Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Литературный обзор 10
1.1 Классификация гемоцитов 10
1.2 Роль гемоцитов в иммунном ответе насекомых 15
1.2.1 Фагоцитоз 15
1.2.2 Гранулообразование и капсулообразование 18
1.3 Гуморальный иммунитет 22
1.3.1 Агглютинирующая система 22
1.3.2 Коагуляция 27
1.3.3 Фенолоксидазная система 29
1.4 Генерация активированных кислородных метаболитов у насекомых 37
1.5 Влияние паразитической инвазии на иммунный 'о'т-вет насекомых 42
1. 6 Заключение 47
Глава 2 Материалы и методы 52
2.1 Насекомые 52
2.2 Паразитологический анализ 52
2.3 Сбор гемолимфы и получение суспензии гемоцитов 5-3
2.4 Идентификация типов гемоцитов при помощи световой микроскопии 53
2.5 Идентификация гемоцитов с помощью хлортетра-циклина 54
2.6 Флуорохромирование растительных лектинов и использование их в идентификации гемоцитов 55
2 7 Определение агглютинирующей активности гемолимфы 55
2.8 Получение фракций гемолимфы с агглютинирующей активностью 56
2.9 Получение поликлоыальной антисыворотки к агглютининам гемолимфы 56
2.10 Выявление агглютининов в гемоцитах 57
2.11 Электронная микроскопия гемоцитов 57
2.12 Выделение бактерий из гемоцитов 58
2.13 Аффинная хроматография 58
2.14 Электрофоретическое разделение белков 5 9
2.15 Электрофоретический перенос в сочетании с иммунноферментным анализом 5 9
2.16 Инъецирование стрекоз бактериальными клетками и суспензией сефадекса 60
2.17 Инъецирование стрекоз цистами трематод 61
2.18 Регистрация фенолоксидаз в клетках крови 61
2.19 Регистрация активированных кислородных метаболитов в клетках крови 62
Глава 3 Результаты 63
3 .1 Морфофункциональная дифференциация гемоцитов
З .2 Агглютинины
3.3 Паразиты личинок стрекоз рода Ае
3.3.1 Бактериальные инфекции
3.3.2 Микроспоридии
3.3.3 Трематоды 3 аключ ение Выводы
Список литературы
- Роль гемоцитов в иммунном ответе насекомых
- Генерация активированных кислородных метаболитов у насекомых
- Идентификация типов гемоцитов при помощи световой микроскопии
- Флуорохромирование растительных лектинов и использование их в идентификации гемоцитов
Введение к работе
Стрекозы являются древнейшими представителями в классе насекомых, широко распространенные во всем мире. К настоящему времени существует большое количество работ по морфологии, систематике и экологии стрекоз, но по изучению иммунного ответа, в частности клеточного, имеются единичные работы. Как известно, личиночная стадия - наиболее длительный период развития стрекоз. Именно в этот период происходит проникание различных паразитов в организм стрекоз. Многие паразиты используют личинок стрекоз как промежуточных хозяев. В связи с этим гибель стрекоз может привести к элиминации паразитов из ценозов. Для сохранения в промежуточном хозяине, паразиту необходимо с одной стороны избежать воздействия иммунной системы, с другой - предотвратить вторичные инфекции.
Проникновение чужеродного объекта приводит к активации и взаимодействию всех систем врожденного иммунитета . В большинстве случаев активация одного из звеньев иммунного ответа, инициирует ряд защитных реакций, направленных на уничтожение или изоляцию инородного тела . Клетки гемолимфы первыми взаимодействуют с проникшим в гемоцель инородным объектом. Образование капсул или гранул вокруг паразита сопровождается синтезом меланина (Nappi et al., 1995; Lavine, Strand, 2002; Wilson et al., 2003). Процесс меланогенеза происходит при непосредственном участии ферментов фенолоксидаз и сопровождается образованием хинонов, семихинонов, а также активированных кислородных метаболитов (АКМ), в
частности, супероксиданиона и гидроксильного радикала (Nappi et al., 1995; Nappi, Ottaviani, 2000; Carton, Nappi, 2001; Kobayashi, 1998; Slepneva et al., 1999; Wilson et al. , 2001; Sugumaran, 2002).
