Содержание к диссертации
Введение
1. Биология пиленгаса и принципы анализа популяционной структуры рыб 8
1.1. Биологическая характеристика пиленгаса 8
1.2. Предпосылки и история вселения пиленгаса в Азово-Черноморский бассейн 23
1.3. Факторы, определяющие генетическую гетерогенность популяций 26
1.4. Принципы анализа гетерогенности популяций 37
2. Район, структура исследования и применяемые методы 51
2.1. Структура и материал исследования 51
2.2. Морфометрический анализ пиленгаса 55
2.3. Дискриминантный анализ морфометрических индексов 56
2.4. Электрофорез белков 57
2.5. Методы гистохимического окрашивания 63
2.6. Параметры аллозимной изменчивости и биометрические методы.. 68.
3. Анализ морфометрическои изменчивости популяции пиленгаса в зависимоти от солености 72
3.1. Общая характеристика и выделение информативного комплекса морфометрических индексов пиленгаса 72
3.2. Анализ изменчивости морфометрических индексов пиленгаса в различных экологических условиях 75
3.3. Анализ субпопуляционных групп по комплексу морфометрических признаков 80
3.3.1. Выявление фенотипических структурных компонентов популяции и их анализ 81
3.3.2. Проверка обоснованности полученных решений 91
4. Биохимическая генетика пиленгаса 93
4.1. Характеристика исследованных белковых систем 93
4.2. Полиморфизм белков и генетическая изменчивость 99
4.3. Эколого-генетические различия пиленгаса в акватории Азовского моря и прилегающих водоемов 103
5. Различия между дальневосточной и интродуцированной азовской опуляциями пиленгаса 114
5.1. Особенности генетической структуры дальневосточной и азовской популяций пиленгаса 114
5.2. Снижение генетического разнообразия пиленгаса в результате интродукции в Азовское море: эффект «бутылочного горлышка» 116
6. Адаптивная радиация популяции пиленгаса в азовском море в современный период 123
Выводы 128
Литература 130
- Предпосылки и история вселения пиленгаса в Азово-Черноморский бассейн
- Морфометрический анализ пиленгаса
- Анализ изменчивости морфометрических индексов пиленгаса в различных экологических условиях
- Эколого-генетические различия пиленгаса в акватории Азовского моря и прилегающих водоемов
Введение к работе
Актуальность темы. Принципы и способы адаптации популяций к изменяющейся среде обитания составляют фундаментальную проблему экологии и эволюции видов организмов. Поэтому изучение механизмов адаптации рыб к новым экологическим условиям при искусственном вселении является важной теоретической и прикладной задачей. Перспективным объектом для исследований такого рода является дальневосточный пиленгас Mugil soiuy Bas. (Liza haematoeila Temminck & Shlegel), вселенный в Азовское море, который проявил уникальный адаптационный потенциал в новом ареале. Интродукция дальневосточного пиленгаса в Азовское море проводилась в 1978 - 1984 годах. Взрывной характер развития популяции пиленгаса вывел его на третье место по биомассе в море (после тюльки и судака). С 1992 года он был включен в число промысловых рыб бассейна, а с 1993 начался его промышленный лов.
Изучение морфолого-генетических механизмов формирования популяции пиленгаса в Азовском море позволяет уяснить некоторые теоретические аспекты адаптации при вселении видов в новые условия обитания. В прикладном аспекте это исследование будет способствовать оптимизации промысла пиленгаса в различных частях нового ареала. Изучение особенностей адаптации субпопуляций пиленгаса в широком диапазоне солености Азовского моря даст возможность учитывать их при подборе молоди для эффективного искусственного выращивания в прудах.
До последнего времени работы по экологическим аспектам генетического полиморфизма и морфологической изменчивости азовской популяции пиленгаса в отечественной и зарубежной литературе отсутствовали.
Цель и задачи исследований. Основная цель работы - изучить структуру популяции пиленгаса в экологических условиях нового ареала (Азовского моря) с помощью методов системного морфометрического анализа и биохимической генетики.
