Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Адаптивные реакции и биохимические системы устойчивости насекомых 7
1.1. Виды адаптивных процессов и механизмы гормональной регуляции при стресс- реакциях у насекомых 7
1.2. Факторы гуморального иммунитета насекомых 13
1.2.1. Лектины и агглютинирующая активность гемолимфы 13
1.2.2. Антибактериальные пептиды 15
1.2.3. Реакции гликоконыогации 17
1.2.4. Ферментативные системы дезактивации эндогенных и экзогенных токсинов 18
1.2.5. Роль биогенных аминов и фенолоксидазной системы в стресс-реакциях насекомых при действии биотических и абиотических факторов 19
1.2.6. Антиокислительные системы и их участие в неспецифической устойчивости насекомых 24
1.3. Хитоолигосахариды как биологически активные вещества 35
Глава 2 Материалы и методы исследований 38
2.1. Характеристика используемых соединений 39
2.2. Характеристика биологических объектов исследований 39
2.3. Методы изучения биологического действия хитина, хитоолигосахаридов и М-ацетил-О-глюкозамина 42
2.4. Методика биохимических экспериментов 47
Глава 3. Биологическая активность хитина, его олигомеров и мономера К-ацетил-Э-глюкозамина для насекомых 57
3.1 Влияние производных хитина на выживание Apis mellifera L 58
3.2. Преадаптивное действие ХОС при действии экстремальных температур (+50С и +2С) 61
3.3. Преадаптивное действие хитосахаридов при действии бактериального препарата БТБ на насекомых 63
3.4. Влияние хитосахаридов на онтогенез насекомых 64
Глава 4. Действие хитосахаридов на биохимические показатели, отражающие адаптивные процессы у Apis mellifera 70
4.1. Влияние хитосахаридов на биохимические показатели медоносной пчелы в условиях экстремально высокой и низкой температур 71
4.2. Влияние хитосахаридов на биохимические процессы у насекомых при действии БТБ 79
Глава 5. Биохимическая модель начальной стадии развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при действии БТБ 91
5.1. Биохимическая модель начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы 95
5.2. Сравнительное действие препарата БТБ и культуры бактерий Bacillus thurengiensis на физиолого-биохимические показатели медоносной пчелы 100
5.3. Сравнение суточной динамики биохимических показателей у пчелы при действии БТБ и при действии ХОС 109
Глава 6. Преадаптивное действие хитоолигосахаридов на развитие инфекционного процесса у медоносной пчелы 114
6.1. Сравнение суточной и недельной динамики биохимических показателей у медоносной пчелы в норме и при действии ХОС. 115
6.2. Преадаптивное действие ХОС на начальной стадии развития инфекционного процесса у пчелы 120
6.3. Динамика развития инфекционного процесса у медоносной пчелы на фоне преадаптации ХОС 126
Выводы 131
Список литературы 133
- Лектины и агглютинирующая активность гемолимфы
- Характеристика биологических объектов исследований
- Преадаптивное действие ХОС при действии экстремальных температур (+50С и +2С)
- Влияние хитосахаридов на биохимические процессы у насекомых при действии БТБ
Введение к работе
Выявление механизмов адаптации живых организмов к неблагоприятным воздействиям окружающей среды является одной из центральных проблем современной биологии. Изучение молекулярных механизмов защитных реакций насекомых позволит более целенаправленно подойти как к проблеме повышения устойчивости хозяйственно полезных видов насекомых, так и к проблеме регуляции численности насекомых-вредителей.
Медоносная пчела обладает хорошо развитой индивидуальной и групповой системами защиты. Однако к резкому снижению природной устойчивости пчел в настоящее время приводят сокращение кормовой базы, интенсивная межпородная гибридизация, повышение загрязненности окружающей среды и другие причины. Одним из эффективных способов восстановления устойчивости пчел является применение биостимуляторов (Шангараева, 1998). Однако в современном пчеловодстве преобладает применение минерально-витаминных добавок, которые эффективны, как правило, только при низком уровне пчеловождения. Такие добавки компенсируют недостатки искусственного рациона (сахарный сироп), однако они практически бесполезны при полноценном питании пчел.
