Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Антигенные перестройки опухолевых клеток и методы их выявления...5
2.2. Механизмы превращения нормальной клетки в опухолевую 8
2.3. Опухолеспецифические антигены
2.3.1. Мутантные антигены 9
2.3.2. Вирусные антигены 17
2.4. Опухолеассоциированные антигены
2.4.1. Дифференцировочные антигены 20
2.4.2. Амплифицированные/гиперэкспрессируемые генные продукты и универсальные опухолевые антигены 26
2.4.3. Гетероорганные антигены 30
2.5. Антигенные изменения, сопровождающие развитие гепатоцеллюлярных опухолей 42
3. Материалы и методы 50
4. Результаты
4.1 Характеристика полученных иммуносывороток 60
4.2. Выявление опухолеассоциированных мембранных антигенов гепатомы Зайдела 62
4.3. Выявление гетероорганных антигенов на поверхности культивируемых клеток и их связь с пролиферативной активностью клеток 65
4.4. Идентификация мембранных опухолеассоциированных гетероорганных антигенов
4.4.1. Определение молекулярных масс опухолеассоциированных мембранных белков клеток гепатомы Зайдела, реагирующих с антипочечной иммуносывороткой .69
4.4.2. Масс-спектрометрический анализ выявленных опухолеассоциированных гетероорганных антигенов клеток гепатомы Зайдела крыс 70
4.4.3. Подтверждение результатов масс-спектрометрического анализа методами иммуноблотинга и непрямой иммунофлуоресценции 75
4.4.4. Сравнительный анализ двух мембранных опухолеассоциированных гетероорганных антигенов, выявляемых в районе 200 кДа, клеток гепатомы Зайдела и гепатомы НТС 79
4.5 Выявление опухолеассоциированного антигена, идентифицированного как ламинин, на поверхности гепатоцитов крыс после однократного воздействия гепатоканцерогеном ДЭНА 85
4.6. Идентификация ламинин-связывающих мембранных белков клеток гепатомы Зайдела 86
5. Обсуждение 92
6. Выводы 107
7. Список литературы 108
- Амплифицированные/гиперэкспрессируемые генные продукты и универсальные опухолевые антигены
- Антигенные изменения, сопровождающие развитие гепатоцеллюлярных опухолей
- Выявление гетероорганных антигенов на поверхности культивируемых клеток и их связь с пролиферативной активностью клеток
- Подтверждение результатов масс-спектрометрического анализа методами иммуноблотинга и непрямой иммунофлуоресценции
Введение к работе
Проблемы дифференцировки, дисдифференцировки и пролиферации клеток являющиеся одними из основных проблем современной биологии, особенно актуальны для фундаментальной онкологии. При неопластической трансформации в клетке происходят значительные изменения, позволяющие ей приобрести такие свойства, которые предопределяют ее возможность образовать злокачественную опухоль. Эти события выражаются в становлении новых антигенных свойств ма-лигнизированных клеток, которые в значительной степени определяются антигенами клеточной поверхности.
Поэтому исследования, направленные на выявление опухолевых антигенов и их идентификацию, приводят к пониманию не только клеточных, но и молекулярных механизмов опухолевой трансформации, прогессии опухоли и механизмов избежания опухолью иммунного ответа. Такие исследования являются одним из важнейших и активно разрабатываемых направлений в онкоиммунологии.
В настоящее время в мире накоплен громадный фактический материал об антигенах опухолевых клеток, который нуждается в систематизации, что автор и попытался сделать в главе «Обзор литературы».
Феномен антигенной дивергенции, при котором малигнизированные клетки синтезируют антигены, свойственные нормальным тканям, негомологичным опухоли, является типичным событием при опухолевой трансформации. Исследования этого явления часто носят феноменологический характер, редко доходят до идентификации обнаруженных опухолеассоциированных антигенов, не говоря уже об изучении этого явления в более широком биологическом плане с целью выяснения молекулярных и клеточных механизмов канцерогенеза, задающих направление нарушений дифференцировки трансформированных клеток.
