в силу своего географического положения и природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большое количество перелетных птиц и др.) представляет большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса ЛЗН и его роли в патологии человека. Такие исследования на территории Ставропольского края ранее не проводились.
Сложившаяся ситуация диктует необходимость широкомасштабного реального мониторинга вируса ЛЗН в антропогенных и природных биоценозах с привлечением современных методов экспресс-диагностики. Мониторинг инфекционных болезней является одной из наиболее важных составляющих комплекса мер по предотвращению и борьбе с эпидемиями (Они-щенко Г.Г., 2006). Один из блоков мониторинга - сбор, доставка и лабораторное исследование полевого материала — необходим как для прямого обнаружения компонентов возбудителя (антигенов или фрагментов генома), так и для последующей изоляции и идентификации инфекционного агента. Однако часто низкие концентрации возбудителя инфекции и его компонентов в полевом материале, а также огромное количество примесей не позволяют обнаруживать антигены вирусов и бактерий или их генетический материал непосредственно в исследуемых пробах. Разработка высокоэффективных способов концентрирования патогенов с последующей детекцией их антигенов или нуклеиновых кислот, либо их селективной сепарацией для бактериологических или вирусологических исследований - одно из приоритетных направлений совершенствования их лабораторной диагностики (Ефременко В.И., Василенко Н.Ф., Жарникова И.В. и соавт., 2009).
Актуальность проблем, изложенных выше, послужила основанием для проведения данной работы.
Цель исследования: совершенствование эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила и методов выявления её возбудителя. Для достижения цели были определены основные задачи:
Изучить на примере Ставропольского края условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.
Провести анализ результатов эпизоотологического обследования и заболеваемости ЛЗН на территории Юга РФ.
Провести обследование территорииСтавропольского края на наличие переносчиков и резервуаров вируса ЛЗН.
Изучить иммунную прослойку выборочных групп здорового населения, проживающих в Ставропольском крае, и провести исследования сывороток крови больных с лихорадкой неизвестной этиологии на наличие специфических антител к вирусу ЛЗН.
Усовершенствовать методы изучения распространения возбудителя лихорадки Западного Нила за счет использования иммуномагнитной сепарации при эпидемиологическом мониторинге вируса ЛЗН в объектах окружающей среды.
Научная новизна.
Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды выявлено наличие вируса ЛЗН и установлены его основные переносчики - комары рода Aedes.
Впервые установлена инфицированность ВЛЗН клещей Н. marginatum, что указывает на возможность их вовлечения в паразитарные системы природных очагов ЛЗН на территории Ставропольского края.
Изучены показатели гуморального иммунитета больных с лихорадками неясной этиологии и здоровых людей (доноров крови) и установлено наличие антител класса IgG к вирусу ЛЗН в обеих группах, что свидетельствует об инфицировании этим вирусом населения
Ставропольского края и является дополнительным критерием в оценке эпидемической значимости природных очагов этой инфекции.
Впервые использованная иммуномагнитная сепарация при исследовании полевого материала методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразнои цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) повысила их эффективность и увеличила число положительных находок в 2 - 3 раза, что позволяет более достоверно оценивать эпидемиологический потенциал территорий.
Получены данные о достаточно высоком эпидемиологическом потенциале природных очагов ЛЗН на территории Юга Российской Федерации, выражающиеся в ежегодной регистрации случаев заболеваний людей и зараженности комаров и клещей ВЛЗН. Практическая значимость.
Установление факта циркуляции возбудителя ЛЗН на территории Ставропольского края является предпосылкой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛЗН. Применение иммуномагнитнои сепарации в сочетании с методами лабораторной экспресс-диагностики (ИФА и ОТ-ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, повышая возможность выявления возбудителя в 3 - 3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов при проведении анализов.
По результатам выполненных исследований получено 2 патента РФ: «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)», № 2290641, Бюл. № 36 от 27.12. 2006 г.; «Способ получения иммуносорбента», № 2363732, Бюл. № 22 от 10.08. 2009 г.
Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ ( протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.2005 г.), «Применение органокремнеземно-го аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 2 от 28 февраля 2007 г.); «Исследование полевого материала на наличие арбовирусов методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 8 от 09.07.2009 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
Территория Юга Российской Федерации характеризуется наличием природных очагов ЛЗН с высоким эпидемическим поіенциалом, при этом основным резервуаром и переносчиком вируса являются комары рода Culex, Anopheles, Aecles, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh. rossicus.