В ходе сопряженной эволюции паразиты выработали множество защитных механизмов, способствующих избеганию или подавлению иммунных реакций хозяина (Сапрунов, 198 7; Vinson, 1990; Brehelin, 1990; Strand, Pech, 19 95; Hochuli et al. , 1999; Kinuthia et al. , 1999). Пассивная защита паразита от иммунных реакций хозяина (так называемая молекулярная мимикрия), возможна в том случае, если его поверхностная структура не воспринимается как чужеродный объект. Такого рода взаимодействие становится возможным в случае секреции на поверхность паразита защитных компонентов (гликопротеины, гликолипи-ды, протеогликаны и т. д. ), маркирующих поверхностный слой паразита как близкородственный иммунным составляющим организма хозяина. В некоторых случаях, возможно избирательное поглощение и встраивание паразитом молекул хозяина в собственный поверхностный слой, и в дальнейшем воспринимаемых иммунной системой насекомого как компоненты собственного организма (Сапрунов, 1987; Vinson, 1990; Brehelin, 1990; Beckage, 1993; Kinuthia et al., 1998; Hu et al., 2003). Избегание воздействия иммунной системы хозяина возможно также при развитии в органах или тканях, в которых паразиты защищены от иммунного распознавания (жировое тело, слюнные железы, эпителиальные клетки кишечника) (Strand, Pech, 1995; Исси, 1986). Часто паразиты активно воздействуют на
иммунитет насекомого, подавляя или частично блокируя его. В частности, может ингибироваться активность клеточного иммунного ответа, а также профенолоксидазный каскад (Vinson, 1990; Brehelin,1990; Lavine, Beckage, 1995; Kinuthia et al. , 1999; Shelby et al. , 2000; Bell et al. , 2003) .
Все вышеизложенное определило цель настоящей работы: изучение влияния паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeshna (отряд Odonata).
Соответственно, были поставлены следующие задачи:
Идентификация гемоцитов исследуемых насекомых с использованием морфологических и цитохимических критериев .
Изучение агглютининов гемолимфы личинок стрекоз рода Aeshna и выявление гемоцитов, участвующих в синтезе агглютининов.
3. Изучение паразитофауны личинок стрекоз рода
Aeshna Новосибирской области.
4. Изучение влияния паразитической инвазии на фор
мирование клеточного иммунного ответа личинок стрекоз
при моделировании вторичной инфекции.
Научная новизна: Впервые был изучен и описан типовой состав гемоцитов личинок стрекоз рода Aeshna. Помимо морфологических критериев в работе по идентификации клеток гемолимфы, были использованы цитохимические и иммунохимические маркеры, а также зонд на внутриклеточный кальций (хлортетрациклин). Впервые было изучено,
влияние трематод семейств Plagiorhidae и
Prosthogonimidae на клеточные иммунные реакции личинок стрекоз A. grandis, являющихся их промежуточными хозяевами . Были выделены агглютинины гемолимфы личинок стрекоз, а также зарегистрирована экспрессия лектиноподоб-ных белков в гемоцитах. Ранее подобного рода исследований на примере представителей отряда Odonata не проводилось .
Впервые были выделены бактерии персистирующие в гемолимфе и гемоцитах стрекоз. Данные бактерии при повышении температуры окружающей среды, способны вызывать гибель личинок стрекоз. Впервые было зарегистрировано паразитирование микроспоридий в жировом теле личинок стрекоз рода Aeshna, обитающих в водоемах России. Микроспоридии были отнесены к виду Systenosterma alba.
Научно-практическая значимость. Представленные результаты вносят вклад в дальнейшее понимание механизмов формирования иммунных реакций беспозвоночных при наличии паразитической инвазии. Были разработаны подходы для оценки состояния клеточного иммунитета личинок стрекоз при паразитической нагрузке. Представленные в работе результаты по эндоцитобионтам и паразитическим простейшим, вносят вклад в накопление данных о парази-тофауне стрекоз рода Aeshna. Основываясь на данных о возможном влиянии эндоцитобионтов на численность популяции стрекоз при изменении температуры окружающей среды, мы можем предположить, что данные микроорганизмы, могут выступать в роли одного из механизмов регуляции численности популяции.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий»
(Курган, март 1998),на конференции «Паразит в природных комплексах и рисковые ситуации» (Новосибирск, июнь 1998), на VI Европейском энтомологическом конгрессе
(Чехия, август 1998), на конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, декабрь 1998) .
