Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1 .Эпидемиология и классификация опухолей головного мозга. Особенности новообразований ЦНС 11
1.2. Методы лечения опухолей головного мозга 13
1.3.Фотодинамическая терапия (ФДТ): суть метода и основные направления развития 17
1.3.1. Фотосенсибилизаторы первого поколения 24
1.3.2. Фотосенсибилизаторы второго поколения 26
1.3.3. Источники света, лазерное облучение 28
1.4. Флуоресцентная диагностика и ФДТ опухолей головного мозга 30
ГЛАВА II. Материалы и методы 41
2.1. Препараты 41
2.2. Опухолевые модели 43
2.3. Методика перевивки опухоли 44
2.4. Методика хирургического удаления опухоли 45
2.5. Измерение накопления фотосенсибилизатора в опухолевой и нормальной ткани мозга 45
2.6. Фотодинамическая терапия 46
2.7. Патоморфология 46
2.8. Оценка проницаемости сосудов опухоли до и после ФДТ 47
2.9. Статистический анализ данных 48
ГЛАВА III. Результаты эффективности фотодинамической терапии с фотосенсом 49
3.1. Изучение уровня и селективности накопления Фотосенса в глиобластоме 101/8 49
3.2. Разработка режима проведения ФДТ с Фотосенсом на глиобластоме
101/8 53
3.3. Изучение уровня и селективности накопления Фотосенса в глиоме Сб..61
3.4. Эффективность ФДТ с использованием Фотосенса в монотерапии 64
3.5. Оценка выживаемости крыс после хирургического удаления глиомы С6 крыс 73
3.6. Оценка радикальности резекции глиомы С6 спектрально-флуоресцентным методом 75
3.7. Оценка эффективности ФДТ с использованием Фотосенса после предварительного удаления опухоли 77
3.8. Патоморфологическое изучение рецидивирования глиомы С6 после хирургического удаления первичного очага и последующей ФДТ с
использованием Фотосенса 79
ГЛАВА IV. Результаты эффективности фотодинамической терапии с тиосенсом 85
4.1. Изучение уровня и селективности накопления липосомальнои дисперсии Тиосенса в глиобластоме 101/8 и нормальной ткани мозга крыс 85
4.2. Оценка эффективности ФДТ с липосомальнои дисперсией Тиосенса в монотерапии на глиобластоме 101/8 87
4.3. Оценка эффективности ФДТ с Тиосенсом на глиобластоме 101/8 после краниотомии 4x5 мм 89
4.4. Оценка эффективности ФДТ с Тиосенсом на глиобластоме 101/8 после краниотомии 4x5 мм и последующей химиотерапии с Темодалом 92
4.5. Изучение уровня и селективности накопления липосомальнои дисперсии Тиосенса в глиоме С6 и нормальной ткани мозга крыс 94
4.6. Оценка эффективности ФДТ с использованием Тиосенса в монотерапии на глиоме С6 98
4.7. Оценка эффективности ФДТ с использованием Тиосенса на глиоме С6 после краниотомии 4x5 мм 100
4.8. Оценка эффективности комбинированного лечения глиомы С6, включающего хирургическое удаление опухоли и интраоперационную ФДТ с Тиосенсом 101
4.9.0ценка эффективности комбинированного лечения глиомы С6 по патоморфологическому критерию 103
4.10. Оценка эффективности ФДТ с использованием Тиосенса на глиоме С6 с последующей химиотерапией ПО
4.11. Оценка эффективности комбинированного лечения глиомы С6:
удаление опухоли + ФДТ с Тиосенсом + химиотерапия 115
ГЛАВА V. Обсуждение полученных результатов 117
Vi. Выводы 135
Vii. Список литературы
- Фотосенсибилизаторы первого поколения
- Оценка проницаемости сосудов опухоли до и после ФДТ
- Оценка радикальности резекции глиомы С6 спектрально-флуоресцентным методом
- Оценка эффективности ФДТ с липосомальнои дисперсией Тиосенса в монотерапии на глиобластоме 101/8
Введение к работе
Первичные злокачественные опухоли головного мозга составляют около 1,5-2% от всех новообразований человека и характеризуются способностью к быстрой пролиферации, ангиогенезу и инвазивному росту. Глиомы составляют около 77% первичных злокачественных опухолей мозга и включают астроцитомы (астроцитома, анапластическая астоцитома, мультиформная глиобластома), олигодендроглиомы, эпендиомы и смешанные глиомы.
