Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из актуальных проблем экологии, в связи с ростом количества заражений хантавирусными инфекциями, является изучение взаимоотношений вирусов с популяциями их хозяев. Хантавирусы относятся к семейству буньявирусов, распространены практически по всему свету, переносятся мышевидными грызунами и способны вызывать у человека опасные заболевания, иногда с летальным исходом: геморрагическую лихорадку с почечным синдромом и хантавирусный пульмонарный синдром.
Геном хантавирусов представлен сегментированной РНК отрицательной полярности. Неточность работы РНК-зависимой РНК-полимеразы и отсутствие системы репарации РНК у вирусов приводит к формированию квазивида – множеству генетически не идентичных вирусов одного генотипа, с разной приспособленностью, конкурирующих между собой в процессе микроэволюции в клетках хозяина (Quasispecies structure and persistence of RNA viruses / E.E. Domingo [et al.] // Emerg. Infect. Dis. 1998. Vol. 4. P. 521-527). Иммунная система хозяина, организм которого является средой обитания возбудителя, направляет микроэволюцию вирусов. При изменении среды обитания вирусов - изменении иммунной реакции организма-хозяина или передаче другому хозяину, один квазивид сменяется другим, несколько отличающимся от предыдущего. Таким образом, в группах контактирующих между собой организмов-хозяев, формируются постоянно эволюционирующие и смешивающиеся вирусные популяции, на свойствах которых основана современная классификация вирусов, вводящая для хантавирусов понятие «генотип» аналогичное понятию «вид» у более сложных организмов.
Эволюция хантавирусов тесно связана с эволюцией их хозяев-грызунов, что отражается в структуре филогенетических деревьев, построенных по генетическим последовательностям тех и других. Эти деревья имеют звездчатое строение (Plyusnin A., Vapalahti O., Vaheri A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution // J. of General Virology. 1996. Vol. 77. P. 2677-2687), показывающее древнее происхождение хантавирусов, связанное с процессами видообразования у хозяев. Считалось, что генетические расстояния между ветвями этих деревьев у хантавирусов, в пределах одного и того же генотипа, зависят от степени географической удаленности отдельных изолятов. Однако, в последнее время, были обнаружены факты, противоречащие этому мнению, а так же поставлен вопрос об изменении классификационных критериев при выделении вирусных геновариантов (подвидов), в связи с большей изменчивостью нуклеотидных последовательностей в пределах одного и того же генотипа, чем это допускается нормами международного комитета по таксономии вирусов (Plyusnin A. Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy. Brief Review // Arch. Virol. 2002. Vol. 147. P. 665–682). Большинство таких несоответствий наблюдается при смене вирусом хозяев, что показывает необходимость изучения механизмов изменчивости вирусов, обусловленных особенностями взаимодействия с организмом хозяина.
Вирусы гаплоидны и размножаются бесполым путем. При этом типе размножения внутрипопуляционные генетические связи могут отсутствовать. Однако, при наличии способности к рекомбинации, может реализовываться эпизодический внутрипопуляционный генетический обмен, что приводит к образованию новых рекомбинантных клонов. Основным механизмом изменчивости генома хантавирусов считается возникновение точечных замен. Для некоторых хантавирусов, кроме того, предполагается наличие реассортации и обмен фрагментами гомологичных сегментов генома в результате рекомбинации (Transfection-mediated generation of functionally competent Tula hantavirus with recombinant S RNA segment / A. Plysnin [et al.] // The EMBO Journal. 2002. Vol. 21. N 6. P. 1479-1503; Sironen T., Vaheri A., Plysnin A. Molecular Evolution of Puumala Hantavirus // J. of virology. 2001. Vol. 75. N 23. P. 11803–11810). К моменту начала исследования, возможность гомологичной рекомбинации у хантавирусов была показана только в пределах S-сегмента для генотипа Тула (Recombination in Tula Hantavirus Evolution: Analysis of Genetic Lineages from Slovakia / C. Sibold [et al.] // J. of Virology. 1999. Vol. 73. N 1. P. 667-675). Поэтому, было целесообразным исследовать распространенность механизма гомологичной рекомбинации и у других хантавирусов.
Влияние рекомбинации на внутрипопуляционные процессы может быть разнообразным и приводить к результатам, зависящим от характеристик самой популяции вирусов, от возможности смешанной инфекции, от жизнеспособности мутантных клонов, от действия (или отсутствия) отбора и т.д. Анализ влияния гомологичной рекомбинации на эволюцию вирусов уже проводился (Tajima F. N., Takezaki N. Estimation of Evolutionary Distance for Reconstructing Molecular Phylogenetic Trees // Mol. Biol. Evol. 1994. Vol. 11, N 2. P. 278-286). Однако недостаточная изученность механизмов изменчивости у большинства хантавирусов ограничивала область исследования. Поэтому, возникла необходимость более углубленного изучения проблемы, и построения, по возможности, более точной модели этих процессов.