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста; состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает 187 работ, из которых 156 на английском языке.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. В.В. Глупову за руководство научной работой, к.б.н. Л.И. Бурцевой за предоставленные штаммы Bacillus thuringiensis, к.б.н. В. П. Ходыреву за помощь при определении микробиологического материала, Н.И. Юрловой за помощь при определении паразитологического материала, к.б.н. Ю.Я. Соколовой за помощь при идентификации паразитологического материала и проведение электронной микроскопии, к.б.н. И.М. Дубовскому и к.б.н. В. В. Мартемьянову за помощь при проведении исследований, к.б.н. С.А. Бахвалову и к.б.н. М.Ф. Хвощевской за обсуждение рукописи и ценные критичкские замечания.
Роль гемоцитов в иммунном ответе насекомых
Фагоцитоз - первая защитная реакция организма, активизирующаяся в ответ на проникновение чужеродного тела . У насекомых в фагоцитозе могут участвовать ретику-лоэндотелиальные клетки органов гемопоэза, перикарди-альные клетки, два типа клеток лимфы (граиулоциты и плазматоциты) и некоторые клетки жирового тела (Ratcliffe et al, 1982; Ratcliffe, Rowley, 1979; Hoffmann et al, 1979; Han, Gupta, 1988; Soderhall, 1992) .
Процесс фагоцитоза, как у простейших, так и у высокоорганизованных животных, в частности - насекомых, развивается по единой схеме и может быть разделен на четыре стадии: 1. Хемотаксис и распознавание чужеродного материала 2. Контакт с инородным объектом . 3- Поглощение чужеродного материала и образование пищеварительной вакуоли (фагосомы) 4. Разрушение, либо изоляция инородного тела (Адо, 1961; Купер, 1981) .
Ранее полагали, что для инициации фагоцитоза достаточно случайных столкновений клеток крови с инородными телами (Salt, 1970). К настоящему времени, большинство авторов придерживается так называемой «зипер» модели, предполагающей активацию рецепторов на поверхности фагоцитирующей клетки (Swanson, Baer, 1995; Greenberg 1995). Данные рецепторы получили название паттерн-распознающие (PRRs) (Johansson, 1999; Lavine, Strand, 2002) . К семейству паттерн-распознающих рецепторов относят иммуноглобулин-подобные белки, интегрины, коллагены, пероксинектины и ламинины, агглютинины, а также белки образующие специфические связи с компонентами клеточных мембран патогенна (LPS-связывающие белки, (3-1,3 гликан связывающие белки и пр. ) (Johansson, 1999; Lavine, Strand, 2002,2003; Jiang et al, 2004). Активация фагоцитоза происходит при связывании PRRs гемоцитов с активирующими молекулами, к которым причисляют [3-1,3 гликан, липополисахариды и пептидогликаны, т.е. компонентами клеточных стенок бактерий или спор грибов (Ratcliffe, Rowley, 1979; Ratcliffe et al, 1982; Lackie, 1988; Ochiai, Ashida, 1988, 2000; Johansson, 19 99; Lavine, Strand, 2002; Kurata, 2004; Dziarski, 2 004; Jang et al., 2004). Часто паттерн-paспознающие белки связаны с системой активации профенолоксидазного каскада. Возможно, что фагоцитоз также активируется компонентами системы активации профенолоксидазной системы, в частности системой сериновых протеаз (Mohrig et al, 1986; Brookman et al, 1987; Soderhall, 1992; Gorman, Paskewitz, 2001; Jiang et al 2004). Фагоцитоз может идти по нескольким путям: 1) формирование пиноцитозных пузырьков при поглощении жидкостей или вирусов; 2) обволакивание частиц с помощью псевдоподий (зипер-модель); 3) наползание плазматической мембраны на инородное тело (триггер-модель) (Ratcliffe, Rowley, 1979; Swanson, Baer, 1995). После того как материал поглощен, вокруг него образуется первичная фагосома, которая продвигается внутрь клетки и взаимодействует с органеллами и лизосомами, образуя вторичную фагосому (Ratcliffe, Rowley, 1979). Во вторичной фагосоме поглощенный материал подвергается действию ряда гидролитических ферментов, в том числе таких как кислая фосфатаза, пероксидазы, эстеразы и. лизоцим (Ratcliffe, Rowley, 1979; Ratcliffe, 1985). До недавнего времени отрицалось участие активированных кислородных метаболитов (АКМ) в процессах фагоцитоза у беспозвоночных (Ratcliffe, Rowley, 1979). Тем не менее, последние исследования показали, что у ряда представителей отрядов Coleoptra, Lepidoptera и Odonatoptera клеточные иммунные реакции сопровождаются образованием АКМ, а также высокореактивных соединений азота, которые могут участвовать в разрушении инородного материала (Holmbland, Soderhall, 1999; Lavine, Strand, 2002). Кроме того, немаловажную роль в процессе фагоцитоза, выполняют составляющие фенолоксидазного каскада, в ча стыости промежуточные продукты образования меланина (хиноны) , обладающие токсическим действием. (Soderhall, 19 92; Ratcliffe, 1985; Lackie, 1988; Holmbland, Soderhall, 1999) .