Лечение злокачественных глиом комбинированное и включает в себя хирургическое удаление опухоли, лучевую и химиотерапию. Основным ограничением нейрохирургии является плохая визуализация границ опухоли и особенности ее локализации. Радикальная резекция опухоли в большинстве случаев невозможна, т.к. иссечение здоровой ткани мозга с инфильтрирующими ее опухолевыми клетками не допустимо из-за высокой вероятности развития тяжелых неврологических осложнений. Поэтому мультиформные глиобластомы (глиомы IV степени злокачественности – классификация ВОЗ) рецидивируют в 100% случаев, чаще всего в пределах 2 см от места резекции первичной опухоли. Лучевая и химиотерапия применяются в основном в послеоперационном периоде с целью профилактики возникновения рецидивов.
Несмотря на современные достижения в области нейрохирургии, химиотерапии и лучевой терапии, прогноз для больных со злокачественными глиомами остается крайне неблагоприятным. Так, медиана выживаемости больных с мультиформной глиобластомой после частичной резекции опухоли составляет 8,8 месяцев, при радикальной резекции – 11 месяцев. После лучевой терапии медиана выживаемости не превышает 12 месяцев, при сочетании лучевой терапии и химиотерапии с темодалом - 15 месяцев. Повышение эффективности традиционных методов лечения глиом идет по разным направлениям. Главными из них являются поиск новых методов терапии и совершенствование комбинированного лечения опухолей головного мозга.
Фотодинамическая терапия (ФДТ) является принципиально новым методом в лечении злокачественных опухолей головного мозга, основанным на способности фотосенсибилизаторов селективно накапливаться в ткани опухолей вследствие особенностей биохимии злокачественной клетки и при локальном воздействии лазерного облучения определенной длины волны генерировать образование синглетного кислорода и других активных радикалов, оказывающих цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Эффективность фотодинамического повреждения сенсибилизированной клетки определяется внутриклеточной концентрацией сенсибилизатора, его локализацией в клетке и фотохимической активностью (квантовым выходом генерации синглетного кислорода или свободных радикалов), подводимой световой дозой лазерного облучения. Кроме прямого цитотоксического воздействия ФДТ на опухолевые клетки, важную роль в деструкции новообразования играют: нарушение кровоснабжения за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов опухолевой ткани; цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов.
В ряде экспериментов in vitro и in vivo, а также в клинических исследованиях, была подтверждена эффективность фотодинамической терапии опухолей головного мозга с использованием в качестве фотосенсибилизаторов Фотолона, Аласенса, Фотофрина, Гематопорфирина, Фоскана и некоторых других фотосенсибилизаторов. При использовании интра- и послеоперационной ФДТ медиана выживаемости достигает 21 мес.
ФДТ имеет преимущества перед лучевой и химиотерапией при комбинированном лечении опухолей головного мозга. Во-первых, это локальная форма терапии, которая обладает низкой системной токсичностью. Во-вторых, к настоящему времени не получено данных о возможности развития устойчивости при повторном использовании ФДТ. В связи с высокой поглощающей способностью сенсибилизированной ткани опухоли, свет проникает ограниченно, в связи с чем возможно многократное проведение ФДТ, что, вероятно, приведет к увеличению медианы выживаемости больных с опухолями головного мозга. Для достижения оптимального терапевтического эффекта лазерного облучения необходимо длительное облучение инфильтрирующих опухолевых клеток не удаленных во время резекции.