Для ее достижения были сформулированы следующие задачи:
дать характеристику изменчивости азовской популяции пиленгаса по морфо-метрическим признакам;
изучить структуру популяции пиленгаса по морфометрическим индексам и ее пространственно-временную изменчивость в связи с фактором солености;
провести поиск полиморфных белковых систем для эколого-генетического мониторинга и характеристики генетической изменчивости популяции пиленгаса;
изучить изменчивость популяции пиленгаса по полиморфным белковым системам и ее связь с фактором солености;
провести сравнительный анализ генетической структуры дальневосточной и азовской популяций пиленгаса;
дать характеристику процесса адаптивной радиации пиленгаса в Азовском море в современный период.
Научная новизна исследований. Впервые изучена внутрипопуляционная структура пиленгаса в Азовском бассейне. Предложена схема морфометрического описания пиленгаса, отвечающая задачам эколого-генетического исследования популяций. Выделены молекулярные маркеры внутрипопуляционной изменчивости. Определены различия генетических характеристик пиленгаса из исходного ареала и
- - -ДИиНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург О) А [
ареала вселения. Установлено значение фактора солености в формировании его внутрипопуляционной структуры в изучаемом ареале (Азовском море).
Практическое значение полученных результатов. Предложен комплекс морфометрических промеров пиленгаса и выявлены молекулярные маркеры для выделения внутрипопуляционных групп в целях эколого-генетического мониторинга его промысловых стад и отбора в природе молоди для искусственного разведения.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на симпозиуме "Экологические и функциональные основы адаптации гидробионтов" (Санкт-Петербург, 2000); VIII съезде гидробиологического общества РАН (Калининград, 2001); на международной научной конференции "Проблемы сохранения экосистем и рационального использования биоресурсов Азово-Черноморского бассейна" (Ростов-на-Дону, 2001); на всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 140-летию со дня рождения Н.М. Книповича (Мурманск, 2002); на международной конференции "Эволюция морских экосистем под влиянием вселенцев и искусственной смертности фауны" (Ростов-на-Дону, 2003); на международной конференции "Проблемы естественного и искусственного воспроизводства рыб в морских и пресноводных водоемах" (Ростов-на-Дону, 2004); на методическом совете НИИ биологии РГУ; на международной конференции по современным проблемам физиологии и биохимии водных организмов (Петрозаводск, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 29 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (гл. 1), материалов и методов исследования (гл. 2), результатов исследований и их обсуждения (гл. 3-6), выводов, практических рекомендаций. Список цитируемой литературы включает 189 наименований, в том числе 50 работ на иностранных языках.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Соленость среды является важным экологическим фактором изменчивости пиленгаса по комплексу морфологических признаков.
-
Уровень генетической дифференциации пиленгаса в Азовском море выше, чем в исходной дальневосточной популяции. Соленость может иметь существенное значение как фактор адаптивной дифференциации пиленгаса в новом ареале.
-
Число выявленных аллелей в популяции пиленгаса Азовского моря снижено по сравнению с дальневосточной. Основной причиной этого является ограниченное число основателей, положивших начало популяции в новом ареале.
-
В азовской популяции пиленгаса происходит процесс формирования внутрипопуляционной структуры как адаптации вида к широкому спектру солености в новом для него ареале за счет процессов селективной миграции и отбора.
Предпосылки и история вселения пиленгаса в Азово-Черноморский бассейн
Пиленгас, издавна известный рыбакам на Дальнем Востоке, долгое время не привлекал внимания исследователей. Ежегодный вылов этой сравнительно небольшой по размерам рыбы не превышал 500 тонн (Мизюркина, 1982). Впервые на возможность его акклиматизации в южных морях СССР обратил внимание изучавший этот вид профессор Б.Н. Казанский. Он отметил ряд особенностей биологии пиленгаса, которые с хозяйственной точки зрения выгодно отличали его от черноморских видов кефалей, в частности его эвритермность. Эти наблюдения позволили ему рекомендовать пиленгаса для акклиматизации сначала в Аральском и Каспийском морях, а затем в Азово-Черноморском бассейне (Казанский, 1966, 1971). Предложение Б.Н. Казанского было воплощено в жизнь в Азово-Черноморском бассейне. Пиленгас не только прижился в Черном и Азовском морях и приобрел здесь заметное место в промысле, но и успешно расширяет свой новый ареал в направлении Средиземного моря (Unsal, 1992; Koutrakis, Stavros, 2000).