Установленная зараженность вирусом ЛЗН комаров рода Aedes, иксодовых клещей Hyalomma marginatum, синантропных врановых, обнаружение специфических антител к В ЛЗН в сыворотках крови людей с лихорадками неизвестной этиологии и у доноров крови свидетельствуют о циркуляции данного вируса на территории Ставропольского края.
Применение иммуномагнитной сепарации позволяет максимально сконцентрировать ВЛЗН в исследуемом материале, что увеличивает чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными ИФА и ПЦР. Разработанные сочетанные методы МИС + ИФА и МИС + ПЦР могут использоваться при проведении мониторинга за ЛЗН.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 2006); второго съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2006); расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург,2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (Оболенск, 2009).
Апробация диссертации состоялась 6 августа 2009 г. на межлабораторной конференции ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.
Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жарни-ковой И.В., к.б.н. Орловой Т.Н., д.х.н. Брыкаловым А.В.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 4 работы - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 161 листе и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 19 таблицами. Список использованной литературы включает 279 источников, из них 209 отечественных и 70 - зарубежных авторов.
Применение иммуномагнитных сорбентов при санитарно-эпидемиологическом мониторинге патогенов во внешней среде
В течение последних десятилетий для избирательного концентрирования и обнаружения антигенного материала, в том числе бактериальных клеток, вирусов, ферментов, нашли применение различные иммуносорбцион-ные методы. При этом широко используется в медико-биологических исследованиях для идентификации специфических антигенов, разделения гвердой и жидкой фаз, очистки и концентрации суспензий и биологических материалов метод иммуномагнитной сепарации (Smith К.О., Gehl W.D., 1977; Lea Т., Vaitdal F., Davies С. et al., 1985; Kemshed J.T., Ugelstad J., 1985; Haukanes B.L., Kvam C, 1993; Muir P.F., Nichdson F., Jhetam M. et al., 1993; Olsvik O., Popovic Т., Skjerve E. et al., 1994; Grinde В., Jonanssen Т.О., Ushijima H., 1995; Mc Cuin R.M., Bukhari Z., Sobrinho J. et al., 2001).
Этот метод впервые был предложен P.J. Robinson, J.С. Wheatley, J.С. Janson et al. (1974), при этом носители на основе целлюлозы, оксида кремния и оксида железа использовались для распознавания и иммобилизации химотрипсина и бета-галактозидазы.
Связывание целевых молекул с поверхностью магнитных микрочастиц происходит по принципам аффинного, гидрофильного или иных типов взаимодействия, аналогично принципам хроматографии (Magnani М., Galluzzi L., Bruce I.J., 2006).
В качестве твердофазной матрицы в системах иммуномагнитной сепарации используют микрочастицы размером от 50 нм до 1 мкм, при этом размер частиц является важным фактором, влияющим на кинетику реакции сепарации (Gijs М.А., 2007). Сорбенты чаще всего изготавливают из оксида кремния, агарозы, полистирола, поливинила либо других полимерных материалов с применением оксидов железа, обычно Fe203 или Fe304, причем магнитный компонент обычно заключен внутрь микрочастиц. Оксиды железа обусловливают суперпарамагнетизм частиц, т.е. их способность намагничиваться под действием постоянного магнитного поля, быстро и полностью размагничиваться вне его (Bangs L.B., 1996; Peruski А.Н., Peruski L.F., 2003). За счет этого микрочастицы не «склеиваются» в суспензии, что обеспечивает наиболее эффективное узнавание целевого антигена в исходном образце и значительно облегчает дальнейшие диагностические манипуляции после выделения антигена и прекращения действия магнитного поля.
Выделение антигена (бактерий, вирусных частиц и т.д.) из системы осуществляется путем помещения образца с магнитным иммуносорбентом в постоянное магнитное поле. При этом суперпарамагнитные частицы намагничиваются и могут быть сконцентрированы и извлечены из исследуемой пробы в ручном, полуавтоматическом, автоматическом режимах с применением технических устройств (Olsvik О., Popovic Т., Skjerve Е. et al., 1994) (рисунок 3).