Так, при исследовании гепатоцеллюлярных опухолей крыс иммунологическими методами было установлено наличие мембранных опухолеассоциированных антигенов, не свойственных нормальным гепатоцитам, но характерных для почек ин-тактных крыс (локализация - базальная мембрана извитых канальцев почки и апикальные части клеток эпителия главных отделов нефрона). Обнаруженные антигены также выявлялись в регенерирующей печени крыс после операции частичной
4 гепатэктомии и на гепатоцитах крыс, получавших гепатоканцероген, причем уже
спустя 1 сут после однократного применения канцерогена. Однако идентификация опухолеассоциированных антигенов, наличие которых регистрировалось с помощью органоспецифической иммуносыворотки против клеточных мембран («клеточных теней») почек крыс, не проводилась. Поэтому целью настоящей работы стало выявление, определение молекулярной массы и идентификация опухолевых антигенов (-а), ассоциированных с гепатоцеллюлярными опухолями крыс, обнаруживаемых с помощью органоспецифической антипочечной иммуносыворотки.
Конкретные задачи работы.
Получить специфические иммуносыворотки к исследуемым антигенам.
С помощью полученных иммуносывороток охарактеризовать опухолеас-социированные антигены некоторых гепатоцеллюлярных опухолей и опухолей иного гистогенеза.
Выделить мембранный опухолеассоциированный антиген почечной специфичности.
Охарактеризовать выделенный опухолеассоциированный антиген и идентифицировать его методом масс-спектрометрии.
Провести сравнительный анализ двух гепатоцеллюлярных опухолей крыс в отношении исследуемого антигена.
Положения, выносимые на защиту:
Исследованные гепатоцеллюлярные опухоли крыс характеризуются появлением на клеточной поверхности опухолеассоциированного антигена, свойственного почечной ткани интактных крыс и причастного к процессу пролиферации гепатоцеллюлярных клеток.
Анализ опухолеассоциированного мембранного антигена клеток двух гепатоцеллюлярных опухолей крыс позволил идентифицировать его как белок внеклеточного матрикса - ламинин.
Ламинин, синтезируемый клетками гепатомы ЗаЙдела крысы, связывается с клеточной мембраной посредством нескольких ламинин-связывающих белков, одним из которых, на основании данных масс-спектрометрии, является мембранный белок теплового шока GRP78.
5 2. Обзор литературы
Амплифицированные/гиперэкспрессируемые генные продукты и универсальные опухолевые антигены
Антигены, выявляемые благодаря гиперэкспрессии соответствующих генов, часто обнаруживаются в опухолях. В нормальных тканях такие антигены обычно экспрессируется на низком уровне, их можно регистрировать лишь методом обратной полимеразной цепной реакции (RT-PCR), тогда как нозерн-блот анализ оказывается обычно недостаточно чувствительным, но в опухолевых клетках они могут быть экспрессированы до стократного превышения нормального уровня. Примерами может служить HOM-RCC-3.1.3 - углеродная ангидраза (СА XII), которая ги-перэкспрессирована в 10 % случаев почечно-клеточного рака (TUreci et al., 1998) и ВАХ inhibitor protein 1, гиперэкспрессированного в глиомах (Schmits et al., 2002). Каково функциональное значение этих белков в опухолевом процессе? Гиперэкспрессия СА XII нарушает контроль клетки над внутриклеточным и внеклеточным рН, сдвигая последний в более кислую сторону, что способствует опухолевой прогрессии (Ivanov et al., 1998). К увеличенной продукции СА XII могут приводить как амплификация соответствующего локуса, так и инактивация гена опухолевого су-прессора фон Хиппеля-Линдау (VHL), которая наблюдается примерно в 80 % случаев светлоклеточного рака почки (Копнин, 2000а). Причем восстановление экспрессии гена VHL в клетках этих опухолей подавляет их туморогенность. Опухолевый супрессор ВАХ inhibitor protein 1 является антиапоптотической молекулой (ВАХ - протоапоптический белок семейства bcl-2) (Schmits et al., 2002).
