Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Генофонд медоносной пчелы 9
1.1. Сохранение генофонда 9
1.1.1. Состояние пчеловодства России 9
1.1.2. Сравнительное изучение рас и районирование 16
1.1.3. Методы идентификации генофонда 22
1.1.4. Внутривидовая систематика 28
1.1.5. Пчеловодство Башкирии 62
1.2. Селекция медоносной пчелы 37
1.2.1. Проблемы селекции 37
1.2.2. Перспективы развития селекции пчелы 40
1.2.3. Иммунитет насекомых 43
1.2.4. Антибактериальные пептиды насекомых 50
1.2.5. Особенности иммунитета медоносной пчелы 60
Заключение 63
Глава 2. Методы идентификации генофонда Apis mellifera mellifera L. в Башкирии 66
2.1. Материалы и методы исследований 67
2.2. Полиморфизм локуса COI-COII мтДНК A.mellifera на территории РБ 76
2.3. Модификация морфометрического метода 79
2.4. Структура и полиморфизм генов АБП 83
Заключение 97
Глава 3. Состояние генофонда башкирской популяции Apis mellifera mellifera L. 99
3.1. Материалы и методы исследований 100
3.2. Полиморфизм мтДНК (локус COI-COII) A.mellifera на территории РБ 105
3.3. Морфометрический полиморфизм A.mellifera на территории РБ 109
3.4. Источники восстановления генофонда башкирской популяции A.m.mellifera . 120
3.5. Полиморфизм гена дефензина на территории РБ 132
Заключение 147
Глава 4. Биохимическая модель инфекционного стресса 150
4.1. Материалы и методы исследований 153
4.2. Начальная стадия развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при действии препарата БТБ и культуры бактерий Bacillus thurengiensis 164
4.3. Биохимические закономерности защитной реакции пчелы на инфекционный стресс 171
4.4. Динамика биохимических показателей при температурном стрессе 181
4.5. Экспрессия генов антибактериальных пептидов 185
Заключение 190
Глава 5. Биохимические различия защитных реакций у различных географических рас медоносной пчелы 192
5.1. Материалы и методы исследований 192
5.2. Сравнение рас по хозяйственно-полезным признакам 195
5.3. Зимостойкость пчел и их устойчивость к заболеваниям 208
5.4. Биохимические показатели устойчивости пчел в норме 211
5.5. Биохимические показатели устойчивости пчел разных рас в модели инфекционного стресса 216
5.6. Клеточный иммунный ответ на БТБ 219
5.7. Расовые особенности в экспрессии генов АБП 221
Заключение 229
Общее заключение 230
Выводы 235
Литература 239
Приложения 270
- Сравнительное изучение рас и районирование
- Полиморфизм локуса COI-COII мтДНК A.mellifera на территории РБ
- Источники восстановления генофонда башкирской популяции A.m.mellifera
- Начальная стадия развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при действии препарата БТБ и культуры бактерий Bacillus thurengiensis
Введение к работе
Критическое состояние генофонда медоносной пчелы является одной из основных причин современного кризиса в пчеловодстве России.
Естественный ареал медоносной пчелы охватывает значительную часть Старого Света. В пределах этого ареала вид Apis mellifera L. подразделяется как минимум на 25 географических рас (Ruttner, 1992), но только темная лесная пчела Apis mellifera mellifera L. освоила огромный регион вдоль северной границы ареала, протянувшийся вдоль лесной и лесостепной зон через всю Евразию. Apis mellifera mellifera L. уникально адаптирована к холодной продолжительной зиме, к сопутствующим этому болезням, а также к бурному, но кратковременному летнему взятку.
За последние два века ареал Apis mellifera mellifera L. существенно сократился из-за интенсивной вырубки лесов, гибридизации с другими расами пчел и распространения новых болезней. В настоящее время по всему ареалу доминируют гибриды темной лесной пчелы с серой горной кавказской, карпатской и итальянской пчелами. В Европе островки чистопородной Apis mellifera mellifera L. сохранились только в Великобритании, на Скандинавском полуострове и в Польше.
Россия еще обладает резервами для восстановления генофонда Apis mellifera mellifera L. Более того, освоение огромных медоносных ресурсов России, расположенных в центральных и северных районах Европейской части страны, на Урале и, особенно, в Сибири, невозможно без использования богатейшего генофонда этой самой зимостойкой из всех рас пчел (Гранкин, 1997). Одной из наиболее известных и крупных популяций темной лесной расы является башкирская популяция, при этом состояние генофонда башкирской пчелы до последнего времени остается неизвестным. Экспериментальные данные, на основе которых можно было бы нарисовать реальную картину, практически отсутствуют.