Генерация активированных кислородных метаболитов у насекомых
Тем не менее, сам по себе анион-радикал не так опасен, как его производные- Так, присоединение протона Н+ к 02 приводит к образованию гидроперекисного аниона Н02 или Н2С 2 - Оба этих соединения высокореактивны и в первую очередь воздействуют на клеточную мембрану, нарушая ее проницаемость во многом за счет перекисного окисления липидов (Sohal et al., 1995; Nappi et al. , 1995; Kobayashi, 19 98; Aruoma, 1999; Holmblad, Soderhall, 1999; Nappi, 2000; Shacelfold et al. , 2000). Перекись является также источником гидроксильного радиол . Л------ кала ОН - одного из наиболее окислителей.
Образование ОН" происходит в большинстве случаев с участием металлов переменной валентности (реакция Фентона), у большинства насекомых это медь (Sohal et al., 1995; Nappi et al. , 1995; Aruoma, 1999; Whitten, Ratcllife, 1999). При наличии в среде О2 , возможно образование ОН - радикала по схеме Габера-Вейса: Н202+02- -» 02+0Н +0Н Скулачев, 19 97; Nappi et al., 1995, 2000; Зенков и др., 2001) При активации клеточного иммунитета возможно образование и других цитотоксических молекул, в частности -оксида азота (N0) (Зенков и др., 2001; Weiske, Weisner, 1999; Nappi et al. , 2000; Shacelfold et al. , 2 00 0) . Процесс синтеза NO и его возможное влияние на организм, хорошо изучен у позвоночных. В то же время существуют лишь единичные работы, посвященные данной проблеме на примере насекомых. Синтез N0 осуществляется при участии NO-синтаз, катализирующих окисление L-аргииина (Зенков и др., 2001; Weiske, Weisner, 1999; Nappi et al. , 2000) . Взаимодействуя с супероксиданио-ном, NO образует пероксинитрит (ONO0 ). Пероксинитрит, подобно гидроксил радикалу и перекиси водорода, легко проникает через мембраны клеток, повреждая белки, нуклеиновые кислоты, а также окисляет ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав биологических мембран (Зенков и др., 2 001; Kobayashi, 19 98; Aruoma, 1999; Weiske, Weisner, 1999; Shacelfold et al. , 2 0 00; Nappi et al. , 1995, 2000, 2000a) . Вероятно, что наряду с 02 и Н202 пероксинитрит выполняет важную роль в механизме цито-токсического воздействия у беспозвоночных (Weiske, Weisner, 1999; Nappi et al., 2000). Наиболее хорошо изучена роль АКМ в иммунных реакциях позвоночных, в то время как, у насекомых до последнего времени возможное участие кислородсодержащих метаболитов в иммунном ответе, практически не изучалось .