Перспективным направлением в области биостимуляторов может стать изучение биологической активности промежуточных продуктов катаболизма эндогенных биополимеров (Тарчевский, 1992).Одним из наиболее распространенных у насекомых биополимеров, как известно, является хитин. Адаптогенная роль производных хитина, в частности, хитоолигосахаридов, показана рядом исследователей преимущественно на растениях (Ryan, 1991; Максимов, 1997), но практически не исследована на
5 насекомых. Это дает основание предположить их активное участие в регуляции обмена веществ, морфогенеза и иммунной реакции насекомых, хотя до последнего времени этот вопрос оставался неисследованным. В то же время изучение возможности применения хитина и его производных в качестве адаптогенов насекомых может положить начало созданию биостимуляторов нового поколения, действие которых обусловлено влиянием на биохимические системы адаптации.
Цель данной работы заключалась в выявлении биологической активности хи-тоолигосахаридов по отношению к Apis mellifera L. и изучении их адаптивного действия на начальном этапе инфекционного процесса у пчелы. Были поставлены следующие задачи:
Провести сравнительный анализ биологической активности хитина, его оли-гомеров и мономера ІЧ-ацетил-О-глюкозамина (АГА) по отношению к Apis mellifera.
Изучить воздействие хитосахаридов на биохимические показатели, отражающие адаптивные процессы у Apis mellifera.
Для детального изучения адаптивных свойств хитоолигосахаридов (ХОС) построить физиолого-биохимическую модель начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы.
Исследовать преадаптивное действие ХОС на начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы на основе построенной модели.
Работа выполнялась в 1996-1999 гг. в Отделе биохимии и цитохимии (с 1999 г. Институт биохимии и генетики) Уфимского научного центра РАН в рамках следующих тем: «Генетико-биохимические особенности башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы» (РАН, № госрегистрации 01.9.60 001037, 1996-1998); «Молекулярные механизмы адаптивности южно-уральской популяции Apis mellifera mellifera к современным условиям обитания» (РАН, № госрегистрации 01.99.00 08299, 1999 - 2001); «Физиолого-биохимические особенности холодоустойчивости башкирской популяции среднерусской породы медоносной пчелы» (АН Республики Башкортостан, 1996-1998) «Изучение экспрессии биохимических механизмов защитных реакций как основа оценки адаптационных возможностей организма насекомых» (АН Республики Башкортостан, 1999-2001).
Лектины и агглютинирующая активность гемолимфы
Любое негативное воздействие на организм насекомого сопровождается изменением гемолимфы и других систем организма (эпителиальных клеток, жирового тела, гемоцеля) составляющих основу иммунитета. Иммунитет насекомых не обладает той степенью специфичности, как у млекопитающих, но довольно успешно поддерживает определенное стабильное состояние организма.