В результате амплификации активируются онкогены. В некоторых случаях амплификация онкогена коррелирует с определенным новообразованием, однако, скорее всего, амплификация онкогена является лишь вспомогательным механизмом, имеющим селективные преимущества. В большинстве случаев в опухолях человека в амплифицированном состоянии встречаются онкогены семейства туе. Существует прямая зависимость между высоким пролиферативным статусом, низким уровнем дифференцировки клеток и гиперэкспрессией myc-генов. Такие опухоли являются наиболее агрессивными, активно метастазирующими и характеризуются низким показателем выживаемости. При нейробластомах и ретинобласто-мах онкоген N-MYC может насчитывать до 200 копий на гаплоидный геном клетки. Обычно же амплификация онкогенов не превышает нескольких десятков копий.
Высокая экспрессия онкогена C-SRC коррелирует с развитием метастатических поражений и низкой дифференцировкой опухолей при плоскоклеточном раке легкого и может служить показателем плохого прогноза. По-видимому, это обусловлено способностью продукта данного гена фосфорилировать белки цитоскеле-та - актин, фибрин, винкулин, тубулин, что усиливает морфологическую атипию клеток, изменяет параметры клеточной адгезии в эпителиальных клетках и облегчает образование метастазов. Есть основания полагать, что тирозин-специфичная киназная активность этого гена связана с нейроэндокринной природой клеток мел 28 коклеточного рака легкого, о чем свидетельствует факт специфичной экспрессии с src в дифференцирующихся нервных клетках.
При гемобластозах 30-60 кратная амплификация онкогена MYB приводит к генерализации процесса.
Гиперэкспрессия/амплификация онкогена Her-2/neu наблюдается в различных типах карцином (рак молочной железы, кишечника, желудка, поджелудочной железы, щитовидной железы, яичника и др.) (Goebel et al., 2002) и ассоциирована с плохим прогнозом течения заболевания и резистентностью опухоли к химиотерапии и лучевой терапии (Choudhury, Kiessling, 2004). Продукт этого гена - трансмембранный белок с мол. массой 185 кДа, обладает тирозин-киназной активностью и является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста. Гиперэкспрессия этого белка коррелирует с низкой выживаемостью, с повышенной инва-зивностью и агрессивным ростом опухоли (Goebel et al., 2002). В настоящее время в лечении больных с HER-2/neu+ метастатическим раком молочной железы применяются гуманизированные мышиные моноклональные антитела против Her-2/neu (медицинский препарат Herceptin), эффективность которых основана на непосредственной блокировке пролиферации, стимулировании апоптоза и способности вызывать антитело- и комплимент-зависимую цитотоксичность (McKeage, Perry, 2002).
Антигены, высокая экспрессия которых обнаружена в подавляющем большинстве опухолей, объединены в особую группу антигенов -универсальные антигены. Поиск универсальных антигенов, появление которых отражало бы те общие закономерные события, позволяющие опухолевым клеткам проявлять свои злокачественные свойства: избегание апоптоза, неограниченную пролиферацию (бессмертие), независимость от рост-контролирующих сигналов, самодостаточность в пролиферативных сигналах, инвазию и метастазирование, и поэтому были бы свойственны злокачественным опухолям любого типа и только опухолевым клеткам, является особенно важным для онкотерапии и, в частности, иммунотерапии рака. Поскольку экспрессия таких антигенов была бы необходима для выживания и прогрессии опухоли, то иммунотерапевтические мероприятия, направленные к клеткам, несущие такие антигены, могли бы быть весьма успешными. В группу выявленных универсальных опухолеассоциированных антигенов вошли биомолекулы, синтезирующиеся более чем в 50 % опухолей с редкой встречаемостью или низким уровнем экспрессии соответствующих им генов в нормальных тканях: TERT, CYP1B1, сюрвивин и MDM2 (Gordan, Vonderheide, 2002). TERT - кодируется геном TERT, это одна из трех субъединиц теломеразы, а именно каталитическая субъединица этого фермента с обратно-транскриптазной активностью (Vonderheide et al., 1999). Теломеразная активность была обнаружена более чем в 85 % злокачественных опухолей человека, что делает теломеразу одним из наиболее часто синтезируемых антигенов среди всех прочих опухолевых антигенов (Kim N.W., Shay, Bacchetti, 1997; Ramakrishnan et al. 1998). Функция теломеразы уже достаточно хорошо изучена: именно этот фермент достраивает те-ломерные последовательности хромосом при каждом делении, делая тем самым клетки «бессмертными». В нормальных тканях теломеразной активностью обладают репродуктивные ткани, стволовые клетки крови и быстрообновляющиеся ткани, такие как кишечный эпителий, кератиноциты, эндометрий, но даже в этих популяциях клеток уровень активности этого фермента существенно ниже, чем в опухолевых. Активация генов теломеразы играет ключевую роль в иммортализации трансформированных клеток, и эта активация происходит без каких-либо изменений в структуре генов теломеразы, демонстрируя классический пример эпигенетических изменений на ранних этапах канцерогенеза. Роль теломеразы в прогрессии опухоли подтверждена наблюдениями, что ингибирование теломеразы в теломераза-позитивных опухолях человека приводит к тотальной гибели клеток in vitro, не оставляя никаких устойчивых клонов (Ramakrishnan et al., 1998; Hahn et al., 1999; Herbert etal., 1999.).