Изучение микроэволюции большинства РНК-вирусов в настоящее время проводится с использованием математических и имитационных моделей (Wilke C.O. Quasispecies theory in the context of population genetics [Электронный ресурс] // BMC Evolutionary Biology. 2005. Vol. 5. N 44. URL: www.biomedcentral.com/1471-2148/5/44 (дата обращения: 04.10.09)), в которых представлена микроэволюция нуклеотидных последовательностей вирусов, формирующих квазивид. К началу нашего исследования, моделирование микроэволюционных процессов у хантавирусов не проводилось, поэтому построение модели было необходимо, так как позволяло оценить роль различных механизмов изменчивости и понять направленность процессов формообразования в данной группе вирусов, а также эволюционные ограничения, накладываемые на вирусную популяцию взаимодействием с организмом хозяина.
Соответствие темы диссертации требованиям Паспорта специальностей ВАК Министерства образования и науки РФ. Диссертационное исследование выполнено в рамках специальности 03.00.16 экология и соответствует п.2 «Популяционная экология» Паспорта специальностей ВАК Министерства образования и науки РФ.
Цель исследования – Выявить эколого-генетические механизмы изменчивости геномов хантавирусов и исследовать их влияние на процессы микроэволюции в популяциях хантавирусов, ограниченных по численности.
Задачи исследования:
-
Проанализировать изменчивость генома хантавирусов в пределах отдельного генотипа в связи с особенностями географического распространения и взаимодействия с видом хозяина.
-
Выявить структурные особенности генетических последовательностей, влияющие на изменчивость генома, возникающую в процессе приспособления к организму хозяина, у наиболее распространенных хантавирусов Старого Света.
-
Применить имитационную модель микроэволюции ограниченной по численности популяции хантавирусов для оценки направленности эволюционного процесса, связанной с действием выявленных механизмов изменчивости генома хантавирусов и структурными особенностями генома.
Научная новизна. Впервые выполнен сравнительный статистический анализ консервативности первичной структуры S и M сегментов генома хантавирусов генотипов Старого Света. Впервые показана возможность гомологичной рекомбинации у хантавирусов Пуумала и Хантаан. Показано существование коррелированных нуклеотидных замен в S - сегментах генотипов Тула, Пуумала, Хантаан, Добрава/Белград. Разработан алгоритм поиска гомологичных рекомбинаций в массиве выровненных нуклеотидных последовательностей с применением метода вычисления значений взаимной информации. Впервые проведено имитационное моделирование микроэволюции хантавирусных последовательностей, учитывающее возможность осуществления гомологичной рекомбинации и существование связанных нуклеотидных замен в S - сегменте, позволившее охарактеризовать влияние этих механизмов изменчивости на микроэволюцию ограниченной по численности популяции хантавирусов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные, раскрывают действие некоторых эколого-генетических механизмов микроэволюции хантавирусов Старого Света, влияющих на изменение приспособленности вирусов к организму хозяев-грызунов, расширяют и углубляют представления о процессах, происходящих в вирусных популяциях. Результаты исследования могут быть использованы при уточнении классификационных критериев хантавирусов, создании вакцин, в медицинской практике, в дальнейшей научно – исследовательской работе.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном отборе и обработке данных о хантавирусах Старого Света и их генетических последовательностях, разработке и тестировании методов анализа нуклеотидных последовательностей хантавирусов (методы поиска случаев гомологичной рекомбинации и наличия коррелированных замен нуклеотидов), создании имитационной модели микроэволюционных процессов в пределах вирусного квазивида, написании компьютерных программ, реализующих эти методы, формировании научных положений и выводов.
Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены значительным объемом анализируемого материала, применением современных методов исследований и подтверждением их методами математической статистики.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
-
Современное распределение геновариантов хантавирусов сформировалось в результате совокупности процессов расселения хозяев (исторический аспект) и распространения хантавирусов в их популяциях (экологический аспект) с учетом возможности переключения вируса на нового хозяина.
-
Приспособительные механизмы изменчивости у хантавирусов включают в себя не только накопление точечных замен нуклеотидов, но и возможность гомологичной рекомбинации.
-
Наличие гомологичных рекомбинаций в процессе микроэволюции хантавирусов приводит к ускоренному накоплению приспособительных изменений, что повышает вероятность выживания ограниченной по численности вирусной популяции.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней» (г. Омск: 2001); конференции, посвященной 70-летию изучения хантавирусов на Дальнем Востоке (г. Владивосток, 2003); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири.» (г. Омск, 2008); конференции, посвященной 70-летию медико-профилактического факультета ОГМА (г. Омск, 2008); республиканской конференции, посвященной 70-летию учения Е. Н. Павловского о природной очаговости болезней (г. Омск, 2009).
Организация исследований. Работа выполнялась в период с 2001 по 2007 гг. в Омской Государственной Медицинской Академии и ФГУН Омск НИИПОИ Роспотребнадзора.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (235-источников, из них 206 - зарубежных). Материалы изложены на 135 листах компьютерного текста. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 11 таблицами.