Значительными факторами гуморального иммунитета насекомых являются реакции коагуляции и агглютинации. Механизм коагуляции гемолимфы довольно сложен. Индуцированное разрушение гемоцитов приводит к высвобождению коагулоге-на и других субстанций (Глупов, 1992). Гемоцитарный и плазменный коагулогены при наличии в гемолимфе ионов Са и активного Н-фактора способствуют формированию перекрестносвязанного сгустка гемоцитов (Carter, Green, 1988). Было проанализировано более 1500 видов насекомых, принадлежащих к различным таксономическим группам, и выделено 4 типа морфологического состояния коагулоцитов и плазмы гемолимфы при контакте с инородными телами. Однако основное сходство процессов коагуляции у большинства видов насекомых заключается во взаимодействии двух типов коагулогенов при наличии ионов кальция (Gregoire, 1984). Для коагуляции необходима активация целого комплекса ферментов, которые в свою очередь тесно взаимосвязаны с многими защитными реакциями организма насекомого. В экспериментах по свертываемости плазмы гемолимфы таракана Leucophaea maderae обнаружено, что свертывание сильно тормозится в процессе модификации аминогрупп плазменного белка, причем угнетаются оба вида коагуляционного взаимодействия - и ассоциация и образование поперечных связей (Bohn, Saks, 1986). В опытах с немодифицированной плазмой сходное торможение наблюдали в присутствии гидроксила-мина или гидразина. Оба эксперимента дают основание предположить решающую роль аминогрупп в процессе коагуляции (Bohn, Barwig, 1984). Было показано, что коагуляция также ингибируется рядом SH-блокирующих реагентов, в частности иод-ацетамидом. Присутствующий в плазме чувствительный к иодацетамиду фактор образуется в гемоцитах и, по-видимому, идентичен коагулогену гемоцитов. Последний быстро утрачивает коагуляционные свойства после высвобождения из гемоцитов. Процесс коагуляции гемолимфы протекает довольно быстро: в течение 3 мин образуются нерастворимые сгустки. В процессы, связанные с изоляцией чужеродного материала, вовлекаются также агглютинины (Adeyeye, Ching, 1997). За агглютинацию ответственны в основном лектины, представляющие собой мультивалентные глико-зилированные белки, способные ковалентно связываться с определенными углеводными остатками на мембранах клеток или преципитировать полисахариды, гликопро-теины или гликолипопротеины (Полевщиков, 1996). Функции лектинов в организме насекомых при иммунном ответе не совсем ясны. Возможно, одна из функций заключается в агглютинации проникших микроорганизмов, агглютинированные чужеродные клетки могут легко фагоцитироваться и инкапсулироваться (Kato et al., 1994). Подобные реакции важны на начальных стадиях фагоцитоза, связанного с распознаванием чужеродного агента, прежде всего это относится к лектинам на поверхности гемоцитов, образующим рецепторные участки. Другая функция связана непосредственно с коагуляцией. Так из гемолимфы Manduca sexta был выделен гемагглютинин М 13, образование которого индуцировалось бактериями (Minnick et al., 1986). Показано, что М13 является глюкозоспецифическим лектином, который трансформирует гемоциты и инициирует процесс коагуляции в некоторых популяциях клеток гемолимфы. Лектины с разной углеводной специфичностью, способные индуцироваться при механических повреждениях и во время метаморфоза, были обнаружены у многих насекомых. Так, например из гемолимфы сверчка рода Telleogryllus был выделен лектин, активность которого ингибировалась N-ацетилглюкозамином и N-ацетилгалактозамином (Marmaras, Charalambidis, 1992). Был обнаружен маннозоспе-цифичный лектин BDLI в гемоцитах таракана, инициирующий работу фенолоксидаз-ной системы, играющей важную роль в иммунном ответе (Ratcliffe, Rowley, 1983). Набор клеточных рецепторов, помогающих распознавать чужие клетки, достигает у насекомых высокой степени совершенства (Лахтин, 1987). Наиболее вероятно, что лектины синтезируются как гемоцитами при непосредственном контакте с агглюти-ногеном, так и клетками жирового тела, регуляция которых опосредуется медиаторами клеток гемолимфы и гормонами эндокринной системы, кроме этого активация агглютинирующего фактора может происходить при ограниченном протеолизе исходной формы (Rendland, Boucias, 1985; Jomori, Natori, 1992).
Характеристика биологических объектов исследований
Пчелиная семья представляет собой сложную целостную биологическую единицу. Рабочие пчелы составляют основную часть населения семьи. В семье бывает около 30-80 тыс. рабочих пчел. Наиболее часто используемым критерием для оценки жизнеспособности пчел наряду с выживаемостью используют продолжительность жизни. Продолжительность жизни рабочих пчел зависит от интенсивности работы и обмена веществ. Летом в период главного взятка она не превышает 5-6 недель, в осенний период менее интенсивной деятельности - 7-8 недель. Резко сокращается продолжительность жизни пчел при выращивании большого количества расплода.