Другой универсальный антиген, сюрвивин (survivin), был впервые идентифицирован в опухолевых клетках как ингибитор апоптоза (Ambrosini et al., 1997), взаимодействующий с митотическим веретеном в ходе клеточного деления (Li et al., 1998), и тем самым он напрямую участвует в процессе канцерогенеза. Сюрвивин синтезируется в большинстве типов опухолей, таких как рак мозга, легких, печени, кишечника, молочной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря (Ambrosini et al., 1997; Velculescu et al., 1999), хотя в некоторых нормальных тканях также может наблюдаться некоторая экспрессия этого антигена. Ингибирование функций сюрвивина приводило к гибели клеток in vitro (Li et al., 1999) и подавляло рост опухоли (меланома мыши) in vivo (Grossman et al., 2001).
Антигенные изменения, сопровождающие развитие гепатоцеллюлярных опухолей
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), также называемая гепатомой, является наиболее частой формой злокачественных новообразований печени человека и занимает 5-е место по частоте возникновения злокачественных опухолей в мире. Наиболее часто ГЦК регистрируется в странах Азии и Африки (у 100 человек на каждые 100 000 населения), в то время как в Европе и Северной Америке подобный диагноз ставится гораздо реже (2-4 человека на 100 000 населения) (Bain, McMaster, 1997; Duvoux, 1998). Главным фактором риска возникновения ГЦК являются хронические гепатиты, вызванные вирусами гепатита В (HBV) и С (HCV), кроме того в 70 % случаев заболевания среди жителей Европы опухоль появлялась на фоне цирроза печени (Bain, McMaster, 1997). Способствующими факторами развития ГЦК служат также афлатоксин В1 (продукт гриба Aspergillus flavus, растущего на арахисе и злаках), мутации гена р53, повторяющиеся циклы некроза и регенерации и хронические воспаления (Sherman, 1995; Badvie, 2000). Радикальное лечение этого вида рака представляет пока неразрешенную задачу, и лишь при изолированных узлах небольшого размера удается выполнить их хирургическое удаление. Однако такие случаи редки, как правило, больных с ГЦК относятся к разряду неизлечимых и они подлежат лишь симптоматическому лечению. Течение ГЦК бурное и через несколько месяцев приводит к смерти больного. При операбельных опухолях средняя продолжительность жизни пациентов после операции составляет 3 года, 5-летняя выживаемость - около 20 %. При неоперабельных опухолях средняя продолжительность жизни пациентов после установления диагноза составляет 4 мес.