Процесс фагоцитоза в организме позвоночных животных, сопровождается резким увеличением потребления кислорода . Следовательно, возрастает и продукция кислородных метаболитов, обладающих цитотоксическим действием (Ма-янский и др., 1987; Меньшикова и др., 1997; Babior et al., 1973). В 1973 году Андерсон с сотр. показал, что в гемоцитах таракана Blaberus craniifer при фагоцитозе не происходит генерация кислородных метаболитов. Авторы предположили, что механизм воздействия фагоцита на бактериальную клетку у беспозвоночных носит принципиально иной характер (Anderson et al. , 1973). Позже супероксид-анион был зарегистрирован как в гемоцитах, так и в гемолимфе многих видов насекомых (Глупов и др. 19 97; Whitten, Ratcliffє, 1999; Whitten et al. , 2001; Wang et al., 2001) . Активация клеточного иммунного ответа насекомых, в частности фагоцитоза, капсуло- и гранулообразования, сопровождается синтезом АКМ и оксида азота. Продуцирование высокореакционных соединений кислорода при активации клеточного и гуморального иммунитета, а также в процессе меланогенеза, играет значительную роль при уничтожении и изоляции чужеродного объекта (Глупов и др., 2001; Nappi et al. , 1995, 2000, 2000а). Генерация высокореакционных соединений кислорода регистрируется в первую очередь в клетках иммунокомпетентного звена (PI,Gr), а также в клетках с высоким митотическим индексом (Pr) (Whitten, Ratcllife, 1999; Nappi et al. , 1995, 2000; Глупов, Бахвалов, 2 001). Супероксиданион и другие АКМ могут образовываться при взаимодействии с интермедиатами меланогенеза (Nappi et al., 2 0 00; Kobayashi, 1998; Slepneva et al., 1999; Nappi, Vass 1993). Образование супероксиданиона возможно при окислении семихинонов (QH ) и гидрохинонов (QH2) , в свою очередь, взаимодействие таковых с 02 и Н202, приводит к образованию гидроксильного радикала (Nappi et al. , 1995; Sohal et al., 1995; Carton, Nappi, 1997). Образование гидроксильного радикала и супероксиданиона можно представить следующими реакциями
Идентификация типов гемоцитов при помощи световой микроскопии
Мазки гемолимфы фиксировали этиловым спиртом на протяжении 2-3 минут. Далее, окрашивали азур-эозином по Романовскому - Гимза. Измерение морфологических параметров клеток проводили с помощью окуляр-микрометра. Процентное соотношение типов гемоцитов определяли по подсчетам клеток в 30 полях зрения. При идентификации типов гемоцитов пользовались классификацией, адаптированной из работ Gupta (1979), Ratcliffe (1982), Brechelin, Zachary (1986).
Для идентификации гемоцитов был использован зонд на внутриклеточный кальций - хлортетрациклин (ХТЦ), который связывается с кальцием и еще каким-либо компонентом клетки (мембранаг АТФ и т.д.) (Добрецов, 1988). Отмытые гемоциты помещали в среду Грейса и центрифугировали при 500 g 3 минуты. К осадку клеток прибавляли 4 0 мкл среды Грейса и 10 мкл ХТЦ (1 х 10 3 М), ресуспензировали и инкубировали 20 мин. при температуре 2 0+2 С, постоянно встряхивая. Навески ХТЦ предварительно разбавляли в этиловом спирте, с расчетом, чтобы конечная концентрация спирта не превышала 1%. После инкубирования, каплю смеси (10 мкл) помещали на обезжиренное предметное стекло и накрывали покровным стеклом, края которого были предварительно смазаны вазелином. Измерение интенсивности флуоресценции комплекса Са2+-ХТЦ регистрировали с помощью микроскопа «Люмам - И2», используя ФМЭЛ - 1А и источник питания ДРШ-250 (фильтры возбуждения - ФС, СЗС, запирающие фильтры - ЗЛС, ЖС -18). Интенсивность флуоресценции измеряли в относительных единицах по показанию вольтметра как разность флуоресценции клетки и фона, уровень которого постоянно регистрировали при измерениях. Перед инкубацией с ХТЦ подсчитывали общее количество гемоцитов в камере Горяева (в 100 малых квадратах сетки). Гемоциты дополнительно просматривали, используя фазово-контрастную микроскопию и окрашивание азур-эозином по Романовскому-Гимза.
Растительные лектины - конканавали A (Con А) и фи-тогемагглютинин (ФГА), метили флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) следующим образом: 500 мг лектина растворяли в 0,5 М карбонатном буфере (рН 9) , добавляли 5 мг ФИТЦ. Данную смесь инкубировали 18 часов при температуре -f 4 -+6 С периодически перемешивая, затем диализировали против ФБ. Лектины осаждали сульфатом аммония, осадок разбавляли в дистиллированной воде и диализировали против ФБ 12 часов при температуре +4 - +6 С. Диализ проводили трижды. Полученную смесь подвергали гель-фильтрации на сефадексе G-25 для отделения непрореагировавшего красителя. Конъюгированные ФИТЦ лектины инкубировали с отмытой суспензией гемоцитов или монослоем гемоцитов в течение 4 0 мин.., затем клетки промывали ФБ и микроско-пировали, используя микроскоп «Люмам - И2».
Реакцию агглютинации проводили согласно методике Зигль (1980), с незначительными изменениями. В опытах по определению агглютинирующей активности использовали эритроциты человека различных групп крови. Эритроциты трехкратно отмывали в ФБ и доводили суспензию эритроцитов до 10% (106 клеток/ мкл). Титр агглютинации определяли в U- образных платах методом двойного разведения. В качестве ингибиторов использовали растворы ЮмМ, 2 0мМ ЭДТА и 200 мМ различных углеводов.