Для проведения лабораторных экспериментов пчел, собранных на пасеках, содержали в лаборатории в энтомологических садках 30x30x30 согласно методике, описанной Е.К Еськовым (1990). Учитывая то, что пчелы при взятии из улья и при перевозке подвержены стрессовому воздействию, после пересадки в энтомологические садки в количестве 200-300 особей их выдерживали в лабораторных условиях не менее недели. Основная гибель пчел (порядка 5-10%) происходила в течение первых двух суток. Остальные пчелы жили в садках до 3-х и более недель, при этом сохранялись внутрисемейные поведенческие признаки (трофаллаксис, собирание в клуб, попытки строить сотовые ячейки). Гибель пчел при этом по мере старения была незначительной. Пчел кормили 60% сахарным сиропом и содержали при стандартных условиях (при 23-25С тепла и 18-часовом световом режиме). При постановке каждого эксперимента использовали пчел из одной семьи. Используемая нами методика принята ВНИИ пчеловодства РАСХН (г. Рыбное, Рязанской обл.) при изучении пчел в лабораторных условиях.
Колорадский жук является одним из основных вредителей картофеля практически во всех странах, возделывающих эту культуру. Колорадский жук использовался в качестве модельного объекта, в лабораторных условиях наблюдали скорость смены онтогенетических стадий. Развитие личинок происходит при 18-24С в течение 16-21 дня, при 16-18С - 21-34 дня. За это время личинки 3 раза линяют. Личинка IV возраста после 5-6 дней интенсивного питания зарывается в землю, где образует вначале предкуколку (похожа на личинку 1У возраста, но совершенно неподвижна), затем происходит окукливание. Стадия куколки длится 6-10 дней (Ушатинская, 1981). Для постановки лабораторных экспериментов личинок, отродившихся из собранных с картофельного поля кладок яиц, содержали в стеклянных садках объемом 0,5 дм в количестве 30-40 особей до момента линьки на необходимый для эксперимента возраст согласно методике, описанной Г.В.Беньковской (1990). Личинок кормили свежими листьями картофеля, которые меняли каждый день, и содержали при температуре 25 С и 18-ти часовом световом режиме. В экспериментах использовали личинок всех возрастов первой генерации и личинок 1У возраста второй генерации. При наличии стандартных условий и использовании датированного биоматериала развитие особей носит достаточно синхронный характер, что было необходимо при наблюдении начала смены стадий развития. Комнатная муха (Diptera, Muscidae: Musca domestica L.)
Комнатная муха - широко используемый лабораторный объект для различных исследований. Комнатная муха линии Cooper содержалась в лабораторных условиях в капроновых садках размером 30x30x30 при стандартных условиях (18-ти часовой световой режим и при 25 С) согласно принятой методике ВНИИХСЗР (Рославцева, Вавилова, 1996). Взрослым особям в качестве корма давали сухое молоко, в поилках чистую водопроводную воду. Личинок мух содержали в стеклянных садках емкостью 0,5 дм3 на увлажненных пшеничных отрубях. В экспериментах использовали в качестве модельного объекта личинок комнатной мухи одного поколения из синхронизированных кладок, взятых с разницей во времени откладки яиц не более 4-х часов, преимущественно 2 возраста (3-х суточных). В зависимости от температуры развитие мухи в целом составляет около 20 дней. В экспериментах наблюдали смену стадий развития комнатной мухи.
В качестве объектов исследований были использованы темная лесная (среднерусская) медоносная пчела Apis mellifera mellifera L., личинки комнатной мухи Musca domestica L. и колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say, при этом использовались вышеизложенные базовые условия содержания биологических объектов. Статистическая обработка во всех экспериментах проводилась общепринятыми методами (Лакин, 1980). 2.3.1. Оценка действия хитосахаридов на медоносную пчелу.
