Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Введение
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна и практическая ценность работы 9
1.4. Апробация работы 9
1.5. Структура и объем работы 10
1.6. Публикации 10
1.7. Вклад автора 11
1.8. Благодарности 11
1.9. Список использованных сокращений 12
Глава 2. Обзор литературы
2.1. Онкогенез и тумор-супрессоры 13
2.2. Нейрофиброматоз 2 типа 14
2.3. Характеристика белкового семейства ERM
2.3.1. Функциональная организация 15
2.3.2. Регуляция активности ERM белков 18
2.4. MERLIN - особый член семейства ERM 19
2.4.1. Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования 20
2.4.2. Структурные особенности мерлина в сравнении с ERM белками 21
2.4.3. Модельные организмы для изучения белка мерлин 22
2.4.4. Локализация белка мерлин в органах и тканях 23
2.4.5. Гомология дрозофилиного и человеческого мерлина 24
2.4.6. Участие белка мерлин в сигнальных путях и его тумор-супрессорные свойства 25
2.4.7. Характеристика мутаций гена Merlin у дрозофилы 27
2.4.8. Функциональные домены белка мерлин, необходимые
для его активности и правильной внутриклеточной локализации 28
2.4.8.1. Внутриклеточая локализация усеченных форм мерлина 29
2.4.8.2. Способность усеченных форм мерлина спасать летальный эффект мутации Мег4 30
2.4.8.3. Фенотипы, наблюдаемые при сверхэкспрессии 30 усеченных и мутантных форм мерлина
2.5. Основные этапы сперматогенеза у дрозофилы 32
2.6. Использование системы GAL4-UAS для изучения функций продуктов генов 38 Заключение по обзору литературы: 42
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Линии дрозофилы, использованные в работе, и работа с ними 43
3.2. Выделение геномной ДІЖ дрозофилы 44
3.3. Проведение полимеразной цепной реакции 44
3.4. Очистка продуктов ПЦР 46
3.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и ее очистка 46
3.6. Трансформация E.coli плазмидной ДНК 47
3.7. Выделение плазмидной ДНК 48
3.8. Лигирование ДНК 48
3.9. Трансформация компетентных клеток E.coli лигазной смесью 49
3.10. Отбор клонов, содержащих плазмиду со встройкой гена, кодирующего мутантную форму белка мерлин 49
3.11. Рестрикционный анализ плазмид, выделенных из клонов E.coli после трансформации лигазной смесью 50
3.12. Определение нуклеотидной последовательности
полученных конструкций 50
3.13. Трансформация клеток зародышевого пути D. melanogaster 51
3.14. Иммуноцитохимическое окрашивание крыловых имагинальных дисков и семенников 52
3.15. Окраска семенников DAPI 5 3
3.16. Окраска семенников MitoTracker Red (Invitrogen) 53
3.17. Окраска семенников ацетоорсеином 54
Глава 4. Результаты
4.1. Аномалии сперматогенеза у мутантов по гену Merlin 56
4.2. Локализация белка мерлин в сперматогенезе дрозофилы 59
4.3. Нарушение поляризации цист у мутантов Мег3 и Мег4 60
4.4. Электронномикроскопические исследования семенников 65
4.5. Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp 61
4.5.1. Анализ эктопической экспрессии мутантных вариантов белка мерлин в соматической ткани 68
4.5.2. Восстановление сперматогенеза у мутантов Мег4 с помощью экспрессии усеченных копий гена Merlin 69
4.6. Нерасхождение хромосом в линиях дрозофилы, мутантных по гену Merlin 71
4.7. Эктопическая экспрессия усеченных копий гена Merlin в
сперматогенезе на фоне нормального белка мерлин 77
4.7.1. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer+ и UASp-inycMer345'635 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин 79
4.7.2. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer3, UASp-mycMer*83 и UASp-mycMer1'379 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин 82
Глава 5. Обсуждение
5.1. Восстановление жизнеспособности мутации Мег4 в соматической ткани 86
5.2. Отличие усеченной формы мерлина mycMer1"330 от mycMer1"
5.3. Восстановление сперматогенеза у самцов Мег4 при
эктопической экспрессии различных форм мерлина 88
5.4. Роль белка мерлин в соматической и генеративной тканях 89
5.5. Значение С-концевого домена мерлина в сперматогенезе дрозофилы 91
5.6. Значение мерлина в стабилизации структуры небенкерна 92
5.7. Участие мерлина в цитокинезе 95
5.8. Сравнительный анализ нарушений, вызванных мутациями гена Merlin, и нарушений, возникающих в результате эктопической экспрессии 98
5.9. Внутриклеточная локализация мерлина 99
Заключение 101
Выводы 107
Список цитированной литературы
- Научная новизна и практическая ценность работы