Современный уровень смешения рас сильно усложнил анализ данных, получаемых морфометрическим методом (Гранкин, 1997). Первый серьезный успех в поиске ДНК-маркеров для идентификации рас был достигнут на основе рестрикционного полиморфизма мтДНК (Smith, 1988). Тем не менее, до настоящего времени лишь отдельные работы, связанные с поиском маркеров для популяционной генетики медоносной пчелы, были посвящены другим методам анализа ДНК, а общее количество активно используемых популяционно-генетических маркеров не превышает одного десятка (Lobo et al., 1989; Meixner et al., 2000). В России лишь в последние годы появились первые молекулярно-генетические работы в этой области (Никоноров и др., 1997; Поздняков и др., 2000).
До сих пор ни в одной стране мира нет породы пчел, созданной человеком (Мельниченко, 1989), все они имеют естественное происхождение. Селекция пчел с акцентом на медовую продуктивность не дала существенного результата, поскольку пчелиная семья в течение сезона, как правило, реализует свой медосборный потенциал лишь на 20-30%. К тому же медоносная пчела - одно из немногих домашних животных, обитающих практически весь год в естественной среде, где на первый план выходит устойчивость. В настоящее время ущерб, наносимый российскому пчеловодству и вытекающий из низкого уровня устойчивости пчел, включает в себя ежегодную гибель 10-20% пчелиных семей в весенне-зимний период, 20-40% отход пчел в выживших семьях, весеннее ослабление многих семей, делающих их неспособными полноценно участвовать в главном медосборе. К этому следует добавить широкое распространение варроатоза, аскосфероза и др. болезней. Все это позволяет предположить перспективность селекции медоносной пчелы с акцентом на устойчивость к среде обитания.
Наконец, по-прежнему актуальным для пчеловодства остается обоснованный выбор оптимальной (и обязательно реализуемой) стратегии использования генофонда медоносной пчелы и последовательная политика государства по ее реализации.
Исследования, представляемые в данной работе, выполнялись в 1996-2002 годах в лаборатории биохимии адаптивности насекомых Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН под руководством автора диссертации в рамках тем Российской академии наук: «Генетико-биохимические особенности башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы» (РАН, № госрегистрации 01.9.60 001037, 1996-1998) и «Молекулярные механизмы адаптивности южно-уральской популяции Apis mellifera mellifera к современным условиям обитания» (РАН, № госрегистрации 01.99.00 08299, 1999-2001).
Исследования были поддержаны грантами Академии наук Республики Башкортостан и Российского фонда фундаментальных исследований.
• «Физиолого-биохимические особенности холодоустойчивости башкирской популяции среднерусской породы медоносной пчелы» (АН РБ, 1996-1998).
• «Разработка комплекса молекулярно-генетических методов для контроля состояния генофонда башкирской пчелы и изучения ее внутрипопуляционной генетической структуры» (АН РБ, 1999-2001).
• «Молекулярно-генетическая паспортизация генофонда башкирской популяции медоносной пчелы» (АН РБ, 1999-2001).
• Молекулярно-генетические основы адаптивного потенциала популяции башкирской пчелы (РФФИ, проект №02-02-97925).
Результаты диссертационной работы прошли апробацию на Научно-практической конференции по пчеловодству (Уфа, 1996), научной конференции «Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан» (Уфа, 1997), Intern. Congress «Animal Genetics at the Treshold of the Twenty First Century» (Auckland, 1998), Intern. Congress «Biologically Active Polysaccharides» (Oslo, 1998), научной конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии» (Челябинск, 1999), The 3rd Carbohydrate Bioengineering Meeting, (England, 1999), научной конференции «Проблемы физико-химической биологии» (Пущино, 2000), научной конференции «Современное состояние проблемы резистентности» (Пушкин-Санкт-Петербург, 2000), научной конференции «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Брянск, 2000), научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2000), 6th European Training Course on Carbohydrates (Hungary, 2000), 4th Congress of Animal Genetics (USA, 2000), Intern. Congress «Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia (Novosibirsk, 2000), XII съезде РЭО (Санкт-Петербург, 2002).
Основные материалы диссертации изложены в 52 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных EMBL/GenBank.
Положения, выносимые на защиту. 1. На основе разработанной нами методологии возможна реализация стратегии чистопородного разведения, т.е. анализ состояния генофонда, его восстановление и сохранение, а также последующая селекция, в той основной части ареала Apis mellifera mellifera L., где популяционная система сильно нарушена.