Специфичность распознавания и связывания целевых молекул, присутствующих в исследуемой пробе, зависит главным образом от размера частиц сорбента, материала, из которого они изготовлены, и от класса лигандов, связанных с поверхностью магнитных микрочастиц. В медико-биологических исследованиях и лабораторной диагностике чаще всего применяются модифицированные магнитные носители. Для модификации поверхности микрочастиц применяют различные типы лигандов, главным образом моноклональные или поликлональные антитела или их фрагменты, ферменты, иные белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, а также маркерные белки (стрептавидин и др.). Для надежного связывания лигандов с поверхностью сорбента и последующего формирования ковалентных связей между лигандом и целевой молекулой в поверхностный слой микрочастиц сорбента включают карбоксильные, амино- и другие группы, которые активируются в присутствии специфических реагентов (Olsvik О., Popovic Т., Skjerve Е. et al., 1994; Alexiou С, Jurgons R., Seliger С. et al, 2006; Magnani M., Galluzzi L. Bruce I. J., 2006). Сочетание различных типов частиц с их поверхностными группами и типами лигандов представляет собой весьма гибкую методоло гию, позволяющую в конечном итоге создать универсальный инструмент для идентификации практически любых целевых молекул.
В настоящее время принципы иммуномагнитной сепарации широко используются в практической медицине, прежде всего в лабораторной диагностике инфекций, санитарно-эпидемиологическом контроле воды, пищевых продуктах и окружающей среды, а также в клинической диагностике (Alexiou С, Jurgons R., Seliger С. et al., 2004; Brzeska M., Panhorst M., Kamp P.B. et al., 2004; Shinkai M, Ito A., 2004).
Применение иммуномагнитной сепарации проб внешней среды для выявления патогенных микроорганизмов в настоящее время получило широкое распространение и доказало свою эффективность (Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М. и соавт., 1989, 1990, 1991; Ефременко В.И., 1988; Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н. и соавт., 1989; Ефременко В.И., Шаппо С.А., Нарбутович Н.И. и соавт., 1990; Ефременко В.И., Тюменцева И.С, 1995; Масленникова В.Н., Нарбутович Н.И., 1992; Тюменцева И.С, 1996; Dodin A., Goud В., 1989), в прямом и непрямом иммунофлуоресцент-ном (Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., 1986; Подзолкова Г.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и соавт., 1988; Владимцева Е.В., Храпова Н.П., Ефременко В .И. с соавт., 1990; Ефременко В.И., Тюменцева И.С, 1995а) и иммунофер-ментном анализах (Дзантиев Б.Б., Егоров A.M., 1982; Трофимов Е.Н., Васильев В.П., 1986; Ефременко В.И., 1988; Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н. и соавт., 1989; Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов И.Н. и соавт., 1993; 1994).
Основными преимуществами данной методологии является значительное повышение чувствительности традиционных лабораторных методов, особенно при исследовании загрязненных различными ингибиторами и кон-таминированных посторонней микрофлорой проб значительного объема. Иммуномагнитная сепарация позволяет одновременно сконцентрировать пробу и очистить её от примеси, подготавливая таким образом к дальнейшим бактериологическим, серологическим, иммунологическим или молекулярным исследованиям ( Ефременко В.И., 1996; Тюменцева И.С, 1996; Жарни-кова И.В., 2004; Olsvik О., Popovic Т., Skjerve Е., et al., 1994; Chan СР., Cheung Y.C., Renneberg R. et al., 2008).
Диагностические тест-системы, использованные при проведении лабораторных исследований
При выполнении работы использован клинический и полевой материал, собранный нами на 23 из 26 административных территориях Ставропольского края и в краевом центре - г. Ставрополе: 268 сывороток крови лихорадящих больных и 1302 сыворотки крови доноров; 8626 объектов внешней среды, в том числе 3573 имаго орнитофильных комаров (230 пулов) родов Culex, Aedes, Anopheles, Coquillettidia; 4853 особи иксодовых клещей (454 пула) - Нуа/отта marginatum, Dermacenter marginatus, Ixodes ricinus, Rhipice-phalus rossicus, Boophilus annulatus и 61 особь аргасовых клещей Argas persi-cus (2 пула); 139 проб головного мозга птиц и грызунов.