С самого начала работы по акклиматизации пиленгаса велись в двух направлениях - пастбищного рыбоводства и создания в естественных условиях самовоспроизводящейся популяции. В 1971 году было привезено и выпущено в два солоноватоводных пруда Херсонской области 310 годовиков массой 6,8-23 г. Осенью было выловлено около трети от общего количества выпущенных рыб (Финько, Сверба, 1973).
Для создания естественной популяции пиленгаса в Черном море в его северо-западную часть в районе Днестровского лимана было выпущено 7,1 тыс. сеголетков и годовиков пиленгаса, доставленных в 1972-1974 годах семью партиями в Одесскую область из устья дальневосточной реки Суходол. На протяжении последующих трех лет (1973-1975) двух- трех- и четырехлеток пиленгаса периодически ловили в северо-западной части Черного моря, от Днестровского лимана до южной оконечности Крыма (Старушенко, 1977). В тот же период в Хаджибейский, Тилигульский, Тузловский лиманы в этом районе было выпущено еще 22,4 тыс. сеголеток (годовиков) длиной 2,8-10,5 см и массой 0,3-14,1 г (Казанский, Старушенко, 1980; Орлов, Овчинников, 1991; Орлов, 1997). Условия для летнего нагула, зимовки и созревания пиленгаса в них оказались благоприятными. Рыбы быстро росли и созревали (Старушенко, 1977; Семененко, 1991).
В 1975 г. в Шаболатском лимане была поймана одна самка с гонадами на стадии выбоя, однако молоди от естественного нереста пиленгаса обнаружено не было (Старушенко, 1977).
Суммируя сказанное, можно констатировать, что первые работы по акклиматизации пиленгаса в бассейне Черного моря в течение семи лет не привели к его натурализации и в 1978 году были приостановлены (Казанский, Старушенко, 1980). В том же году были развернуты аналогичные мероприятия на Азовском море. Пиленгаса, отловленного в низовьях рек Амурского и Уссурийского заливов Тихого океана, перевозили авиатранспортом в г. Бердянск или г. Ростов-на-Дону. Всего за период с 1978 по 1984 годы специалистами Ростовской производственно-акклиматизационной станции (РПАС) было перевезено с Дальнего Востока в Азовский бассейн 12700 шт. молоди и 158 шт. особей пиленгаса старших возрастов (справка РПАС).
В сентябре 1978 года в крупный полузакрытый Молочный лиман (Северо-Западное Приазовье), соленость которого выше, чем в Азовском море, было выпущено 2100 отловленных в Амурском заливе сеголетков пиленгаса. Длина молоди колебалась от 5,5 до 7 см, масса от 1,5 до 6 г. Привезенная молодь успешно перезимовала. Отхода отмечено не было. При свободном нагуле в искусственном песчаном карьере пиленгас за лето 1979 г. достиг массы 300 г. В 1980 г. в лиман было привезено и содержалось в садках при искусственном кормлении еще 160 экз. молоди пиленгаса массой 2,8 г. За 2,5 месяца содержания масса годовиков увеличилась до 100 г. (Семененко, Кудлина, 1982).
По данным Л. И. Семененко (1991), естественный нерест пиленгаса в Молочном лимане начался с 1982 года. За последующее десятилетие нерестовая часть его популяции многократно увеличилась, количество самок, из. которых в нересте принимало участие от 50 до 80 %, возросло, по мнению автора, с 200 в 1982 году до 8,5 млн. особей в 1992 году, то есть более чем в 40 тыс. раз, а популяционная плодовитость повысилась с 117,5 млн. до 850 млрд. икринок. Особой урожайностью выделилась нерестовая ситуация 1989 года. Поколение молоди этого года ориентировочно оценено в 300 млн. шт.