2. Степень сохранности генофонда башкирской популяции медоносной пчелы, ее адаптированность к среде обитания и выявленные нами новые селекционные признаки устойчивости позволяют считать чистопородное разведение Apis mellifera mellifera L. в РБ оптимальной стратегией использования генофонда медоносной пчелы.
3. Сложная и эффективная система иммунитета медоносной пчелы является перспективным источником для поиска современных селекционных признаков и позволяет рассчитывать на успех селекции Apis mellifera mellifera L. с акцентом на устойчивость к среде обитания.
4. Условия интенсивного кратковременного стресса обеспечивают получение стабильных и информационно ёмких биохимических селекционных признаков, позволяют получить оптимальную оценку индивидуального адаптивного потенциала насекомого.
Автор благодарит инициатора этой работы профессора В.А.Вахитова за постоянную поддержку, без которой работа вряд ли была бы завершена, Г.Д.Билаша за ценные консультации, профессора Э.К.Хуснутдинову, профессора А.В.Чемериса и Ю.М.Никонорова за постоянную методическую помощь, сотрудников лаборатории биохимии адаптивности насекомых Г.В.Беньковскую, А.В.Поскрякова, Е.С.Салтыкову, В.Н.Саттарова, А.В.Львова, О.В.Сухорукову, Л.Р.Гайфуллину, М.Б.Удалова и других коллег за всемерную поддержку в работе.
Сравнительное изучение рас и районирование
В середине XIX столетия европейское пчеловодство вступило в новую фазу развития. Изобретение рамочного улья, расширение знаний о биологии пчёл, появление новых технологий содержания - все это создало условия для появления научной селекции в пчеловодстве. Новые средства сообщения обеспечили массовый перевоз пчёл на дальние расстояния.
Важная роль в становлении селекции пчёл принадлежит сравнительному изучению пчёл различных рас. С середины XIX века это направление в Европе приняло характер широкомасштабных опытов.
Большую часть Центральной и Северной Европы занимал ареал темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera. В 1843 году в Швейцарии появились итальянские пчёлы A.m.ligustica. В 1852 году Я.Джерсон, создавший теорию партеногенеза пчёл, привез пчёл итальянской расы в Германию. 30 лет он занимался их разведением, пропагандой достоинств расы, рассылкой в другие страны. В 1859 году итальянские пчёлы от Я.Джерсона были завезены в Англию. Затем в Европу были импортированы пчёлы с Кипра (A.m.cypria), из Палестины (A.m.syriaca) и Египта (A.m.lamarkii). В 1870 году из Австрии и Словакии в Германию были завезены пчёлы краинской расы (A.m.carnica). Они оказались лучше итальянских пчёл, но отличались большой ройливостью. Импортеры пчёл в этих странах вели их селекцию не по признаку продуктивности, а по способности к размножению, что отвечало задачам экспорта. В 1877 году А.М.Бутлеров открыл пчеловодному миру ценные качества кавказских пчёл A.m.caucasica. С этого момента начался их экспорт в Европу. Интенсивный завоз пчел происходил на фоне неконтролируемого скрещивания пчел. Аборигенные европейские расы (в основном A.m.mellifera) гибридизировались с завезёнными. К концу XIX века широкое распространение получили гибридные формы, и только в относительно изолированных регионах удалось сохранить чистопородных пчёл аборигенных рас (Дреер, 1985).
Проблема была усугублена тем, что в 1878 году в окрестностях Ганновера были проведены первые опыты, убедительно показавшие, что семьи-помеси I поколения от скрещивания итальянских маток с темными немецкими трутнями существенно превосходили по продуктивности семьи обеих исходных рас (Билаш, Кривцов, 1991). Лишь много позднее стало очевидным существование постгетерозисной депрессии у пчёл-помесей в 3-4 поколении.
Первый протест против завоза различных рас прозвучал в 1890-е годы в Швейцарии. У.Крамер (1898), автор первого системного руководства по селекции пчёл и основатель концепции их чистопородного разведения, настоятельно рекомендовал разводить пчёл местных рас. В качестве основных методов чистопородного разведения были предложены постоянный отбор наиболее продуктивных пчёл с учетом их типичных породных признаков и жёсткая выбраковка всех нечистокровных по экстерьерным и другим признакам семей. У.Крамер впервые рекомендовал создавать изолированные случные пункты для контроля над спариванием маток и трутней.