Целью эксперимента было выявление наиболее эффективного соединения (хитин, ХОС или АГА) и концентрации для медоносной пчелы. Для этого пчел рассаживали в энтомологические садки из капронового сита 10x10x10 см. Исследуемые вещества в концентрации 0,00001; 0,0001; 0,001 и 0,01% подмешивали в 60%-й сахарный сироп, который давали пчелам. Каждый вариант эксперимента закладывался в двух повторностях по 20 особей в каждой. Контрольных пчел содержали на чистом сахарном сиропе. Эффективность оценивали по выживаемости пчел и продолжительности жизни. При необходимости измерения уровня активности биохимических показателей закладывали по две дополнительные повторности на каждый вариант.
В экспериментах использовали личинок всех возрастов первой генерации и личинок четвертого возраста второй генерации. Личинок при проведении экспериментов содержали в чашках Петри диаметром 10 см при соблюдении стандартных условий содержания, описанных выше. Для использования стандартизированного материала определенного возраста личинок отбирали в лабораторных условиях через сутки после линьки. Корм (верхнюю часть картофельных листьев) и бумажные фильтры, подкладываемые на дно чашек Петри, заменяли ежедневно на свежие. Испытуемые хитосахариды в конц. 0,0001; 0,001 и 0,01% наносили на листья картофеля методом погружения в водный раствор (ХОС и АГА) или суспензию (хитин) на 10 сек. Затем листья слегка подсушивали и скармливали личинкам. Каждый вариант опыта закладывался в 5 повторностях по 10 личинок в каждой. Контрольные особи содержались на необработанных листьях картофеля. При проведении биохимических измерений закладывали по 4 дополнительные повторности на каждый вариант и контроль. Наблюдения проводили ежедневно до завершения цикла развития (появления имаго) колорадского жука, используя в качестве показателей физиологического состояния продолжительность стадий развития (отмечая сроки начала наступления каждой стадии онтогенеза), вьгашваемость особей, массу тела. Вышедших имаго содержали на свежем корме, объединив по вариантам обработки (две повторности по 5 самок и 5 самцов в каждой), в течение 14 суток, при этом регистрировали появление кладок и количество яиц в них.
Преадаптивное действие ХОС при действии экстремальных температур (+50С и +2С)
Насекомые - пойкилотермные животные, поэтому температурный фактор имеет для них большое значение. Температура оказывает значительное влияние на развитие и жизнедеятельность пчелиной семьи (Еськов, 1990), поэтому степень приспособленности насекомых к изменениям температурного режима представляется достаточно важным. В предварительных экспериментах на рабочих пчелах была проведена оценка действия спектра высоких и низких температур на стереотип поведенческих реакций пчел, время наступления холодового и теплового оцепенения, а также выживаемость особей на 7-е сутки после окончания эксперимента. Серия данных экспериментов позволила выбрать две экстремальные температуры и время их действия на пчел так, чтобы наблюдаемые изменения в поведении не происходили слишком быстро, а также для взятия проб для биохимических анализов в течение всего временного интервала.
В эксперименте по изучению адаптивного действия хитосахаридов при действии высокой температуры (+50 С) на пчел, предварительно содержавшихся на сиропе с добавлением ХОС, наблюдалось сохранение нормальной двигательной активности в течение всех 30 мин эксперимента (рис. 3). Добавление в сироп АГА не давало существенных различий с контрольными насекомыми. Действие хитина способствовало продлению уровня нормальных поведенческих реакций пчел до 10 мин, и только начиная с 15 мин у них меняется скорость двигательной активности, отмечаются сует ливые, беспорядочные движения, которые сохраняются на протяжении оставшегося времени действия температурного фактора. После окончания опыта насекомые в течении 5 мин возвращались к норме двигательной активности. Учет на пятые сутки после 30 мин воздействия +50С показал 100% смертность у пчел , получавших с кормом хитин, а в контроле, вариантах с ХОС и АГА в качестве подкормки уровень гибели составил 30, 20 и 10 %% соответственно.