Одним из важных направлений повышения эффективности фотодинамической терапии является поиск фотосенсибилизаторов (ФС) с поглощением в спектральном диапазоне 700-800 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей минимально. Использование таких ФС позволяет минимизировать потери на собственное поглощение ткани, увеличить глубину проникновения возбуждающего света и повысить терапевтическую эффективность.
Цель исследования
Изучение эффективности ФДТ с использованием отечественных фотосенсибилизаторов Фотосенса и Тиосенса в монотерапии и при комбинированном лечении экспериментальных глиом.
Задачи исследования
-
Оценить проницаемость ГЭБ для Фотосенса и Тиосенса по уровню и селективности накопления этих фотосенсибилизаторов в глиомах крыс.
-
Определить терапевтическую дозу фотосенсибилизатора и разработать оптимальный режим лазерного облучения для опухолей головного мозга крыс.
-
Оценить эффективность ФДТ с использованием Фотосенса и Тиосенса на глиомах крыс в монотерапии по критерию увеличения продолжительности жизни, медиане выживаемости и патоморфозу опухолей.
-
Оценить эффективность комбинированного лечения глиомы С6 и глиобластомы 101/8 крыс.
Научная новизна
Впервые в отечественной практике в эксперименте на моделях злокачественных глиом изучена эффективность фотодинамической терапии с применением новых фотосенсибилизаторов. Разработан оптимальный режим лазерного облучения и выявлена терапевтическая доза Фотосенса и Тиосенса для ФДТ экспериментальных глиом.
Впервые в отечественной практике в эксперименте изучена эффективность комбинированного лечения опухолей головного мозга с включением интраоперационной ФДТ и последующей химиотерапии.
Впервые в отечественной практике определен наиболее оптимальный порядок проведения ФДТ и химиотерапии при комбинированном лечении экспериментальных злокачественных опухолей головного мозга.
Практическая значимость работы
В результате проведенных исследований разработан и экспериментально обоснован комбинированный метод лечения злокачественных глиом человека, включающий хирургическое удаление первичного очага, использование ФДТ с отечественными фотосенсибилизаторами Фотосенсом и Тиосенсом и химиотерапии.
Составлен протокол клинических испытаний ФДТ с Фотосенсом при опухолях головного мозга.
Апробация работы
Материалы приведенных в диссертационной работе исследований были представлены на следующих научных сообществах:
- Заседание Ученого совета НИИ ЭДиТО;
- IX Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения»;
- VI, VII, VIII и IX Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты».
- III Евразийский конгресс по медицинской физике.
- Совместная конференция подразделений НИИ ЭДиТО и НИИ КО РОНЦ имени Н.Н. Блохина РАМН, 18 июня 2010 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация содержит 150 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 4 отечественных и 135 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 59 рисунками и 18 таблицами.
Фотосенсибилизаторы первого поколения
Частота первичных опухолей центральной нервной системы составляет от 7,42 до 13,9/100 000 населения в год. Результаты наиболее крупных эпидемиологических исследований за последние 50 лет свидетельствуют об увеличении числа первичных опухолей в 1,5 - 3 раза, вторичных (метастатических) в 6 и более раз (Лукас В.Э., 1979; Самойлов В.И., 1985; DeAngelis L.M., 2005).
По встречаемости среди опухолей ЦНС выделяют наиболее распространенные группы: глиальные опухоли (глиомы) и менингиомы. Однако, большинство менингиом представляют собой доброкачественные новообразования, тогда как большинство глиом являются злокачественными (Ito S., 2005).
Злокачественные глиомы являются наиболее частыми первичными опухолями ЦНС у взрослых (Simmons ML, 2001). По гистологическому критерию в порядке возрастания злокачественности их подразделяют на астроцитомы (стадии I и И), анапластические астроцитомы (стадия III), глиобластомы и мультиформные глиобластомы (стадия IV). Глиомы низкой степени злокачественности часто прогрессируют в высоко злокачественные глиомы, в то же время последние часто могут возникать DE NOVO (Kollias SS, 1998).