В начале XX столетия профессор Е.Цандер попытался восстановить аборигенных пчёл A.m.mellifera в Германии. Для контролируемого осеменения маток были созданы племенные пасеки, куда привозили предназначенных для спаривания маток и трутней. Вокруг этих мест оставляли многокилометровую зону, свободную от пчёл. Несмотря на все усилия восстановить в чистоте местную популяцию A.m.mellifera не удалось. Главная причина заключалась в отсутствии методов идентификации генофонда, необходимых для чистопородного разведения. Первые эффективные морфометрические системы для идентификации европейских рас пчёл были разработаны В.В.Алпатовым и G.Goetze только в 1930-е годы (Дреер, 1985).
Время показало, что стремление «импортировать чужеземную пчелу для развития пчеловодства» будет существовать еще долго. На XXI Международном конгрессе по пчеловодству Апимондии в Мэриленде особое внимание было обращено на необоснованность этого приема (Ruttner, 1967). Тем не менее, российские селекционеры пошли своим путем, путем самостоятельного повторения пройденного.
Еще до революции в России было выполнено множество опытов по сравнительному изучению рас пчёл. Наряду с отечественными расами (среднерусской, степной украинской, желтой и серой горной кавказской) изучались кипрские, итальянские, краинские (Билаш, Кривцов, 1991). Тем не менее, еще в 20-30-е годы XX века в европейской части России в основном разводили местных пчёл, хорошо приспособленных к климатическим условиям и условиям медосбора.
В 1930 году вместо Тульской опытной станции был создан Всесоюзный институт пчеловодства с системой зональных учреждений на базе существующих и запланированных опытных станций (Уральской, Украинской, Северо-Кавказской, Башкирской, Алтайской, Дальневосточной, Казахской и Закавказской). Сотрудники института Ф.А.Тюнин и А.С.Михайлов возобновили сравнительное изучение рас и оценку их хозяйственной ценности в условиях Тульской области. Исследователями была обнаружена высокая изменчивость признаков интродуцируемой расы в связи с акклиматизацией. Было показано, что серые горные кавказские пчёлы в Тульской области характеризуются многими ценными качествами, но их акклиматизация вряд ли перспективна из-за слабой зимостойкости (Билаш, 1995). Вопрос был временно снят с повестки дня.
Возвращение к проблеме акклиматизации было вынужденным. Для восстановления пчеловодства в районах, пострадавших от оккупации, из Краснодарского и Ставропольского краев было завезено свыше 300 тыс. пакетов желтых кавказских пчёл (кубанской популяции A.m.armenica). В колхозах большинства западных областей местных пчёл почти не осталось, и все пасеки формировались из кубанских пчёл. Результаты оказались неудовлетворительными. Кубанские пчёлы в центральных и северных областях зимовали хуже местных, особенно, если пчёлы попадали в неблагоприятные условия зимнего содержания (Лаврехин, 1949; Решетнев, 1949). В условиях средней полосы завезённые пчёлы сильно поражались падевым токсикозом, нозематозом и европейским гнильцом, сильно роились, закладывали много маточников, меда собирали значительно меньше среднерусских (Таранов, 1950; Блунюк, 1951; Билаш, 1954). Резервов среднерусских пчел, достаточных для восстановления пчеловодства в западных областях, в стране не было. Проблема акклиматизации была вновь поставлена перед учеными.
В сравнительных экспериментах Л.С.Ливенцова серые горные кавказские пчёлы (абхазской популяции A.m.caucasica) в Европейской России собрали меда на 45% больше, чем среднерусские, и превзошли в этом отношении другие изучавшиеся расы. Эти результаты вызвали новый всплеск интереса к сравнительному изучению рас. В 1948 году в Пензенской области возобновили эксперименты по разведению и содержанию серых горных кавказских пчёл в условиях Центральной России (Веприков, 1948).
В том же году в стране появился лозунг «Пчёл всех пород - на красный клевер», который к тому времени был объявлен одной из обязательных культур севооборота нечерноземной зоны СССР. Колхозы и совхозы должны были с максимальной полнотой использовать всех пчёл на опылении красного клевера (Домороцкий, 1948). И.Н.Клинген (1949) пришел к выводу, что абхазские пчёлы лучше опыляют клевер, чем северные пчёлы, имеющие хоботок в среднем на 1 мм короче абхазских. И хотя в 1950 году А.Ф.Губин показал, что местные пчёлы не менее пригодны для опыления клевера, чем кавказские (Губин, 1953), «акклиматизационные настроения» усилились. Впрочем, выбор стратегии восстановления пчеловодства в западных областях СССР следует отнести скорее к задаче экономической. Генетическая проблема заключается в том, что параллельно возникло желание улучшить генофонд медоносной пчелы на всей территории СССР.