Антиген вируса Западного Нила, мышиная иммунная асцитическая жидкость к вирусу ЛЗН с высоким титром специфических антител класса G получены в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Тест-система иммуноферментная для индикации антигена вируса Западного Нила, изготовленная в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; Тест-система иммунофермептная для выявления антигена вируса лихорадки Западного Нила производства ЗАО «ЭКО-лаб» (г. Электрогорск, Московской обл.); Набор реагентов для выявления антигенов вируса Западного Нила «ЗН-антиген» производства ЗАО «Биосервис» (г. Боровск, Калужской обл.); Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgM к вирусу лихорадки Западного Нила производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск, Московской обл.); Тест-система иммуноферментная «ВектоНил - IgG» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.); Тест система иммуноферментная для выявления индекса авидно-сти иммуноглобулинов класса G к вирусу лихорадки Западного Нила «ВектоНил - IgG - авидность» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.); Тест-система для выявления РНК вируса лихорадки Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции ГенНил, изготовленная в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов); Набор реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.);
Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-IgG» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.). При выполнении экспериментальных работ использовано следующее оборудование и аппаратура: - рН-метр милливольтметр рН-150 МА (завод измерительных приборов, г. Гомель, Белоруссия); - мешалка магнитная ММ-5 (завод комплектных лабораторий, г. Мука-чево, Украина); - термостат электрический суховоздушный ТС-80м (Одесское ПО лабораторной медицинской техники «Медлаборатортехника», Украина); - морозильная камера «Elcold» (Дания); - холодильник бытовой на 2-8 С (Московское ПО ЗИЛ); - весы технические ВСМ-20 (г. Нижний Тагил); - весы электронные «Sartorius» (Германия); - центрифуга лабораторная К-24 (Германия); - спектрофотомер СФ-46 (ЛОМО, г. Санкт-Петербург); - спектрофотометр «Specord» 751IR (Чехословакия); - хроматографическая система LKB-2137 (Швеция); - камера лиофильного высушивания TG-5 (Германия); - баня водяная лабораторная (инактиватор) (Львовский завод радиоэлектронной медицинской аппаратуры, Украина); - прибор для встряхивания и инкубирования планшет Thermoshaker ST (Литва); - регистрирующий спектрофотометр Multiskan (LKB, Швеция); - устройство для промывания микропланшет PW 40 («BIO-RAD, г. Москва); - рентгенодифрактометр «Дифрей» (г. Санкт-Петербург); - установка для ртутной порометрии AYTO PORE 9200; - электронный микроскоп 1MZ3000 (Япония); - бокс биологической безопасности II класса биозащиты; - ламинарный шкаф для проведения обратной транскрипции и амплификации; - термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25 - 100 С («Биоком», Россия); - микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16000 g («Elmi», Латвия); - центрифуга - вортекс (« Биоком», Россия); - вакуумный отсасыватель медицинский с колбой — ловушкой для удаления надосадочной жидкости (ОМ-1, г. Ульяновск, Россия); - отдельные наборы автоматических пипеток переменного объема для каждого этапа ПЦР («Ленпипет», Россия); - полипропиленовые пробирки, 1,5 мл (Eppendorf Safe - Lock tubes, «Sigma»,CIIlA; - амплификатор «Mastercycler 22331» («Eppendorf», Germany); - камера для горизонтального электрофореза Sunrise (Life Technologies - Gibco BRL Horizontal Gel Elecrophoresis Apparatus, USA); - ультрафиолетовый трансиллюминатор TFX-20 (Life Technologies -Gibco BRL UV Transilluminator, USA); - система регистрации изображений в геле Kodak Digital Sciense EDAS 120 System (Eastman Kodak, USA); - магнитный сепаратор Dyna Mag - Spin («nitrogen Dynal AS», Норвегия).
Результаты исследования полевого материала на ЛЗН, собранного на территории Юга России
Используя результаты исследований методом ИФА кровососущих членистоногих, мелких млекопитающих и птиц на наличие антигена вируса ЛЗН, осуществленных Территориальными управлениями Роспотребнадзора субъектов Юга России, нами проведен комплексный анализ этих данных с целью оценки эпидемиологической напряженности природных очагов ЛЗН на Юге РФ, а также для уточнения видового состава основных переносчиков и носителей В ЛЗН, их распространения и территориальной приуроченности.