До сих пор остается спорным вопрос происхождения ГЦК - из стволовой или полу-стволовой клетки печени или же путем дедифференцировки зрелого ге-патоцита. Ряд исследователей придерживается точки зрения, что клетками-предшественниками опухоли являются, как правило, стволовые или полустволовые клетки, находящие на узловых стадиях дифференцировки, детерминированные к нескольким или одному направлению развития и способные к ограниченному (или неограниченному) самоподдержанию (Абелев, 20006; Shell, Pierce, 1994). Это представление поддерживается результатами исследований эксперимен тального гепатоканцерогенеза, проводимых на животных, показавших, что после воздействия (-ий) гепатоканцерогеном в печени крыс обнаруживается пролифера ция мелких, недифференцированных овальных клеток (так называемые овально клеточные пролифераты), являющихся бипотентными клетками предшественниками (способны дифференцироваться в гепатоциты и в клетки эпи телия желчных протоков - холангиоциты), и связанных впоследствии с развитием гепатоцеллюлярных неоплазм (Fausto, 1999; Grisham 1997; Shell, 1993). В послед ние годы и для человека было подтверждено существование популяции печеноч ных клеток-предшественников в печени (Theise et al., 1999) и в костном мозге (Theise et al., 2000; Alison et al., 2000; Korbling et al., 2002), а также получены дан ные, свидетельствующие об их роли в процессах гепатоканцерогенеза у человека (Theise et al., 2003). Наличие клинических случаев комбинированной опухоли - ге патоцеллюлярной холангиокарциномы (ГЦ-ХК), содержащей помимо компонентов гепатоцеллюлярной карциномы и холангиокарциномы недифференцированные клетки с морфологическими и гистохимическими признаками печеночных клеток предшественниц, поддерживает концепцию, что гепатоканцерогенез у человека, по-крайней мере иногда, может быть основан на трансформации клетки предшественницы. Однако, современные генетические подходы, использующие в качестве метки ретровирусный вектор, содержащий ген р-галактозидазы Е. coli и сигнал ядерной локализации, позволили доказать на модели гепатоканцерогенеза, вызванного диэтилнитрозамином (ДЭИА) после полного завершения регенерации печени крыс вследствие операции частичной гепатэктомии, что полученные в ре зультате опухоли происходили от зрелых гепатоцитов (Bralet et al., 2002). Таким образом, по-видимому, ГЦК может возникать и из стволовых клеток печени, и из зрелых гепатоцитов; уровнем дифференцированности клетки-предшественницы и определяется, как полагают, уровень дифференцированности опухоли (Абелев, 20006). Каким бы ни было происхождение пренеопластических узелков после воздействия канцерогенами, они способны долго существовать в печени в последующем либо рассасываясь, либо изредка образуя клон автономно растущей опухоли. Клетки пренеопластических узелков характеризуются накоплением рибосом, изменением реакции цитоплазмы от ацидофильной к базофильной, увеличением скоро 44 сти синтеза ДНК и числа митозов, снижением активности ферментов синтеза гликогена, ростом активности у-глютамилтранслептидазы, синтезом плацентарной формы глютатион-8-трансферазы (маркера пренеопластических клеток) (Bralet et al., 2002), реэкспрессией АФП, Межклеточные контакты в пренеопластических узелках разрушены и клетки отделены друг от друга. На этапе перехода от предра-ка к раку происходит транскрипционная или мутационная активация многих про-тоонкогенов (Pitot, Dragan, 1991). Дальнейшая прогрессия опухоли осуществляется за счет растущей нестабильности генома, приводящей к анеуплоидиям и другим хромосомным аберрациям, происходит отбор и накопление изменений, приводящих к ускорению пролиферации, появлению инвазивности, а на последних стадиях и способности к метастазированию. Несмотря на существование разнообразных экспериментальных моделей, ключевые механизмы прогрессии пока изучены недостаточно.
Перейдем теперь к рассмотрению антигенов характерных для уже сформировавшихся гепатоцеллюлярных злокачественных новообразований.
Мутантные антигены, К мутантним опухолеспецифическим антигенам, появление которых в ГЦК обусловлено мутацией определенных генов, относятся продукты генов га? (Tada et al,, 1990), р53, pRb, р-катенина (Butterfield 2004). Дисфункции протоонкогенов myc и ras вызывают нарушение системы контроля клеточного цикла, предотвращающей пролиферацию клеток с поврежденным геномом (Копнин, 20006). Мутации р53 встречаются приблизительно в трети ГЦК (22 - 46 %), коррелируют с большим размером опухоли, ее поздней стадией и/или дедиф-ференцировкой (Buendia, 2000) и рассматриваются как неблагоприятный прогностический признак (Honda et al., 1998) . Дисфункция опухолевых супрессоров р53 и pRb (обнаруживается в 20 - 25 % ГЦК) приводит к повышению числа ошибок при воспроизведении генетической информации и подавлению индукции апоптоза, повышает вероятность выживания клеток с повреждениями ДНК и при попадании их в кровоток, что ведет к значительному повышению вероятности метастазирования. Мутации катенина встречаются в 18 - 41 % ГЦК (Buendia, 2000; Hsu et al., 2000) и представляются одним из ранних событий гепатоканцерогенеза (Devereux et al., 1999).