Полиморфизм локуса COI-COII мтДНК A.mellifera на территории РБ
Процесс электрофоретического фракционирования продуктов амплификации мтДНК проводили в 1,5%-ном агарозном геле, приготовленном на буфере следующего состава: 40 мМ трис-ацетат, рН 7. и 2 мМ ЭДТА. Для электрофоретического фракционирования амплификатов генов АБП в зависимости от требуемого разрешения электрофореза использовали 0,8-1,5% агарозный гель или же 4-10% ПААГ. Полиакриламидный гель применяли для фракционирования фрагментов ДНК, размеры которых не превышали 1000 пн (Маниатис и др., 1984). Расчётное количество акриламида и метилен-бис-акриламида растворяли в бидистиллированной воде и дегазировали под вакуумом. Затем добавляли до 0.07% персульфата аммония и 15-30 мкл TEMED. После полимеризации геля проводили преэлектрофорез в течение 20-30 мин при напряжении 1 В/см. Фракционирование препарата проводили в течении 2-4 часов при напряжении 2-5 В/см. Электрофорез проводили в приборах горизонтального (агарозные гели) и вертикального (ПААГ) типа. В качестве маркёров использовали фрагменты ДНК фага Я или плазмиды pGEM5, расщеплённых рестриктазами PstI и НаеШ соответственно.
После окончания электрофореза как агарозные, так и полиакриламидные гели окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин. Результаты наблюдали в проходящем ультрафиолетовом свете длиной 312 нм (трансиллюминатор ТМ-36 фирмы "UV-Products", США). Гели фотографировали на плёнку Микрат-300 через оранжевый светофильтр ОС-12.
Обработку ДНК рестрикционными эндонуклеазами проводили в буферных растворах, содержащих 10 мМ трис-HCl рН 7.5, 10 мМ MgCl, 1мМ дитиотрейтола и различные концентрации NaCl (50 мМ, 100 мМ) (Маниатис и др., 1984). Для рестриктазы TaqI использовали буферный раствор, содержащий трис-HCl рН 8.0, 5мМ MgCl, 100 мМ NaCl, 0.1 мг/мл BSA. Для рестриктазы Eco47I (Avail) использовался буферный раствор, содержащий трис-HCl рН 8.5, 5мМ MgCl, 100 мМ КС1, 0.1 мг/мл BSA. Время инкубации варьировали в зависимости от цели и количества препарата от 4 ч до суток. Температуру инкубации поддерживали оптимальную для каждой конкретной рестриктазы (37 и 65С). Расщепление при 65С проводили под слоем вазелинового масла. К препаратам гидролизованнои ДНК добавляли буфер, содержащий глицерин и маркерные красители, и фракционировали их в полиакриламидных гелях.
Клонирование амплифицированных фрагментов, элюированных из легкоплавкой агарозы, осуществляли с применением вектора pGEMEasy (Promega Corporation, США), а также dT-вектора, приготовленного на основе фагмиды pBluescript II KS (-) (Stratagene, США), расщепленной по сайту EcoRV. Для этого плазмидную ДНК вектора pBluescript II KS(-) гидролизовали 10 е.а. рестрикционной эндонуклеазы EcoRV в течение ночи при 37С в буфере следующего состава: ЮмМ трис-HCl, рН 7,8, 10MMMgCl2, lOOMMNaCl, ІмМ ДТТ. Полноту рестрикции проверяли аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15мМ и прогревали в течение 10 мин при 70С. ДНК экстрагировали смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом, осаждали этанолом, высушивали и растворяли в ТЕ буфере. Далее рестрицированную ДНК pBluescrip SK(-) инкубировали с 5 е.а. Taq полимеразы в течение 1 ч при температуре 70 С в 50 мкл буфера следующего состава: ЮмМ трис-HCl, рН 8,0, ЮмМ MgCl2, ІмМ ДТТ, 0,5мМ дТТФ. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до концентрации 20мМ и реакционную смесь депротеинизировали смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом, осаждали этанолом, высушивали и растворяли в ТЕ буфере. Приготовленная таким образом векторная ДНК становилась пригодной для клонирования амплификагов, которые как правило имеют выступающий на 3 концевой части ДНК dA нуклеотидный остаток. Далее смесь векторной ДНК и ДНК амплифицированных фрагментов генов антибактериальных пептидов инкубировали с 10 е.