- Регуляция активности ERM белков
- Выделение геномной ДІЖ дрозофилы
- Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp
Введение к работе
Предприятия агропромышленного комплекса (АПК) традиционно формируют продовольственный рынок. Активное и всестороннее включение Российской Федерации в мировые хозяйственные связи обеспечивает усиление - влияния внешнеторговой деятельности агропромышленных предприятий на формирование продовольственного рынка. Современный уровень развития предприятий АПК характеризуется тесной взаимосвязью производства и внешней торговли. Развитие внешнеторговой деятельности предприятий АПК при формировании продовольственного рынка должно способствовать рациональному продовольственному обеспечению отдельно взятой территории. Современные условия хозяйствования диктуют необходимость защиты внутреннего продовольственного рынка, повышения роли государственного регулирования в целях развития отечественного агропромышленного комплекса и рационального использования ресурсного потенциала территорий. Вышеизложенное подтверждает актуальность и необходимость исследования выбранной темы. Степень изученности проблемы. Теоретическому и практическому изучению АПК РФ, регионов, вопросам внешнеторговой деятельности предприятий АПК, формированию отечественного продовольственного рынка посвящены работы СБ. Авдашевой, А.В. Арискипой, А.П. Балашова, Н.Ф. Вернигор, С.А. Грибовского, М.П. Гриценко, В.П. Зотова, A.M. Зубахина, О.В. Кожевиной, Ю.А. Лютых, А.К. Михальченко, В.В. Мищенко, В.Н. Папело, В.В. Печенкиной, Е.А. Проценко, Ю.М. Рогатнева, А.Т. Стадника, В.Ф. Стукача, А.И. Сучкова, В.П. Теплова, А.Я. Троцковского, В.А. Чертова, С.А. Шелковникова и др. Современные проблемы продовольственного обеспечения РФ и ее регионов нашли отражение в работах А.И. Алтухова, A.M. Бабашкиной, B.C. Балабанова, П.Т. Бурдукова, Е.Н. Борисенко, Н.П. Гусакова, А.С. Дайнеко, А.В. Дьяченко, Т.Г. Дубовцевой, Н.А. Карловой, В.А. Кундиус, А.Д. Орлова, Л.С. Ревенко, Е.В. Серовой, Т.В. Тихоновой, Т. Филоновой, И.Г. Храмовой и др.
Несмотря на значительное число работ по выбранной нами тематике, многие вопросы развития внешнеторговой деятельности предприятий АПК региона, формирования продовольственного рынка, продовольственного обеспечения остаются неисследованными. Недостаточно изучено влияние внешнеторговой деятельности предприятий АПК на формирование продовольственного рынка, нет единой методики определения уровня продовольственного обеспечения страны (региона).
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка теоретических положений и практических рекомендаций по совершенствованию внешнеторговой деятельности предприятий агропромышленного комплекса при формировании продовольственного рынка.
Достижение поставленной цели логически предопределило постановку.и реализацию следующих задач:
- обобщить теоретические подходы к исследованию внешнеторговой деятельности предприятий агропромышленного комплекса при формировании продовольственного рынка;
- выявить факторы, определяющие рациональное продовольственное обеспечение региона;
- проанализировать внешнеторговую деятельность предприятий АПК Алтайского края, выделить внешнеторговый потенциал этих предприятий в целях формирования продовольственного рынка на основе рационального продовольственного обеспечения;
- разработать методический подход к проведению анализа продовольственного обеспечения путем расчета конкурируемого и неконкурируемого импорта агропродовольственной продукции и коэффициента рационального продовольственного обеспечения;
- обосновать механизм повышения эффективности внешнеторговой деятельности предприятий АПК.
Объект исследования — экономические отношения, возникающие при развитии внешнеторговой деятельности предприятий агропромышленного комплекса.
Предмет исследования - тенденции и закономерности развития внешнеторговой деятельности предприятий АПК, возникающие в процессе формирования продовольственного рынка.
Объект наблюдения - агропромышленные предприятия Алтайского края.
Область исследования. Содержание диссертации соответствует области, исследования п. 15.32 «Теория эффективных межотраслевых и межрегиональных взаимодействий в процессе становления единого продовольственного рынка России; обоснование вариантов и альтернатив формирования продовольственных рынков и стратегии их интеграции» Паспорта номенклатуры специальностей ВАК (экономические науки).