Выявление гетероорганных антигенов на поверхности культивируемых клеток и их связь с пролиферативной активностью клеток
Подводя общий итог полученным результатам можно сказать, что антигенный спектр клеток гепатоцеллюлярных опухолей по сравнению с интактными ге-патоцитами обогащается одним из белков внеклеточного матрикса - ламинином, который синтезируется клетками исследованных гепатом крыс, связывается с плазматической мембраной опухолевых клеток посредством ряда мембранных компонентов и является необходимым, по-видимому, для пролиферативной активности клеток.
Данный гликопротеин не обнаруживается нами различными иммунологическими методами на гепатоцитах интактных крыс и тем самым характеризуется в отношении клеток гепатоцеллюлярных опухолей как опухолеассоциированный антиген. Будучи изначально выявленным нами на поверхности клеток химически индуцированных гепатом крыс с помощью органоспецифической антипочечной им-муносыворотки, данный антиген может быть причислен к гетероорганным опухолеассоциированный антигенам.
Интересен тот факт, что появление этого антигена является ранним событием в канцерогенезе печени, регистрируется на этапе начальных и, как правило, обратимых изменений в гепатоцитах после однократного воздействия на животных гепатоканцерогенами, что говорит об эпигеномном характере инициации данного синтеза. Но в то же время, уже установившимся гепатоцеллюлярным опухолям (во всех изученных нами случаях) синтез данного антигена свойственен, причем независимо от химического канцерогена, индуцировавшего каждую из этих опухолей, свидетельствуя о наличие закономерных событий, объединяющих пролифератив-ные процессы в печени при нормальный физиологической реакции органа на повреждение - регенерации (Иванов, Фель, 1979), и при канцерогенезе.
Целью настоящей работы было выявление, выделение и идентификация мембранного антигена, присущего почкам крыс и ассоциированного с опухолевой трансформацией гепатоцитов. Для достижения поставленной цели были получены специфические иммуносыворотки против «клеточных теней» почек крыс и против мембранных антигенов гепатоцеллюлярной опухоли крыс - асцитной гепатомы Зайдела. С помощью антиопухолевой иммуносыворотки было выявлено 10 мембранных опухолеассоциированных антигенов клеток гепатомы Зайдела, а также продемонстрировано наличие среди них антигена (-ов) почечной специфичности, являющихся периферическими белками плазматических мембран клеток. С помощью органоспецифической антипочечной иммуносыворотки среди мембранных белков клеток гепатомы Зайдела был выявлен опухолеассоциированный антиген с мол. массой около 200 кДа. Использование масс-спектрометрического анализа и иммуноблотинга позволило идентифицировать данный гетероорганный антиген как ламинин, по составу цепей соответствующий изоформе ламинина-8/9. Аналогичный гликопротеин был обнаружен и на поверхности клеток другой гепатоцеллюлярной опухоли крыс - гепатоме НТС. Взаимодействие органоспецифической антипочечной иммуносыворотки с другими гепатоцеллюлярными опухолями и ге-патоцитами крыс, подвергшихся однократному воздействию гепатоканцерогеном (последние также обнаружили реакцию с антиламининовой иммуносывороткой) предполагает, что и в этих случаях в составе мембранных белков выявляется ламинин.
Первая работа, продемонстрировавшая способность иммуносыворотки, полученной против мембранной фракции опухолевых клеток, реагировать с ламини-ном-1, появилась в 1984 году (McCoy et al., 1984). Результаты проведенных авторами этой работы экспериментов показали, что более злокачественный вариант клеточной линии фибросаркомы мыши отличается от менее злокачественного варианта своей способностью не только синтезировать и секретировать в культу-ральную среду ламинин (вернее, некий ламинин-подобный компонент, т.к. идентификации не проводилось и выводы основывались на иммунологически сходных реакциях выявленного компонента и ламинина-1 и их со-миграцией при электрофорезе), но и «встраивать» его в плазматическую мембрану клеток. Эти опухолевые клетки, по сравнению с вариантом клеток фибросаркомы не синтезирующим ламинин, обладали повышенным метастатическим потенциалом и способностью связываться с базальной мембраной через один из ее компонентов - коллаген IV типа, что, по-видимому, и обуславливало высокие метастатические свойства этой клеточной линии (Malinoff et al., 1984; McCoy et al., 1984), В дальнейшем ламинин, связанный с клеточной поверхностью (cell surface laminin), был обнаружен также на опухолевых клетках, трансформированных аденовирусом (Bober et al., 1988), на клетках асцитной карциномы Эрлиха (Song et al., 1993), асцитной гепатомы АН7974 крысы (Kawaguchi et al., 1994), карциномы легкого Льюис мыши (Abe et al., 1996). Что же представляет собой ламинин?