а. ДНК лигазы фага Т4 в течение 16 ч при 16С в 10 мкл буфера следующего состава: 50мМ трис-HCl, рН 7,6, ЮмМ MgCl2, ЮмМ ДТТ, 1мМ АТФ. Лигированную ДНК трансформировали в компетентные клетки E.coli XLl-Blue. Трансформированные клетки высевали на чашки с LB-агаром, содержащим X-Gal и IPTG, инкубировали в течение ночи при 37С. Далее белые колонии пересевали на чашки с LB-агаром, выделяли из них плазмиды и проверяли наличие вставки, сравнивая размер их ДНК с размером изначального вектора методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Компетентные клетки E.coli готовили в стерильных условиях, которые обеспечивались ламинарным боксом горизонтального типа (Flow, Шотландия). 1 мл ночной культуры E.coli штамма XL 1-Blue вносили в колбу на 500 мл со 100 мл LB среды, содержащей 12,5 мкг/мл тетрациклина, и наращивали клетки до D55o=0,3 при 37С, при интенсивной аэрации на орбитальном встряхивателе УВМТ 12-250. Затем собирали клетки центрифугированием в стерильных центрифужных стаканах в центрифуге К-23 при 3000 об/мин, 10 мин. Удаляли супернатант и осторожно суспендировали клетки в 25 мл холодного (4С) буфера I (10 мМ СаС12, 50 мМ МпС12, 100 мМ КС1, 30 мМ ацетат калия, рН5,8). Повторно проводили центрифугирование при 2500 об/мин, 10 мин. Удаляли супернатант как можно более полно и также мягко суспендировали клетки в 5 мл холодного буфера II (75 мМ СаС12, 10 мМ КС1, 15%-ный глицерин, 10 мМ MOPS, рН6,5). Оба буфера стерилизовали автоклавированием. Расфасовывали клеточную суспензию по 200 мкл в предварительно охлажденные стерильные полипропиленовые микропробирки и замораживали при -70С.
К 200 мкл только что размороженной на льду суспензии компетентных клеток, приготовленных и хранящихся как описано в предыдущем разделе добавляли 10 мкл лигазной смеси и инкубировали 1 ч на льду. Подвергнув клетки тепловому шоку при 42С в течение 2 мин инкубировали их еще 1 ч при 37 С, предварительно разбавив в 10 раз свежей средой LB. После инкубации суспензию клеток кратковременно осаждали в микроцентрифуге и осадок суспензировали в 100 мкл среды LB. Затем эту суспензию равномерно распределяли стерильным стеклянным шпателем по поверхности 1,5%-ного агара, приготовленного на LB-среде с ампициллином (100 мкг/мл) и тетрациклином (12,5 мкг/мл), разлитого в чашки Петри. Жидкости давали возможность впитаться и чашки Петри помещали в перевернутом виде в термостат (37С) на 18 ч.
Источники восстановления генофонда башкирской популяции A.m.mellifera
В результате проведенных исследований найдены молекулярные маркеры и разработан комплекс методов для анализа генофонда Apis mellifera mellifera L., работающий в условиях высокой степени внутривидовой гибридизации медоносной пчелы в России.
Проведен секвенционный анализ и разработаны условия амплификации вариабельного локуса COI-COII мтДНК. Анализ полиморфизма данного локуса позволяет однозначно различать расовое происхождение пчелиной семьи по материнской линии (Никоноров и др., 1988). Локус COI-COII у расы A.m.mellifera с частотой встречаемости более 0,99 представлен аллелем PQQ (описано всего два случая PQQQ). У южных рас A.m.caucasica, A.m.armenica, A.m.carnica, A.rn.carpatica и A.m.ligustica (основной источник генетического загрязнения башкирской популяции A.m.mellifera) аллель Q, скорее всего, фиксирован.
Морфометрический метод В.В.Алпатова (1948) модифицирован на базе кластерного анализа (стратегия Варда, квадратичное Евклидово расстояние), что обеспечивает его использование в условиях интенсивной внутривидовой гибридизации. По кДНК генов АБП медоносной пчелы абецина, дефензина и гименоптецина методом компьютерного дизайна подобрано 6 праймеров длиной от 19 до 27 нуклеотидов. Амплифицированы фрагменты соответствующих генов. Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов генов гименоптецина и дефензина, по результатам секвенирования, гомологичны соответствующим последовательностям кДНК, т.е. амплифицированные фрагменты соответствуют участкам генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы. Выявлена нуклеотидная замена в кодирующей области гена дефензина, которая ведёт к замене аминокислоты в соответствующем пептиде. Обнаружен ранее неизвестный диаллельный полиморфизм длин амплифицируемых фрагментов гена дефензина Apis mellifera.