Теоретической и методической основой проведения исследований послужили труды отечественных и зарубежных ученых и практиков по вопросам развития предприятий АПК, формирования продовольственного рынка, проблемам продовольственного обеспечения; нормативно-правовые акты РФ и Алтайского края по исследуемой проблеме. В качестве информационной базы были использованы данные Алтайской таможни Федеральной таможенной службы РФ, Краевого комитета статистики по Алтайскому краю, Федеральной службы государственной статистики РФ, Центра экономической конъюнктуры при Правительстве РФ, Организации экономического сотрудничества и развития.
Для реализации поставленных задач в работе использованы следующие методы исследования: монографический, абстрактно-логический, экономико-статистический, расчетно-конструктивный и математическое моделирование с применением ЭВМ.
Научная новизна исследования, выносимая на защиту, заключается в следующем:
1. Теоретические представления о принципах развития внешнеэкономических связей агропромышленного комплекса на региональном уровне дополнены принципами: соответствия внешнеэкономических стратегий предприятий АПК стратегии формирования продовольственного рынка;
соответствия внешнеэкономических стратегий АПК регионов стратегии рационального продовольственного обеспечения страны; экологической безопасности импортных продуктов питания и производства продукции АПК.
2. В целях формирования продовольственного рынка на основе рационального продовольственного обеспечения страны (региона) уточнены и разграничены понятия продовольственной независимости и продовольственной безопасности. Представлена авторская классификация факторов рационального продовольственного обеспечения страны (региона) на внутриэкономические (факторы социального, экономического развития, развития агропромышленного комплекса) и внешнеэкономические (развития внешнеэкономической деятельности, мировых рынков продовольствия); постоянные (факторы социального, экономического развития, развития агропромышленного комплекса, внешнеэкономической деятельности, политический вес страны на международной арене, степень зависимости от импорта продовольственных товаров) и временные (изменение ситуации на мировых рынках продовольствия, нестабильность производства продукции растениеводства и животноводства).
3. Предложен методический подход к определению конкурируемого и неконкурируемого импорта агропродовольственной продукции исходя из объективных (природно-климатические условия, географическое положение) и приобретенных («история» производства продукции АПК; наличие квалифицированных трудовых ресурсов; развитие научной базы; распаханность земель; наличие производственных мощностей; развитие -транспортных сетей, складских помещений, торговых сетей) факторов формирования внешнеторговой специализации предприятий агропромышленного комплекса в целях анализа уровня продовольственного обеспечения при формировании продовольственного рынка.
4. Предложен авторский подход к проведению анализа продовольственного обеспечения региона, который заключается в расчете коэффициента рационального продовольственного обеспечения, основанного на показателях внешнеторговой деятельности агропромышленных предприятий; обоснован механизм повышения эффективности их внешнеторговой деятельности, который, в отличие от существующих, базируется на взаимодействии государственных органов регулирования АПК и внешнеторговой деятельности в целях формирования продовольственного рынка на основе рационального продовольственного обеспечения региона.
Практическая значимость полученных результатов заключается в возможности использования предложений и рекомендаций региональными органами власти, хозяйствующими субъектами при разработке и реализации программ формирования регионального продовольственного рынка и повышения эффективности внешнеторговой деятельности предприятий АПК.
Апробация результатов исследования. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Алтайского государственного университета (тема «Влияние развития внешнеторговой деятельности в сфере агропромышленного комплекса региона на обеспечение продовольственной безопасности» (регистрационный номер 01200808907). Апробация основных выводов и предложений, содержащихся в диссертационной работе, осуществлена автором на научно-практических конференциях: международной конференции «Экономика и бизнес: позиция молодых ученых» (Барнаул, 2008 г.); международной научно-практической конференции «Управление современной организацией: опыт, проблемы и перспективы» (Барнаул, 2008 г.); международной научно-практической конференции «Торгово-экономические проблемы регионального бизнес-пространства» (Челябинск, 2008 г.); международной конференции «Экономика и бизнес: позиция молодых ученых» (Барнаул, 2007 г.); международной конференции «Экономика и бизнес: позиция молодых ученых» (Барнаул, 2006 г.); международной научно-практической конференции «Управление современной организацией: опыт, проблемы и перспективы» (Барнаул, 2006 г.); международной молоденшой научно-практической конференции «Политика и бизнес в меняющемся мире» (Обнинск, 2006 г.); межвузовской конференции «Менеджмент.и маркетинг в системе рыночных отношений» (Барнаул, 2005 г.); международной конференции «Экономика и бизнес: позиция молодых ученых» (Барнаул, 2005 г.); международной конференции «Экономика и бизнес: позиция молодых ученых» (Барнаул, 2004 г.); международной научно-практической конференции «Управление современной организацией: опыт, проблемы и перспективы» (Барнаул, 2004 г.); всероссийской конференции молодых ученых «Интеллектуальная позиция ученых России» (Барнаул, 2004 г.); международной конференции студентов и аспирантов «Экономика. Бизнес. Информационные технологии» (Барнаул, 2001 г.).