В результате проведенных акклиматизационных и рыбоводных работ в 1989 году в Азовском море были обнаружены первые массовые скопления сеголетков, свидетельствующие о массовом естественном нересте пиленгаса собственно в Азовском море. Численность его популяции быстро увеличилась, и он расселился по всей акватории моря, включая заливы, лиманы, а также реки северного побережья Азовского моря (Семененко, 1991; Чесали-на, Чесалин, 2001). По сведениям Т.Л.. Чесалиной (1997), в 1989-1990 годах впервые стали происходить миграции пиленгаса из Азовского в Черное море. В конце мая - начале июня 1993 г. нерест пиленгаса отмечали в южной части Керченского пролива в районе мысов Такиль и Панагия и на предпроливном участке Черного моря (Любомудров, 1994), а в 1996 году был впервые отмечен его заход в бухты Севастополя. В этом же году здесь был установлен факт нереста пиленгаса в открытом море в 1,5-10 км от берега при глубине в. местах сбора живой икры до 100 м (Чесалина, 1997).
Морфометрический анализ пиленгаса
Измеряли 22 пластических признака пиленгаса по общепринятой методике (Правдин, 1966). Схема измерений приведена на рисунке 2.3 и в таблице 2.2. Все признаки были преобразованы в индексы, которые выражают вели-. чину каждого признака в долях единицы по отношению к длине рыбы (ad) или к длине головы (для признаков головы).
При исследовании различий между классами выборок использовали дискриминантный анализ. Основная статистическая процедура дискрими-нантного анализа состоит в вычислении канонических дискриминантных функций. Эта функция является линейной комбинацией дискриминантных переменных и имеет следующий вид: fkm = Щ + UjXikm + U2X2km ++ UpXpkm, гдеУь, - значение канонической дискриминантной функции для т-го объекта в группе к; Хам - значение дискриминантной переменной Xj для т-го объекта в группе к; щ - коэффициенты.
Коэффициенты первой функции выбираются таким образом, чтобы ее средние значения для различных классов максимально отличались. Коэффициенты второй функции выбираются так же, при этом ее значения не коррелируют со значениями первой функции. Максимальное число дискриминантных функций равно числу исследуемых классов без единицы (Ким Дж.-О., Мьюллер Ч.У. и др., 1989). Анализ двух классов дает одну дискриминантную функцию, трех классов - две и т.д. Статистические расчеты проводили с использованием программ MS Excel и Statistica.
Для выявления белкового полиморфизма использовали методы электрофореза в блоках полиакриламидного геля (ПААГ) и крахмального геля (КГ). Анализ проводили в отделе генетико-биохимического мониторинга АзНИИРХ, а также в лаборатории популяционной генетики Института общей генетики РАН.
В АзНИИРХ были проанализированы образцы сыворотки крови и мышечной ткани из выборок, показанных в таблице 2.1. под номерами 2, 6 и 7; в ИОГен-е - образцы тканей печени и мышц из выборок, показанных под номерами 3, 4 и 9. Методики проведения анализов в двух институтах несколько различались.
В отделе генетико-биохимического мониторинга АзНИИРХ анализ проводили по следующей методике. Сыворотку крови использовали для электрофореза без дополнительной подготовки. Для экстракции белков из мышц их пробы объемом 0,5 см предварительно гомогенизировали в равном объеме 40% сахарозы. Гомогенаты центрифугировали 15 мин при 7000 g, затем отбирали супернатант, помещали его в герметично закрытые полиэтиленовые пробирки и замораживали в морозильнике.
Диск-электрофорез в ПААГ проводили, используя прибор, который позволяет одновременно анализировать 50 образцов в гелевом блоке с размерами 300x75x2 мм (Короленко, Дехта, 1981). Для этого была применена с небольшими модификациями методика, описанная в руководстве Г. Маурера (1971). Для приготовления ПААГ использовали буферные растворы, представленные в таблице 2.3.
При приготовлении растворов сополимеров разделяющих гелей различных концентраций использовали соотношения акриламида МБА и воды, показанные в таблице 2.4.