Из-за непрерывного снижения внутривидового разнообразия сегодня на грани исчезновения находятся сотни пород домашних животных и сортов культурных растений. Катастрофическими темпами происходит сокращение внутривидового разнообразия медоносной пчелы A.mellifera, и, особенно, уникального подвида A.m.mellifera, темной лесной пчелы.
В пределах естественного ареала вид A.mellifera подразделяется как минимум на 25 географических рас (Runner, 1992), однако только темная лесная (среднерусская) раса A.m.mellifera освоила огромную территорию вдоль северной границы видового ареала. Она уникально адаптирована к холодной продолжительной зиме, а также к бурному, но кратковременному летнему взятку. В настоящее время по всему ареалу темной лесной пчелы преобладают гибриды разных поколений с краинкой, итальянской и серой горной кавказской пчелами. По данным BIBBA за пределами России небольшие островки чистопородной A.m.mellifera, возможно, сохранились только в Великобритании, на Скандинавском полуострове и в Польше.
Россия, вероятно, еще обладает резервами для восстановления генофонда A.m.mellifera. Освоение огромных медоносных ресурсов России, расположенных в центральных и северных районах Европейской части страны, на Урале и, особенно, в Сибири, просто невозможно без использования богатейшего генофонда самой зимостойкой из всех пчел - темной лесной пчелы (Гранкин, 1997). Среди популяций A.m.mellifera в РФ наиболее известны башкирские, алтайские и полесские пчелы (Билаш и др., 1991).
Фактические данные о состоянии генофонда башкирской популяции, опубликованные за последние 20 лет, фрагментарны, оценки противоречивы. С одной стороны, специалисты отмечают критическое состояние генофонда, большую вероятность безвозвратной потери ценных местных пчел даже в тех районах, где они еще сохранились (Шакиров, 1987, 1988). В РБ резко снижается продуктивность пчел и отмечается их возрастающая гибель как следствие гибридизации. Под угрозой исчезновения находится генофонд бортевых пчел заповедника «Шульган-Таш»
100 (Гиниятуллин и др., 1999). С другой стороны, Агенство по пчеловодству РБ сообщало о стабилизации и улучшении ситуации (Шагимухаметов, 1999).
Положение усугубляется методической проблемой точной идентификации рас. Весь арсенал российских исследователей до недавнего времени был ограничен вариантом морфометрического метода, предложенным В.В.Алпатовым (1948). Однако эффективность этого метода резко снижается в присутствии большого количества гибридных семей.
Разработка комплекса методов для анализа генофонда A.mellifera позволила нам приступить к решению следующей задачи: описанию генетической структуры A.mellifera на территории Южного Урала. Для решения поставленной задачи был создан банк ДНК и морфометрических данных, исследован полиморфизм митохондриального (локус COI-COII) и ядерного геномов медоносной пчелы (ген дефензина) на территории РБ, дана оценка состояния генофонда башкирской популяции A.m.mellifera, определены перспективы и условия восстановления генофонда этой популяции.
Объектом исследований являлись выборки пчелиных семей из различных регионов РБ. Сбор проб проводился в 1996-2002 годах.
Несмотря на относительно широкое использование термина «популяция», при изучении медоносной пчелы в России популяционный подход почти не используется. Как правило, популяции характеризуются по локальным (практически точечным) выборкам пчелиных семей (Кривцов, 1995). В процессе сбора проб мы попытались учесть основные факторы, определяющие подразделенность башкирской популяции A.m.mellifera.
Наличие 3-х природно-климатических зон (Рис. 3.1), распределение липовых лесов на территории РБ и формы сельскохозяйственной эксплуатации экосистем обуславливают дифференциацию медоносной кормовой базы РБ на три типа (Рис. 3.2): липовый (А), липово-гречишный (Б) и гречишно-подсолнечниково-донниковый тип (В) (Рождественский и др., 1992). Помимо этого при сборе проб мы учитывали плотность распределения пчелиных семей по РБ.
Начальная стадия развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при действии препарата БТБ и культуры бактерий Bacillus thurengiensis
На основе молекулярно-генетического (локус COI-COII мтДНК) и морфометрического анализа удалось выделить на территории РБ один полноценный резерват башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы с долей аллеля PQQ - 0,98.