Предложенный автором комплекс мероприятий по повышению эффективности внешнеторговой деятельности предприятий АПК, а также разработанные рекомендации по формированию продовольственного рынка на основе рационального продовольственного обеспечения приняты к внедрению Главным управлением сельского хозяйства Алтайского края и Управлением Алтайского края по обеспечению международных и межрегиональных связей, что подтверждается актами внедрения.
Материалы диссертации и публикации автора используются при изучении дисциплин «Экономика АПК», «Прогнозирование развития АПК», «Организация сельскохозяйственного производства», «Региональная экономика», «Управление внешнеэкономической деятельностью» в ГОУ ВПО Алтайский государственный университет и ФГОУ ВПО Алтайский государственный аграрный университет.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 13 научных работ объемом 4,6 п.л., в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК, объемом 1,4 п.л. Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, библиографического списка, включающего 184 наименования. Результаты исследования изложены на 154 страницах и иллюстрированы 16 таблицами, 10 рисунками и 9 приложениями.
В первой главе «Теоретические основы исследования развития внешнеторговой деятельности при формировании продовольственного рынка» обобщены подходы к исследованию деятельности в сфере АПК; выделены особенности, тенденции и принципы развития внешнеэкономических связей АПК при формировании продовольственного рынка; раскрыта роль и место внешнеторговой деятельности предприятий АПК при формировании продовольственного рынка; в целях рационального продовольственного обеспечение уточнены и разграничены определения продовольственной безопасности и продовольственной независимости, представлена классификация факторов рационального продовольственного обеспечения страны (региона).
Во второй главе диссертационной работы «Анализ внешнеторговой деятельности предприятий агропромышленного комплекса Алтайского края» дан анализ экспорта продукции предприятий АПК края, динамика и структура импорта агропродовольственной продукции, проанализирован внешнеторговый потенциал предприятий АПК, выделены объективные и приобретенные факторы формирования внешнеторговой специализации предприятий АПК.
В третьей главе «Совершенствование управления внешнеторговой деятельностью предприятий АПК при формировании продовольственного рынка региона» предложен методический подход к определению конкурируемого и неконкурируемого импорта агропродовольственных товаров, а также авторский подход к анализу продовольственного обеспечения региона на основе расчета коэффициента рационального продовольственного обеспечения; -обоснован механизм повышения эффективности внешнеторговой деятельности предприятий АПК.
В заключении обобщены основные результаты диссертационного исследования.
Научная новизна и практическая ценность работы
Способность к регуляции пролиферации - важнейшее свойство многоклеточных организмов, необходимое им, чтобы контролировать свой размер и форму, поэтому нарушения в контроле деления клетки могут иметь тяжелые последствия для организма в целом. Ошибочная активация пролиферации часто заканчивается формированием опухоли и развитием рака. Многие гены, как непосредственно контролирующие пролиферацию, так и косвенно вовлеченные в контроль клеточного цикла, были идентифицированы в качестве онкогенов и тумор-супрессоров.
Среди известных тумор-супрессоров интересен открытый в 1993 году ген Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий белок мерлин (или шванномин), принадлежащий к суперсемейству р4.1 - большой группе цитоплазматических белков, связанных с мембраной. Наибольшую степень сходства он имеет с белками подсемейства ERM (EZRIN- RADIXIN-MOESIN). Отсюда название MERLIN - MOESIN-EZION-RADIXrN-like-protein. Мутация этого гена вызывает у человека заболевание; нейрофиброматоз второго типа, характеризующееся формированием билатеральной акустической шванномы, поражающей восьмую пару черепно-мозговых нервов, а также других опухолей, ассоциированных с центральной нервной системой, таких как менингиомы и эпендимомы (Martuza, Eldridge, 1988; Trofatter et al., 1993; Rouleau et al., 1993).
Чтобы исследовать клеточные функции белка мерлин, используют его гомологи у мыши и у дрозофилы. У обоих видов особи, гомозиготные по мутации, не выживают, что свидетельствует о жизненно важных функциях мерлина (McClatchey et al., 1997; Fehon et al., 1997). В отличие от человека у мышей, гетерозиготных по Nf2 мутации, не образуются шванномы и другие характерные опухоли. У них развиваются злокачественные остеосаркомы и фибросаркомы, причем метастатического характера (McClatchey et al., 1998). Что касается дрозофилы, то она тоже подходит для изучения функций белка мерлин, несмотря на отсутствие шванновских клеток - мишени болезни у человека. Эксперименты с использованием мутаций с потерей функций мерлина и FLP-FRT системы для получения соматических мозаичных клонов мутантных эпителиальных клеток показали, что, как и у млекопитающих, мерлин-дефицитные клетки дрозофилы характеризуются гиперплазией. Таким образом, мерлин выполняет функцию тумор-супрессора и у дрозофилы (LaJeunesse et al., 1998).