Растворы сополимеров готовили непосредственно перед использованием. Для приготовления разделяющего геля 20 мл соответствующего раствора сополимеров смешивали с 10 мл буферного раствора № 1 или № 2 и 30 мл 0,13 % раствора персульфата аммония (ПСА). Конечный объем смеси составлял 60 мл. В качестве концентрирующего геля использовали 4% ПААГ, приготовленный на буферном растворе № 3 в сочетании с буферным раствором № 1 разделяющего геля, или на буферном растворе № 4 в сочетании с буферным раствором № 2 разделяющего геля.
В качестве электродного буфера использовали трис-глициновый буферный раствор с рН = 8,3 следующего состава: трис - 0,4 г, глицин - 2,88 г, вода-до 1000 мл.
Для разделения белков в ячейку наносили по 5-10 мкл пробы. Для лучшего разделения белков создавали оптимальный тепловой режим с помощью охлажденного до 4 С электродного буферного раствора. Плотность тока на начальном этапе электрофореза составляла 4-5 мА/см . После прохождения полосы "свидетеля" бромфенолового синего через концентрирующий гель плотность тока устанавливали равной 14-16 мА/см . Электрофорез останавливали по достижении фронтом "свидетеля" нижней кромки гелевого блока. Время разделения в зависимости от используемых буферных систем составляло от 45 до 120 минут. Буферные системы и гели, применявшиеся при электрофорезе ферментов и миогенов, приведены в таблице 2.5.
Анализ изменчивости морфометрических индексов пиленгаса в различных экологических условиях
Структура средних и корреляций индексов в выборках. Использование нормированных к длине рыбы признаков (индексов) позволяет нивелировать существенную часть влияния среды и различий в темпе роста (Черепанов, 1986). В сущности, индексы отображают аллометрические характеристики в пределах нормы реакции вида. Поэтому представляется важным сравнить как средние их величины, так и корреляционную структуру в выборках пиленгаса. На рисунке 3.1 показана степень варьирования и различий индексов по выборкам. Из него видно, что индексы в большинстве случаев хорошо различаются. Анализ различий по /-критерию показывает следующую картину. Выборка из Азовского моря достоверно отличается от выборки из Керченского пролива только по индексу ро, а от выборки из оз. Ханское — по всем индексам. Различия между Керченским проливом и оз. Ханское также высокодостоверны по всем индексам, за исключением .
Более информативным показателем различий в характере индивидуального развития организмов в группах является корреляционная структура индексов, которая отражает тенденции аллометрического роста в пределах нормы реакции. В таблице 3.3 приведены коэффициенты корреляции между индексами. По выборкам число значимых корреляций варьировало от 3 до 5.
Графическое представление значимых связей между признаками дает более наглядную картину различий между выборками пиленгаса (рисунок 3.2). Наблюдаемые различия в системе корреляций индексов отражают групповые особенности пиленгаса, обитающего в акваториях разной солености. Этот факт является важным для дальнейшего исследования структуры популяции. Система связей индексов является категорией группы особей и доступна для изучения только на группе. Однако ее реализация опосредована через индивидуальные соотношения индексов у каждой особи в группе. Путь к определению положения каждой особи относительно других в группе и самих групп относительно друг друга открывается посредством построения линейных комбинаций в дискриминантном анализе.
Анализ различий между выборками по многомерному комплексу индексов. Различия в системе средних значений индексов и их корреляций между группами пиленгаса позволяет перейти к анализу групп по многомерному комплексу индексов. В данном случае дискриминантный анализ представляется оптимальным методом для решения этой задачи. Построение линейной комбинации морфометрических индексов (дискриминантной функции), которая максимизирует различия между группами пиленгаса из акваторий различной солености относительно внутригрупповых, дает возможность оценить различия между выборками в целом. Анализ проводили по тем же шести индексам, которые были выделены как наиболее информативные. В результате были получены две канонические дискриминантные функции (КДФ) следующего вида: КДФі = -0,265/70-1,046ao+0,212gh+0,S42ik±0,266fd-0,395tu+27,0S9 КДФ2 = 0,556po-0,5\9ao+0,073gh+0,26\ik+0,077fd-0,267tu-22,26\
Первая из них описывает 71,9% общей дисперсии, вторая - 28,1%. Распределение выборок пиленгаса в пространстве этих функций показано на рисунке 3.3. Масштаб осей рисунка отражает вклад дискриминантных функций в описываемую дисперсию.