При действии на пчел пониженной температуры (+2 С) отмечали время наступления холодового оцепенения. В контрольном варианте у пчел, получавших с сиропом хитин, замедление двигательной активности отмечали на 15-й мин, а через 20 мин от начала экспозиции пчелы впадали в оцепенение. У насекомых, получавших с сиропом АГА, холодовое оцепенение наблюдали на 15-й мин. ХОС способствовали продлению нормальной двигательной активности до конца эксперимента. После окончания опыта нормальная двигательная активность пчел возвращалась через 5-7 мин. Интересно отметить, что при повторной экспозиции насекомых через 3 ч в том же температурном режиме, пчелы, получавшие ХОС и ранее содержавшиеся при +2С в течение 5 мин не впадали в холодовое оцепенение по прошествии 30 мин, в отличие от всех остальных вариантов, пройдя как бы своеобразную преадаптацию.
Экспонирование нчел при +2 С существенно не отразилось в дальнейшем на жизнеспособности пчел во всех вариантах в течение 10 суток. Насекомые существуют в постоянном контакте с различными микроорганизмами, поэтому несомненный интерес представляло изучение компенсаторного действия ХОС при бактериальном заражении пчел. Представленные на рис.4 результаты эксперимента на медоносной пчеле показали, что после заражения БТБ на 5 сутки в садках выживало только 35 % пчел. Предварительное содержание пчел на сиропе с добавками хитосахаридов в различной степени компенсировало последующее негативное воздействие БТБ. При использовании ХОС выживаемость пчел в эксперименте была практически на уровне контроля.
Отдельный эксперимент, результаты которого представлены в таблице 3, был поставлен на личинках IV возраста колорадского жука. В отношении колорадского жука явным компенсаторным действием обладал АГА и в меньшей степени ХОС. Из данных по средним весам куколок и имаго следует, что хитин и ХОС вызывают некоторые отклонения в процессе накопления массы на стадии куколки, а также у выходящих имаго. Следует отметить, что ускорение развития, вызванное влиянием АГА, не сопровождается существенными потерями веса особей.
Вместе с тем более низкий, чем в варианте с АГА, средний вес имаго в варианте с ХОС и особенно с ХОС+БТБ не сказался на снижении жизнеспособности взрослых особей. Для определения влияния хитосахаридов на онтогенез насекомых использовали модельные объекты: комнатную муху и колорадского жука. Было установлено (рис 5), что добавка хитосахаридов в корм личинок комнатной мухи и колорадского жука оказывала влияние на время развития насекомых. Для данного эксперимента использовали датированный биоматериал, поэтому развитие личинок при стандартных условиях содержания (+25 С и 18-ти часовой световой режим) было синхронным. В эксперименте с комнатной мухой использовали личинок из кладок, взятых с разницей во времени откладки не более 4-х часов. А в эксперименте с колорадским жуком использовали личинок второй генерации, отобранных в лабораторных условиях через сутки после линьки на четвертый возраст. В эксперименте фиксировали начало линьки на следующую стадию развития насекомо го.
Влияние хитосахаридов на биохимические процессы у насекомых при действии БТБ
Устойчивость к инфекционным заболеваниям или врожденный иммунитет имеет общие для многих насекомых защитные механизмы и характеризуется неспецифичностью или универсальностью, которая обеспечивает защиту против многих патогенных микроорганизмов и разнообразных неблагоприятных внешних факторов. Врожденный иммунитет не является абсолютным, поэтому воздействие на факторы, составляющие его основу, при помощи модуляторов позволят влиять на тонкие механизмы устойчивости насекомых. Многочисленные исследования как зарубежных, так и отечественных ученых дают основание считать фенолоксидазный каскад, центральным действующим звеном которого является сумма моно- и дифенолоксидазной активности, одним из значительных биохимических механизмов, обеспечивающих высокую скорость иммунных реакций и специфичность распознавания патогенов, (Ashida, Yoshida, 1988; Ashida, 1990; Ratcliffe et al., 1991; Sugumaran et al., 1992; Pay-шенбах, 1997). В работах И.Ю. Раушенбах с соавторами (Раушенбах и др.,1993; Raushenbach et al., 1995; Раушенбах, 1997) отчетливо продемонстрирована роль моно-и дифенолоксидаз насекомых как неотъемлемой части неспецифической реакции на стрессовую нагрузку любого происхождения в онтогенезе.