К настоящему времени описаны четыре мутации гена Merlin у дрозофилы. Ни один из аллелей не вызывает эмбриональной гибели, три из этих мутаций, Мег1, Мег , Мег4 , вызывают гибель на стадии личинки и куколки. Единственный жизнеспособный аллель - Мег . Мухи, гомозиготные по Мег3, доживают до взрослого состояния, но стерильны, их крылья более широкие, для глаз характерна нерегулярность фасеток, а на голове образуются аномальные кутикулярные структуры (Fehon et al., 1997).
Чтобы выяснить, каким образом мутация Мег вызывает стерильность самцов, нами были проведены исследования сперматогенеза. Drosophila melanogaster. Сперматогенез объединяет в себе два типа клеточных делений: митотическое и мейотическое, а также процессы клеточного роста и дифференцировки. Таким образом, он является удобной экспериментальной моделью для изучения функций белков на клеточном и молекулярном уровнях. Нами было обнаружено, что мутация Мег влияет на процессы компактизации ядер и поляризации цисты, что приводит к серьезным нарушениям сперматогенеза на стадии индивидуализации спермиев, что и вызывает стерильность самцов.
Ранее было показано, что мутация Мег3 затрагивает особый участок белка - «Blue Box» (170YQMTREM177), который идентичен у человеческого и дрозофилиного гомологов белка. Он имеет важное значение для правильного функционирования белка (LaJeunesse et al., 1998). Для изучения этого района, а также других функциональных доменов мерлина, были созданы конструкции, кодирующие различные мутантные и усеченные копии белка на основе вектора pUAST, который позволяет экспрессировать копии генов в соматической ткани в системе GAL4-UAS (LaJeunesse et al., 1998). Спецификой нашей работы является использование модифицированного UAS-вектора - pUASp, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии белков в генеративных тканях дрозофилы (Rorth, 1998).
Чтобы определить функционально значимые районы белка, необходимые для правильного протекания сперматогенеза дрозофилы, мы создали конструкции на основе вектора pUASp, кодирующие различные мутантные формы мерлина. Нами было показано, что белок мерлин, который является тумор-супрессором в соматических тканях дрозофилы, играет существенную роль в процессах сперматогенеза. В частности, открытая форма белка участвует в агломерации митохондрий на стадии «луковицы», а закрытая влияет на цитокинез в мейозе. Таким образом, в соматической и генеративной тканях мерлин функционирует по-разному.
Целью данной работы было изучение клеточных функций гена Merlin на модели сперматогенеза Drosophila melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Показать роль белка мерлин в сперматогенезе D. melanogaster. 2. Изучить локализацию белка мерлин в клетках зародышевого пути самцов D. melanogaster. 3. Получить линии дрозофилы, содержащие встройки последовательностей, кодирующих различные усеченные формы белка мерлин, в векторе pUASp, который позволяет экспрессировать целевой трансген в клетках зародышевой линии самцов D. melanogaster.
Регуляция активности ERM белков
Определение функций различных генов - важная задача генетики. С помощью мутагенеза или направленного выключения гена были успешно определены функции многих генов. Но не всегда с помощью этих методов можно определить все функции генов. Если мутация в гене приводит к эмбриональной гибели организма, то нельзя изучить функцию этого гена или его белкового продукта на более поздних стадиях развития (Perrimon, 1998). У многих генов мутации с полной потерей функции не имеют фенотипического проявления, в результате чего с ними невозможно проводить классический генетический анализ. Например, у дрозофилы такие гены составляют 66% генома (Miklos, Rubin, 1996).
В некоторых случаях с помощью нуль-мутаций и фенотипическим проявлениям удается определять функции гена. Но всё же, этот метод не позволяет детально изучить все функции интересующего гена и его белкового продукта.
Другой метод изучения функций генов - их эктопическая экспрессия. На сегодняшний день существует много способов для получения эктопической экспрессии определенного гена, каждый из них имеет свои недостатки и преимущества.
Наиболее распространенный метод — экспрессия гена с помощью тканеспецифического промотора. Этот метод был успешно применен при изучении сигнальной трансдукции и клеточной дифференцировки на глазах дрозофилы при помощи промотора гена sevenless, рецептора тирозинкиназы (Van Vactor et al., 1991). Главным недостатком этого метода является то, что для изменения пространственного паттерна и уровня экспрессии требуется использование других охарактеризованных промоторов. В случае, если продукт гена токсичен, создать устойчивые трансгенные линии невозможно.