Центр местообитания этой локальной популяции расположен в долинах рек Кужа и Большой Нугуш Бурзянского района РБ на территории заповедника «Шульган-Таш» (Рис. 3.8), которая заселена темными лесными пчёлами, обладающими повышенной зимостойкостью и высокой приспособленностью к использованию местного типа взятка. Пчелы этой популяции длительное время живут в условиях естественной изоляции, обитая в естественных дуплах деревьев и изготовленных человеком бортях. Есть основания считать, что Бурзянский район РБ - одно из немногих мест России, где среднерусские пчелы сохранились в относительной чистоте (Соколов, 1940; Перов, 1947; Генрих, 1958; Петров, 1983; Байтеряков, 1997).
В настоящее время встречаются противоположные оценки состояния генофонда башкирской пчелы как в целом по РБ, так и в заповеднике «Шульган-Таш». А.М.Ишемгулов с соавторами (1997) полагает, что в заповеднике «Шульган-Таш» происходила и происходит бессистемная метизация пчел, которая может привести к необратимым процессам нарушении первоначального исходного и ценного качественного чистопородного материала. В недавно вышедшей работе (Гиниятуллин с соавт., 1999) приведен анализ исторических данных, предпринята попытка оценить состояние генофонда пчелы в заповеднике «Шульган-Таш» и дать прогноз его развития. Авторы отмечают, что в заповеднике «Шульган-Таш» «происходила и происходит бессистемная метизация пчел, которая может привести к необратимым процессам нарушения первоначального исходного и ценного качественного чистопородного материала». Описываемые тенденции базируются на исследованиях, проводившихся еще в восьмидесятых годах и ранее, авторы не приводят точных оценок текущего состояния генофонда бортевых пчел. К тому же все выводы сделаны исключительно на основе морфометрического анализа, где за «основу определения породной принадлежности семей брали показатели кубитального индекса, а остальные показатели экстерьера использовали в качестве дополнительных».
Не ставя под сомнение важность приведенной работы, мы попытались экспериментально, на основе современных методов идентификации, оценить текущее состояние генофонда бурзянской локальной популяции медоносной пчелы. Помимо самого заповедника «Шульган-Тащ» был проведен анализ генофонда пчел на прилегающих территориях разной степени удаленности. Эти территории можно представить в виде расширяющихся кругов: природоохранная буферная зона (в нашей работе д. Галиакберово и д. Верхне-Нугушево), территория Бурзянского района (д. Киекбаево), соседние районы (Абзелиловский и Кугарчинский).
Обобщенные результаты, полученные в ходе исследования, представлены в таблице 3.8. Как видно из таблицы доля семей южного происхождения на территории заповедника в целом составляет величину 0,02. Столь умеренный приток генов не должен, на наш взгляд, вызывать серьезных нарушений в генофонде популяции заповедника. К тому же, при бортевом содержании пчел значительно возрастает, как мы полагаем, роль естественного отбора, обеспечивающего дополнительную стабильность генофонда.
Тем не менее, залет роев инородного происхождения (подобно обнаруженной нами в 37-ом квартале заповедника семьи с аллелем Q) (Рис.3.9), весьма нежелателен с точки зрения сохранности генофонда популяции в первозданном виде. Несмотря на относительно быструю элиминацию семей южного происхождения из-за слабой адаптированности к местным условиям, даже кратковременное одно-двухлетнее воздействие трутневого фона, оказываемое иммигрантами на ближайшие семьи, вызывает долговременные генетические последствия. На рисунке 3.10 показана встречаемость морфотипов A-D на территории заповедника. Пятна «генетических загрязнений» - морфотипы В и С -протянулись по всему периметру заповедника и встречаются довольно часто. Это еще раз подтверждает насущную потребность в расширении буферной зоны вокруг весьма незначительного по площади заповедника. Возможно, решению этой проблемы будет способствовать недавно созданный энтомологический заказник «Алтын Солок».
Остается открытым вопрос о допустимой с точки зрения стабильности популяции величине потока генов, хотя сложно ожидать сколько-нибудь позитивного эффекта от настолько дальне родственного скрещивания в стабильных природных условиях заповедника. В качестве главного следствия такого скрещивания можно ожидать возрастания генетического груза в популяции.
Возвращаясь к таблице 3.8 можно отметить постепенный рост степени генетического загрязнения за пределами буферной зоны. Наконец, кардинальные различия обнаруживаются при рассмотрении выборок из соседних районов. В этой группе еще сохранилось 45% пчел местного происхождения по материнской линии, но по морфотипу практически все пчелы приближались к завозимым южным. Одной из основных причин этого явления может быть мощный инородный трутневый фон, создаваемый пчелами Челябинской и Оренбургской областей.