Ламинины - это растущее семейство гетеротримерных мультидоменных гликопротеинов (сс,р и у цепи), формирующих вместе с некоторыми другими гли-копротеинами и протеогликанами внеклеточный матрикс (ВКМ). Примером структурированного специализированного ВКМ, в котором ламинины выступают как главные неколлагеновые и тканеспецифичные компоненты, является базальная мембрана (БМ). БМ подстилает эпителиальные клетки, разделяет в почечных клубочках и легочных альвеолах эпителиальные и эндотелиальные клетки, индивидуально окружает многие мезенхимные клетки (жировые, мышечные и шванновские клетки). Все эндотелиальные клетки лежат на БМ, кроме эндотелиальных клеток синусоидов печени, селезенки, лимфатических узлов и костного мозга (Martinez-Hernandez, Amenta, 1995).
Первый член семейства ламининов, в настоящее время известный как лами-нин-1 (alpUyl), был выделен почти 30 лет назад из матрикса EHS опухоли мыши и (Chung et al,, 1977; 1979). На рисунке 22 представлено схематическое изображение молекулы ламинина-1 (Sasaki et al., 1988).
Подтверждение результатов масс-спектрометрического анализа методами иммуноблотинга и непрямой иммунофлуоресценции
Появление ламинина в паренхиме печени после воздействия на крыс гепато-канцерогеном было показано и в настоящей работе, и в более ранних работах нашей лаборатории, где, по-видимому, именно ламинин обеспечивал взаимодействие органоспецифической антипочечной сыворотки со срезами печени крыс, подвергшихся однократному воздействию гепатоканцерогенами ДАБ и ДЭНА (Иванов и др., 1979,Ivanov,FeI, 1980).
В клинической практике экспрессия ламинина гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) выявляется в 86 % случаев (Yoshida et al., 1996). Отметим, что это показатель больше, чем для а-фетопротеина - клинического маркера гепатоцеллюляр-ных карцином, который обнаруживается в крови у 50-80 % больных с данной патологией (Buitterfield, 2004). В первичных узлах ГЦК, но не в нормальной или окружающей опухоль ткани печени, был обнаружен ламинин-5 (аЗрЗу2), Наличие у2 цепи ламинина оказалось ассоциированным (96 % при Р 0.001) с появлением метастазов и с плохим прогнозом исхода заболевания. Эта цепь ламинина неизменно выявлялась внутриклеточно в верхушке метастазирующего узла опухоли (Giannelli et al, 2003), что характерно для инвазирующих карцином разного гистогенеза, но биологическое значение этой цепи ламинина в инвазирующих опухолевых клетках до сих пор остается неизвестным. На гепатоцитах in vitro было продемонстрировано, что ламинин-5 способствует их подвижности и рассеиванию. Интересно, что ламинин-5 может действовать в определенных условиях как фактор подвижности, а при других условиях как фактор адгезивности в зависимости от стадии протеоли-тического процесса. Например, плазмин расщепляет аЗ цепь ламинина, делая ламинин-5 адгезивным (Goldfinger et al., 1998), тогда как матриксные металлопротеа-зы МТ1-ММР и, в меньшей степени, ММР-2 запускают миграцию клеток на лами-нине-5 посредством расщепления у2 цепи (Koshikawa et al., 2000). Огата с соавторами (Ogata et al., 1999) показали, что повышение экспрессии МТ1-ММР и ММР-2, выявленное в гепатомных клетках, связано с опухолевой дедиффиренцировкой клеток, и они вовлекаются в процесс инвазии гепатоцеллюлярных карцином. Другие авторы показали наличие yl цепи ламинина в опухолевых узлах гепатоцеллю 101 лярных карцином человека и определили роль транскрипционного фактора Spl в активации гена, кодирующего эту цепь ламинина - LamC 1 (Lietard et al., 1997).