В период с 2001 по 2006 гг. на территории Юга РФ методом иммунофер-ментного анализа было исследовано 16111 проб, в том числе 3230 проб, полученных от птиц (20,0 %), 2341 проба органов грызунов (14,5 %), 2675 проб комаров (16,6 %) и 7865 проб клещей (48,8 %). При этом общее количество положительных проб равнялось 295 (1,8 %). В целом на Юге РФ у грызунов антиген вируса ЛЗН выявлен в 1,0 % проб, среди птиц положительные пробы составили 1,8 %, у клещей ВЛЗН обнаружен в 1,9 % случаев; наибольший процент заражения вирусом ЛЗН отмечен у комаров (2,2 %). Данные представлены в таблице 2. При этом наибольшее количество положительных проб выявлено в Республи ке Калмыкия: 35 из 503 исследованных проб от птиц (7,0 %), 9 из 217 исследованных проб комаров (4,1 %) и 129 из 3850 исследованных проб клещей (3,4 %).
В таблице 3 представлены результаты исследования проб полевого материала в 2007-2008 гг., предоставленные Управлением Роспотребнадзора по Волгоградской области.
Анализ лабораторных данных показал, что основными переносчиками ВЛЗН являются комары родов Aedes, Anopheles, Culex и иксодовые клещи Н. marginatum и Rhipicephalus rossicus, при этом циркуляция вируса ЛЗН имеет выраженную сезонность, совпадающую с пиками активности основных преносчи-ков.
Как показал анализ, в Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания и Адыгея при исследовании объектов внешней среды антиген вируса ЛЗН не выявлен.
За период с 2001 г. по 2006 г. ЛЗН зарегистрирована в трех из 13 субъектов Южного федерального округа: в Астраханской, Ростовской и Волгоградской областях (рисунок 6). За эти шесть лет заболели лихорадкой Западного Нила 293 человека. Наибольшая эпидемическая активность отмечалась в Астраханской области, где за указанные годы выявлены 205 больных, что составило 69,9 % от числа всех больных, зарегистрированных в ЮФО. В Ростовской области число заболевших ЛЗН составило 43 (14,7 %), в Волгоградской области - 45 (15,4 %) (рисунок 7).
В 2006 г. эпидемическая обстановка по ЛЗН изменилась: в ЮФО РФ зарегистрированы 39 больных в трех субъектах, что на 42,4 % меньше по сравнению с 2005 г. (92 больных). При этом резко снизилась заболеваемость в Астраханской области (в 5,2 раза), незначительно - в Ростовской области (в 1,2 раза).
В Астраханской области выявлены 14 больных в трех районах: Икрянин-ском - 1, Камызякском - 1, Приволжском - 1 и в г. Астрахани — 11. Один случай заболевания ЛЗН закончился смертельным исходом (7,1 %). В Ростовской области зарегистрированы 13 больных в двух районах (Азовском - 1, Сальском - 1) и в трех городах (Ростове-на-Дону - 7, Каменск-Шахтинском - 1, Сальске - 3). В Волгоградской области заболеваемость возросла в 4 раза, всего отмечено 12 больных в г. Волгограде. В 2007 г. заболеваемость в этом регионе повысилась в 5,3 раза, а в 2008 г. снизилась в 31, 5 раза. У всех больных диагноз в 100 % случаев подтвержден лабораторно.
В 2006 г. отмечалось раннее начало эпидемического процесса в Ростовской области, где первый больной был выявлен в мае. В июне больных зарегист рировано не было во всех трех субъектах. В июле один больной был отмечен в Астраханской области. В августе и сентябре больные регистрировались во всех трех субъектах. Пик заболеваемости в 2006 г. в Астраханской и Волгоградской областях пришелся на сентябрь, а в Ростовской области - на август. В целом по ЮФО число заболевших в 2006 г. в августе и сентябре было почти одинаковым (18 и 19 больных соответственно), в отличие от 2005 г., когда число заболевших в августе было в 1,9 раза выше, чем в сентябре. Показатель заболеваемости на 100 тыс. населения в 2006 г. наиболее высоким был в Астраханской области и составлял 0,9; в Волгоградской области - 0,3; наиболее низким он был в Ростовской области - 0,07.
Большинство больных (92,3 %), по данным 2006 г., в анамнезе отмечали укусы комарами во время пребывания на дачных участках (23,1 %), на природе (33,3 %), по месту жительства (35,9 %). У 7,7 % больных условия заражения не определены (таблица 4). В 79,5 % случаев заболевания ЛЗН установлен трансмиссивный механизм передачи инфекции, в 20,5 % случаев механизм заражения не установлен.