Флуорохромирование растительных лектинов и использование их в идентификации гемоцитов
Для получения фракций с агглютинирующей активностью, использовали гемолимфу с предварительно осажденными гемоцитами. Гемолимфу разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке (1 х 30 см) с Toyopearl HW-55 (Toyo Soda MFG. CO. Ltd.) в 50 мМ трис-НСІ буфере, pH 7,5 с 150 мМ NaCl. Полученные активные фракции использовали в дальнейшей работе.
При получении поликлональной антисыворотки придерживались рекомендаций Amirante, Mazzalai (1978) с незначительными изменениями. После гель-фильтрации активные фракции гемолимфы инкубировали с эритроцитами человека (10в клеток/мкл) 2 часа при температуре 22 ± 2 С. Затем эритроциты трехкратно отмывали в ФСБ и использовали 10%-ю суспензию для иммунизации кроликов. Цикл иммунизации состоял из трех инъекций. Первую иммунизацию проводили введением 2 мл антигена с 2 мл адъюванта Фрейнда подкожно. Вторую и третью иммунизации - введением 2 мл антигена внутримышечно. Интервал между инъекциями составлял 7 дней. Реимунизацию проводили через месяц по вышеописанной схеме. Кровь брали из краевой вены уха кролика на 8 день после реиммунизации.
Для выявления агглютининов в гемоцитах использовали иммуноферментный метод (Полак, Ван Норден, 198 7) . Для блокирования неспецифического связывания монослои гемо-цитов инкубировали в течение 30 минут в нативнои козьей сыворотке (разведение 1:10). После удаления козьей сыворотки, монослои инкубировали в течение 1 часа в кроличьей антисыворотке к агглютининам стрекоз (разведение 1:200), содержащей 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,3% Тритона Х-100. Затем монослои трехкратно промывали в ФБ с 0, 3 % Тритона Х-100 и инкубировали 1 час с козьими антителами против Ig G кролика, конвергированных с пероксидазой ("Имтек", г. Москва) в разведении 1: 1000. После трехкратного промывания в ФБ с 0,3 % Тритоном X -100 и двукратного в ФСБ без детергента, мо нослои инкубировали в ФБ с 0,5 мг/мл 3, 3-диаминобензидина тетрагидрохлорида (ДАБ), содержащем 0,03 % Н2О2. Все вышеописанные операции проводили при температуре 22 + 2 С.
Для электронной микроскопии гемоциты были фиксированы в 2,5 % глутаровом альдегиде в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,2 при 25 "с в течение 1 часа, с последующей фиксацией в 1% забуференном тетраоксиде осмия при 2 5 С в течение 1 часа. Затем гемоциты дегидрировали в серии градиента ацетона и помещали в смесь смол эпон- аралдит. Ультратонкие срезы были проанализированы в электронном микроскопе Hitachi -30 0 ЕМ. Изготовление ультратонких срезов и фотографий клеток крови проводилось к.б.н. Ю. Я. Соколовой Для выделения бактерий, предварительно отмытые ге-моциты, гомогенизировали в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4 и центрифугировали при 1500Од в течение 15 мин. Полученный осадок помещали непосредственно на триптозный агар (Ferak, Berlin) в чашках Петри. Чашки инкубировали при температуре 28 С 48 часов, затем бактерии были идентифицированы по определителю Берджи {1997). Определение бактерий до рода проводил к.б.н.
Для приготовления аффинного сорбента бром-циан активированную Сефарозу 4В (Sigma) конъюгировали с IgG кролика согласно Харрисону, Итину (Harrison, Itin, 1980) . Сывороточные IgG кролика были очищены согласно Трукко, де Петрис (1983). При проведении аффинной хроматографии использовали фракции гемолимфы с агглютинирующей активностью, полученные после гель-фильтрации. Колонку (1x2 см) с конъюгированной сефарозой 4В уравновешивали 50 мМ трис-HCl буфером рН 7,5 с 150 мМ NaCl. загрузку проводили в этом же буфере. Для удаления неспецифически связанных белков колонку промывали 50 мМ трис- НС1 буфером рН 7,5 с 500 мМ NaCl, затем элюирова-ли агглютинин 0,2 М глицин- НС1 буфером рН 2, 5