Таким образом, появление ламинина в паренхиме печени связано с рядом физиологических и патологических процессов, и изоформы экспрессируемого ламинина могут быть, по всей видимости, разными. Композиция цепей ламинина определяет дальнейшее поведение гепатоцитов, влияя через специфические рецепторы на их функции и фенотип. Обнаруженные нами на поверхности клеток асцит-ной гепатомы Зайдела и культивируемых клеток гепатомы НТС pi, р2 и у! цепи ламинина являются типичными цепями ламинина, выявляемыми в паренхиме печени в ходе гепатогенеза, при регенерации печени и при канцерогенезе.
Цепь ламинина а4, регистрируемая нами масс-спектрометрическим методом, является самой короткой из известных пяти альфа цепей ламинина и представлена в ламинине-8 (ct4piyl) и ламинине-9 (a4p2yl). Эта цепь ламинина экс-прессируется в основном клетками мезенхимального происхождения, такими как эндотелиальные клетки, адипоциты, стромальные клетки костного мозга, выявляется в базальных мембранах скелетных и сердечной мышц, легочной ткани, почек и субэндотелиальных базальных мембранах капилляров, особенно в эмбриогенезе (Niimi et аі., 1997; Petajaniemi et al., 2002). Слабая экспрессия мРНК для этой цепи была показана и в некоторых других органах, в том числе в печени (Iivanainen et al., 1997), но сведений о ее клеточном источнике или функциональной роли в печени не имеется. Известно, что ламинин-8, связанный с базальными мембранами эмбриональных тканей и капилляров, стимулирует клеточную миграцию и может играть ключевую роль в ходе эмбрионального развития, заживления раневых повреждений и в ангаогенезе (Fujiwara et al., 2001; Li et a]., 2003). Гиперэкспрессия a4 цепи ламинина выявлена при глиомах человека, и повышение синтеза ламинина-8 коррелирует с плохим прогнозом для пациентов с глиомой головного мозга. Казен-зон с соавторами (Khazenzon et al., 2003) показали, что ламинин-8 при глиомах может требоваться не только для неоваскуляризации, но напрямую повышает инва-зивный потенциал опухолевых клеток. Ламинин-8 и ламинин-9 — еще малоизученные изоформы ламинина. Представленные в литературе данные не исключают возможности синтеза а4 цепи ламинина гепатоцеллюлярными опухолями. Таким образом, обнаружение нами масс-спектрометрическим методом а4 цепи ламинина на клетках асцитной гепатомы Зайдела и культивируемых клетках гепатомы НТС крысы является интересным фактом и перспективной темой дальнейших исследований.
В клинических исследованиях оценку сывороточного уровня ламинина считают полезным инструментом и даже маркером при различных заболеваниях человека. Рядом авторов подтверждено, что повышение сывороточного уровня ламинина может служить маркером при фиброзах и циррозах печени, отражая и степень выраженности патологического процесса (Collazos et al., 1993; Tanikawa, 1994; Montalto et al., 1996; Korner et al., 1996). Причиной такого повышения считают микроангиопатические изменения в печени, при которых, как мы рассматривали выше, происходит накопление внеклеточного матрикса и образуются базальные мембраны вдоль синусоидов, превращая их в капилляры. Повышение уровня сывороточного ламинина обнаруживают и у пациентов со злокачественными новообразованиями различных локализаций, в том числе и при гепатоцеллюлярной карциноме, особенно отмечая его рост с появлением метастазов, распространяющихся по кровеносным или лимфатическим сосудам (Yudoh et al., 1994; Mungan et al., 1996; Iwahashi et al., 1997; Sidhom, Imam, 1999). В норме отмечено лишь одно состояние, при котором в сыворотке крови обнаруживается повышение уровня ламинина - в течение беременности, и это повышение связывают прежде всего с ростом плаценты, органа с выраженными базальными мембранами (Rudelstorfer et al., 1990).