Разработка иммуномагнитного сорбента для мониторинга вируса лихорадки Западного Нила в объектах внешней среды в ИФА и ОТ-ПЦР
В последние годы арсенал лабораторных методов исследования обогатился новыми методами, в которых используются новейшие достижения биотехнологии, одним из которых является разработка и внедрение твердофазных носителей, в том числе различных сорбентов. Приобретение последними биоспецифических качеств достигается путем иммобилизации на поверхности или в структуре матрицы различных лигандов белковой природы. Новый этап усовершенствования матриц связан с включением в них магнитного материала (Ефременко В.И., 1996; Тюменцева И.С., 1996; Афанасьев Е.Н., 2000; Василенко Н.Ф., 2004; Жарникова И.В., 2004).
Цель данного раздела работы заключалась в получении иммуномагнит-ного сорбента на основе прочной, технологичной матрицы, легко поддающейся модифицированию, обладающей высокой специфичностью и минимальной неспецифической сорбцией, для выявления вируса ЛЗН в иммуно-ферментном анализе и полимеразной цепной реакции с его предварительной селективной иммуномагнитной сепарацией из объектов внешней среды.
В качестве основного структурного компонента, формирующего остов композиционного сорбционного материала, впервые использован природный алюмосиликат из Астраханского месторождения, представляющий собой продукт, содержащий в своем составе, по данным проведенного нами химического анализа, двуокись кремния (массовая доля) - 78%, насыпная плот-ность - 320 кг/м ; влажность при температуре НОС (массовая доля) - 2,7%; влагоемкость - 71%. Кроме того, в его состав входят: А1203 - 21%; Fe203 — 0,8%; магний - 44 мг/кг; марганец - 9,4 мг/кг; медь - 6,5 мг/кг; цинк - 10 мг/кг; кобальт - 0,4 мг/кг; кальций - 0,9 мг/кг.
Химическое модифицирование сорбента осуществляли в присутствии карбоксиметилированного лигнина и карбодиимида (1-Циклогексил-3(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидметил-п-толуолсульфонат). В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (Fe304). При обработке носителя органическим полимером - карбоксиметилированным лигнином, содержащим карбоксильные группы, происходит активирование его поверхности. При последующем модифицировании сорбента 1-Циклогексил-3(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидметил-п-толуолсульфонат (CMC) полученный продукт активируется функциональными группами, способными к взаимодействию с лигандами белковой природы (Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. и соавт., 1991).
Процесс изготовления магнитного иммуносорбента можно разделить на две основные стадии: 1 стадия - получение магносорбента (МС); 2 стадия -получение магноиммуносорбента (МИС).
Получение МС осуществляли следующим образом: к 1,5 г алюмосиликата добавляли 100 мл 1 % водного раствора карбоксиметилированного лигнина и далее 1 г магнетита. Смесь выдерживали 2 ч при температуре (22 ± 2) С. Значение рН гелеобразования составляло 7,0. Полученный продукт высушивали при 100-115 С в течение 30 мин, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 микрон. К сорбенту в последующем добавляли 9 мл ацетатного буфера (рН 4,0), содержащего 40 мг кар-бодиимида, смесь инкубировали 1 ч. Затем сорбент тщательно отмывали ацетатным буфером и дистиллированной водой.
Алюмосиликатный МС представляет собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации (рисунок 10).
Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента на поверхность МС иммобилизовали специфический белковый лиганд, которым служили иммуноглобулины класса G (IgG), выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из мышиной иммунной асцитической жидкости против вируса ЛЗН. Иммобилизацию лиганда проводили следующим образом: к 0,4 мл 10 % взвеси МС добавляли 1 мл IgG с концентрацией белка 2,0 мг/мл, инкубировали 2 ч при значении рН раствора 6,0 - 7,0 и температуре от 22 до 37 С.
Изготовленный магноиммуносорбент имел следующие характеристики: у образцов МИС наблюдалась ярко выраженная губчатая, пористая микроструктура с участками аморфной массы (рисунок 11), удельная поверхность сорбента -63,0 ± 0,84 м2/г, объем пор - 1,23 ± 0,009 см /г, радиус пор -29,7 ± 0,29 нм.