Другой метод эктопической экспрессии - экспрессия, запускаемая промотором теплового шока. Преимуществом этого метода является то, что можно изменять как уровень, так и время активации экспрессии. Недостаток метода - отсутствие пространственного ограничения экспрессии, так как она идет повсеместно.
Бранд и Перримон разработали метод эктопической экспрессии с использованием дрожжевого транскрипционного фактора GAL4 (Brand, Perrimon, 1993): UAS/Gal4 система широко используется для направленной тканеспецифичной экспрессии клонированных генов у дрозофилы.
GAL4 — дрожжевой транскрипционный фактор, который участвует в активации генов, необходимых для утилизации галактозы. GAL4 состоит из двух идентичных полипептидных цепей, каждая из которых содержит домен «цинковый палец». Активация генов происходит тогда, когда GAL4 связывается с ОАЬ4-специфичными связывающими сайтами - UAS (Upstream Activating Sequence). Было показано, что UAS/GAL4 система функционирует не только в дрожжах, но и у дрозофилы, активация генов идет только с промоторов, которые содержат UAS-последовательности.
Особенность этого метода заключается в том, что экспрессия транскрипционного фактора GAL4 идет в одной линии, а ген-мишень, встроенный под UAS промотор, находится в другой линии. Поскольку у дрозофилы нет эндогенного транскрипционного фактора GAL4, то экспрессия гена-мишени в такой линии идет на минимальном (фоновом) уровне, что позволяет создавать трансгенные линии даже в тех случаях, когда продукт гена токсичен (Phelps, Brand, 1998).
Для активации эктопической экспрессии гена-мишени необходимо объединить в одном организме конструкцию, экспрессирующую GAL4, и анализируемый ген, находящийся под влиянием UAS, что легко достигается путем скрещивания двух линий D. melanogaster.
Важным преимуществом этого метода является то, что с помощью драйверов, экспрессирующих транскрипционный фактор GAL4 в разных органах, можно пространственно ограничить экспрессию гена-мишени. Например, экспрессируя ген в таком органе, как крыло или глаз, можно изучать проявления аллелей, являющихся доминантными деталями, так как крыло не является жизненно важным органом и особи без крыльев выживают.
Были созданы коллекции GAL4 драйверов и коллекции линий, несущих Р-элементную встройку последовательностей UAS в регуляторные области генов (Rorth, 1996; Rorth et al., 1998). Использование этой системы позволило выявить множество новых генов, участвующих в развитии отдельных органов, в процессах дифференцировки и регуляции клеточного цикла.
Эктопическая экспрессия с использованием различных GAL4 драйверов приводит к возникновению фенотипов примерно в 2-7% линий (Rorth et al., 1998; Abdelilah-Seyfriend et al., 2000; Huang, Rubin, 2000; Kraunt et al., 2000). Возникновение видимых фенотипов при эктопической экспрессии генов косвенно позволяет судить об их влиянии на процессы развития соответствующих органов и тканей. Например, скрининг фенотипов эктопической экспрессии 10% генов D. melanogaster в глазном имагинальном диске при помощи драйвера ey-Gal4 позволил выявить множество новых регуляторов клеточной пролиферации, а также генов, для которых характерна специфическая функция в развитии глаза (Tseng, Hariharan, 2002).
Выделение геномной ДІЖ дрозофилы
Реакционную смесь, полученную после проведения ПЦР, смешивали с 1/10V раствора для нанесения (50% глицерин, 0,2% бромфеноловый синий) и проводили электрофорез в 1,5% агарозном геле, используя IxTAE буфер (Трис-ацетатный буфер, 1х рН = 7.6: Tris-acetate 40mM, EDTA ImM), при напряженности поля 2,5 в/см в течение 30 минут. Затем гель инкубировали в растворе 0,0006% бромистого этидия в течение 2 минут и промывали дистиллированной водой 5 минут. Результат электрофореза смотрела под УФ-излучением на трансиллюминаторе. Вырезали фрагмент геля, содержащий нужный ПЦР-продукт. Выделение фрагмента из геля проводили, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Германия) по прилагаемой фирмой-производителем методике.
Полученную в ПЦР и очищенную ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазами рестрикции Sacll и Xbal. Для этого к 20 мкл раствора, содержащего полученную ДНК (получение и очистка фрагментов ДНК описаны в пунктах 3.3 и 3.4), добавляли 1 мкл (15 единиц) рестриктазы, 3 мкл 10-кратного буфера («В» для Sac II, «О» для ХЬа I) и 6 мкл дистиллированной воды. Реакцию проводили 2 часа при 37С.