Эколого-генетические различия пиленгаса в акватории Азовского моря и прилегающих водоемов
Частоты генотипов особей из исследованных выборок пиленгаса, в последующем использованные нами для выявления генетических различий между этими группами, по разным локусам и выборкам варьировало от двух до одиннадцати. Соответствие наблюдаемых частот ожидаемым в предположении равновесия Харди-Вайнберга рассчитывалось нами с помощью теста х Вероятность такого соответствия приведена в таблице 4.4. Представленные в ней данные свидетельствуют о том, что в подавляющем большинстве выборок наблюдаемые частоты фенотипов соответствуют теоретическим. Исключение составляют частоты аллелей локуса Му-9 выборки из оз. Ханское и частоты аллелей локуса МЕР выборки из Азовского моря. В первом случае наблюдается избыток гетерозиготных вариантов, во втором - их недостаток. При анализе данных таблицы просматривается тенденция к меньшему соответствию частот аллелей особей из Азовского моря по сравнению с Керченским проливом и оз. Ханское.
Анализ частот аллелей полиморфных локусов показывает большую степень изменчивости этого параметра (Табл. 4.5). Так,, частота аллеля а преальбумина составляет в выборке из оз. Ханское 0,613, примерно столько же (0,662) среди пойманных в Азовском море рыб, и почти в три раза меньше при анализе выборки рыб из Керченского пролива - 0,245. Примером постепенного изменения частот аллелей может служить локус МЕР . Частота его наиболее распространенного аллеля составляет в упомянутом выше направлении: от 0,560 в оз. Ханское до 0,720 в Керченском проливе с промежуточным значением 0,670 в Азовском море. Но не всегда частоты аллелей в выборке пиленгаса из Азовского моря занимают промежуточные значения, например, по локусу эстеразы Д частота наиболее распространенного аллеля составляет 0,837, заметно превосходя обе другие группы пиленгаса.
В таблице 4.6, где представлены значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности из разных выборок пиленгаса, мы наблюдаем различные соотношения между этими показателями. В этом ряду выборок из разных мест обитания гетерозиготность может как возрастать (sAAT-2 ), так и сни- жаться (МЕР ) или подчиняться другим закономерностям (pAlb , FDHG , ADH ). Но в среднем гетерозиготность выборки из Азовского моря несколько ниже, чем выборок оз. Ханское и Керченского пролива. Возрастание гетерозиготности в рассматриваемом ряду во многом отражает снижение частоты
Наглядно различия в гетерозиготности по исследованным полиморфным локусам представлены на рисунке 4.5, из которого видно, что в подавляющем большинстве случаев гетерозиготность по исследованным полиморфным локусам принимает максимальные значения в выборках из мест обитания с наибольшей и наименьшей соленостью.
При рассмотрении других показателей генетической изменчивости, связанных с гетерозиготностью (эффективное число аллелей и информационный индекс Шеннона) подтверждается наличие тенденции, отмеченной при рассмотрении гетерозиготности (табл. 4.7). При этом характер ее проявления совпадает с упомянутым выше. В среднем показатели пе и / в выборке из Азовского моря ниже, чем в других выборках.
Для оценки степени генетической подразделенное популяции пиленгаса, обитающего на акватории Азовского моря и прилегающих водоемов, использовали показатели F-статистики Райта. Наибольший интерес из них представляют значения F$T, которые, будучи мерой генетической подразделенное популяции, являются одновременно мерой инбридинга особей в субпопуляциях. В стационарных условиях эта статистика отражает баланс процессов дифференциации и интеграции популяционных генофондов. (Wright, 1978).