У личинок мух, получавших с отрубями хитин и АГА, активность ФО системы была выше, чем в контроле, причем в варианте с хитином почти в 2 раза. Активность ФО у насекомых, получавших с кормом ХОС и БТБ, а также хитин с последующим действием БТБ, практически ничем не отличалась от активности в контроле. И лишь последние два варианта показали некоторое увеличение активности. У новообразованных куколок мух наблюдалось повышение активности в вариантах с АГА, БТБ и хитин+БТБ почти в 2-3 раза в сравнении с контролем и примерно во столько же раз снижение в варианте с АГА+БТБ. При сравнении веществ наиболее стабилизирующим активность фермента действием у личинок и у куколок проявили себя ХОС. При дополнительном действии бакпрепаратом пчел, получавших ХОС, происходило повышение активности ФО, но при смене личиночной стадии развития на куколку происходит выравнивание активности соответственно контрольному уровню, в отличие от других вариантов.
При использовании другого модельного объекта (колорадского жука) мы получили возможность измерять динамику активности ФО системы в течение нескольких суток после действия бакпрепаратом у одних и тех же личинок 1У возраста при жизни, проводя у них забор гемолимфы. Личинок таюке в течение трех суток кормили картофельными листьями, обработанными хитосахаридами в концентрации 0,001%, затем подсаживали на листья, обработанные БТБ (конц. 0,1%). Уже через 4 часа после действия БТБ у личинок активность ФО повысилась почти в 14,5 раз по сравнению с контролем (табл. 10). Почти во столько же увеличилась активность фермента у личинок получавших АГА до воздействия БТБ, у личинок, получавших ранее ХОС активность превышала контрольный уровень в 10,5 раз. У личинок же, содержавшихся на листьях, обработанных хитином, после заражения бакпрепаратом активность ФО выросла почти в 29 раз по отношению к контролю. В вариантах с подкормкой хитином и АГА активность ФО по отношению к контролю возрастала в 7 раз, а в варианте с ХОС активность выросла всего лишь в 1,5 раза.
Пробы гемолимфы, взятые у личинок, после действия БТБ, через сутки показали некоторое снижение активности ФО. В вариантах с подкормкой хитином и ХОС активность ФО у личинок, обработанных БТБ, увеличилась, а в варианте с подкормкой АГА активность ФО снизилась. Показательно, что у незараженных личинок активность ФО через 24 часа во всех вариантах увеличилвсь.
В варианте с хитин+БТБ активность фермента несколько снизилась, но по-прежнему превышала контрольный уровень в 4 раза. В варианте с ХОС наблюдали повышение активности ФО в 2,9 раза по отношению к контролю и в 2,3 раза по сравнению с 4-х часовой пробой, в последнем варианте (АГА+БТБ) активность в приблизилась к контрольному уровню. Через 3-е суток в варианте с хитином активность по прежнему превышала контрольный уровень почти в 2,5 раза, активность варианте с ХОС незначительно превышала контроль, а в варианте с АГА понизилась по сравнению с суточным измерением почти в 2 раза и в 1,5 раза по отношению к контролю. При сравнении динамики активности ФО в вариантах с хитином и ХОС можно отметить постепенный ее рост, а в вариантах с АГА и БТБ увеличение активности сопровождается дальнейшим спадом и наоборот. В вариантах, где личинки предварительно перед заражением бакпрепаратом получали хитодобавки, динамика активности также изменяется (рост активности в течение суток сопровождается дальнейшим спадом и наоборот). Наблюдая рост активности ФО при действии хитосахаридов и БТБ в обоих экспериментах, можно предположить, что они индуцируют сходные механизмы защиты при действии патогенных микроорганизмов, усиливая антибактериальный ответ гемоцитов посредством увеличения интернализации с ними липополисахаридов бактерий.