Реакционную смесь, полученную после проведения гидролиза эндонуклеазами рестрикции, прогревали 10 минут при 70С, смешивали с 1/10V раствора для нанесения. Препаративный электрофорез проводили в 1,0% агарозном геле в течение 40 минут, как описывалось ранее, и вырезали участок геля, содержащий нужный фрагмент. Выделение ДНК проводили при помощи набора QIAquick Gel Extraction kit (QUAGEN, Германия) по прилагаемой фирмой-производителем методике.
Гидролиз ДІЖ pBluSKP и pUASp эндонуклеазами рестрикции Sacll и Xbal проводили аналогично описанному ранее.
Приготовление компетентных клеток. Метод, описанный Маниатисом, с использованием хлористого кальция. 100 мкл ночной культуры E.coli XL Blue вносили в 100 мл LB-среды и выращивали при 30С до оптической плотности D55o=0,7-0,8. Затем на 2 часа оставляли клетки на льду. После чего центрифугировали при 3000g при температуре 4С в течение 10 минут, супернатант сливали. Осадок ресуспендировали в 50 мл охлажденного до 4С буфера I (ЮОмМ СаС12, 70мМ МпС12, 40мМ NaAc, рН 5,5) и оставляли на льду в течение 30 минут. Затем снова центрифугировали при 3000g при температуре 4С в течение 10 минут и сливали супернатант. После чего аккуратно ресуспендировали клетки в 5 мл раствора, содержащего буфер I и 15% глицерина, расфасовали в пробирки Eppendorf на 1,5 мл по 200 мкл и хранили при температуре -70С.
Трансформация клеток E.coli. Компетентные клетки оттаивали на льду, добавляли к ним 2 мкл (Юпг) плазмидной ДНК и выдерживали на льду 30 минут. Затем инкубировали 5 мин при 37С, переносили на 10 минут в лед, после чего к клеточной суспензии добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37С в течение 1 часа. Далее клеточную культуру высевали на агаризованную питательную среду с ампициллином (100 мкг/мл) и инкубировали в течение 16-18 часов при 37С. 3.7. Выделение плазмидной ДНК
Одиночную колонию клеток E.coli, трансформированных плазмидной ДНК, инкубировали в 5 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 37С в течение ночи при умеренном покачивании. Плазмидную ДНК из полученных клеток ночной культуры выделяли методом щелочного лизиса. 1,5 мл ночной культуры клеток is. coli осаждали на центрифуге "Eppendorf 5415 С при 6000 об/мин в течение 6 мин. Супернатант удаляли, а осадок тщательно ресуспендировали в 100 мкл раствора I (25мМ Tris-HCl рН 8.0, ЮмМ EDTA, 50мМ глюкоза). Затем добавляли 200 мкл раствора II (0,2 М NaOH, 1% SDS) и осторожно перемешивали (суспензия должна просветлеть и стать более вязкой). После чего добавляли 150 мкл ЗМ NaAc, рН 5,0, перемешивали до выпадения творожистого осадка и оставляли на льду на 10 минут. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 12000 об/мин в течение 5 мин (на центрифуге Eppendorf 5415 D). Супернатант переносили в новую пробирку и смешивали с 900 мкл 96% этилового спирта, выдерживали при комнатной температуре 10 минут и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Осадок промывали 70% этиловым спиртом, подсушивали и растворяли в 50 мкл Н20.
В реакцию лигирования брали около 0,2 мкг ДНК (8 мкл) встраиваемого фрагмента (получение и очистка фрагмента ДНК описаны в пунктах 3.3 и 3.4) и около 0,2 мкг ДНК (10 мкл) векторной ДНК (pBluSKP или pUASp), гидролизованных эндонуклеазами рестрикции SacII и Xbal. Добавляли 17,5 мкл дистиллированной воды, 4 мкл 10-кратного реакционного буфера и 0,5 мкл (100 единиц активности) ДНК лигазы фага Т4 («СибЭнзим», Россия). Реакцию проводили при температуре 16С в течение 16 часов.
Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp
Иммуноцитохимический анализ выявил, что мерлин локализуется только на небенкерне на стадии «луковицы» в сперматогенезе D. melanogaster. Для более детального изучения динамики изменения небенкерна в процессе созревания сперматид были проведены электронномикроскопические исследования двух электронноплотных митохондриальных тел, или паракристаллиновых тел, в процессе элонгации сперматид. Для исследования были сделаны тонкие срезы семенников, выделенных из самцов FM6 (контроль), а также из самцов Мег3 и Мег4. На поздних стадиях элонгации каждая сперматида в контрольной цисте содержит одно большое и одно малое митохондриальное тело, связанные с одной аксонемой (Рис. 15-А). Внутри каждой субъединицы митохондриального тела находится одно паракристаллиновое тело (Fabrizio et al., 1998). Однако, было обнаружено, что некоторые сперматиды в цистах Мег содержат по два паракристаллиновых тела в большом митохондриальном теле (Рис. 15-Б), в некоторых сперматидах имелось также по две аксонемы. Подобные нарушения были обнаружены также и в цистах Мег4 (Рис. 15-В).
Сперматиды в цистах Мег расположены свободно друг от друга (Рис. 15-Д), а в цистах Мег4 они к тому же очень сильно дезорганизованы (Рис. 15-Е), в то время как в контроле FM6, соседние сперматиды в пределах одной цисты плотно контактируют между собой (Рис. 15-Г).
В конце стадии индивидуализации в зрелых сперматидах в нормальных цистах существенно редуцировано количество цитоплазмы и значительно редуцируются в размере малые производные митохондрий (Lindsley, Tokuyasu, 1978; Fuller, 1993; Fabrizio et al., 1998). Паракристаллиновый материал виден как темное пятно внутри большой митохондриальной производной (Рис. 15-Ж).
Каждая из 64 сперматид в процессе индивидуализации в контрольных цистах содержит высокоупорядоченную пару аксонема-небенкерн, в цистах Мег3 наблюдается сильное нарушение этой строгой организации (Рис. 15-3). Хотя в некоторых сперматидах содержится нормальная пара аксонема-небенкерн, в других эта структура выглядят как структуры, связанные вместе, или взаимодействующие через тонкую цитоплазматическую нить. Серьезные нарушения также были обнаружены в цистах Мег4 (Рис. 15-И), но принципиальных отличий от нарушений в цистах Мег3 не наблюдалось. Вопреки всем этим изменениям, структура микротрубочек 9+2 в аксонеме (Альберте, 1987; Бурнашева, 1982) сохраняется в цистах мутантов по гену Merlin (вставка на рисунке 15-И), свидетельствуя о том, что мерлин не требуется для формирования аксонемы.
Мутации в гене Merlin приводят к неправильному формированию митохондриальных агломератов в сперматогенезе. Это подтверждает, как иммуноцитохимическое окрашивание, так и электронномикроскопические исследования. Связь мер лина с небенкерном дает основание полагать, что мерлин может играть роль в формировании митохондриальной структуры и в ее функционировании в течение различных стадий сперматогенеза.
Для изучения функциональных доменов белка мерлин были созданы различные усеченные копии кДНК гена Merlin (LaJeunesse et al., 1998).
Разные аллели гена Merlin (см. раздел 3.2) мы клонировали в вектор pUASp. К генам, кодирующим разные мутантные формы белка мерлин, добавлена последовательность, кодирующая myc-эпитоп. Это сделано для того, чтобы при цитологическом анализе эктопической экспрессии конструкций в соматической и генеративной тканях ее легко можно было бы детектировать.
Для каждой конструкции было получено несколько (не менее 4) независимых трансгенных линий мух. С помощью генетического картирования были определены хромосомы, в которые произошла инсерция конструкций, кодирующих разные аллели гена Merlin. Все полученные линии были проанализированы на способность экспрессировать мутантные формы белка в соматической и генеративной тканях (в крыловом имагинальном диске под действием специфичного для этой ткани драйвера 1096-GAL4 и в клетках зародышевого пути в семенниках под действием драйвера nanos-GAL4). Также все конструкции были проанализированы на способность восстанавливать жизнеспособность летальной мутации Мег4 под действием драйверов с повсеместной экспрессией da-GALA и Actin-GALA. Все линии мух, полученные для отдельно взятой конструкции, одинаково проявляли себя в способности восстанавливать фенотип летальной мутации Мег4. Уровень нарушений, вызываемых определенной конструкцией при эктопической экспрессии под действием всех использованных в работе драйверов, в разных независимых линиях был одинаковый. Мы полагаем, что все линии, полученные для каждой конкретной конструкции, бвли равнозначны. Поэтому для более детального исследования было взято по одной линии мух для каждой конструкции.
Линии, использованные в этой работе, содержали встроенные трансгены в следующих хромосомах: конструкция pUASp-mycMer1 169 встроена в первую хромосому D. melanogaster, pUASp-mycMer1 379 во вторую хромосому, pUASp-mycMer345 635 в третью, pUASp-mycMer3 во вторую, pUASp-mycMerMB во вторую, pUASp-mycMer+ в третью хромосому.