Мультиформные глиобластомы являются самыми злокачественными и составляют 10% детских (Gilbert M.R., 2004) и 20% взрослых опухолей ЦНС (Kaneko S, 2005). Средняя продолжительность жизни больных с мультиформной глиобластомой, несмотря на современные методы лечения, не превышает 1 года (Burton Е.С., 2000).
Опухоли ЦНС отличаются от новообразований другого происхождения рядом специфических черт (Clarke L.P., 1998; Lee J., 2006). Одной из особенностей опухолей этой локализации является их рост в закрытом пространстве черепной коробки, что приводит к появлению выраженных неврологических симптомов при небольшом объеме опухоли. Следовательно, даже при опухолях с низкой степенью злокачественности, прогноз крайне неблагоприятный. Кроме того, зачастую невозможно произвести общепринятое при злокачественных новообразованиях удаление в пределах здоровых тканей вследствие высокой вероятности развития тяжелых неврологических осложнений (Pannullo S.C., 2006).
На диагностику и лечение опухолей мозга большое влияние оказывает наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), в нормальном состоянии препятствующего поступлению в мозг многих соединений, включая рентгеноконтрастные вещества и химиотерапевтические агенты. В процессе роста злокачественных глиом отмечается нарушение проницаемости ГЭБ в связи с морфологическими изменениями сосудов опухоли, особенно в активно растущей периферической зоне опухоли (Hammoud М.А., 1996).
Еще одной особенностью глиом является отсутствие в мозге лимфатической системы. Накапливающаяся в опухоли жидкость не может быть удалена иначе, как при помощи диффузии к ликвороносным пространствам. Результатом этого является нарастающее повышение ВЧД и увеличение неврологической симптоматики.
Кроме того, опухоли ЦНС крайне редко метастазируют, однако склонны к инфильтративному росту и рецидивированию в пределах 2-3 см от первичного очага. Важными процессами, обеспечивающими рост и распространение глиальных опухолей, являются процессы инвазии и ангиогенеза. Процесс инвазии заключается в адгезии клеток к клеточному матриксу, в которой участвуют мембранные гликопротеины, и его локальном разрушении с помощью металлопротеиназ (Payne M.J., 2005). Известно также, что клетки глиом секретируют фактор роста эндотелия сосудов, который, по-видимому, является центральным фактором ангиогенеза, так как в эндотелиальных клетках выявляется повышенное количество его рецепторов (Uzdensky А.В., 2003).
Все вышеописанные особенности опухолей головного мозга привели к поиску специфических методов лечения и трансформации традиционных методов.
Методы лечения опухолей головного мозга. Лечение злокачественных глиом головного мозга составляет одну из наиболее сложных задач в нейроонкологии. На современном этапе наиболее эффективным является комбинированный подход к лечению злокачественных глиом, включающий хирургическое удаление опухоли, лучевую терапию, химиотерапию, а также ряд новых методов лечения: иммунотерапию, антиангиогенную, фотодинамическую терапию (Roch М., 2000).
Основными факторами, влияющими на прогноз больных со злокачественными глиомами, являются: гистологическая степень злокачественности опухоли, возраст пациентов, тяжесть состояния больных при поступлении в клинику и после операции, радикальность хирургического вмешательства (Barnett G.H., 1999).
Основной целью оперативного вмешательства является максимально полное удаление опухоли, а также постановка точного гистологического диагноза. После хирургического удаления опухоли повышается качество жизни большинства больных, как правило, уменьшаются или исчезают неврологические симптомы. Удаление опухоли уменьшает количество неопластических клеток, что может изменить клеточную кинетику, а также уменьшить статистическую вероятность малигнизации в клеточной популяции (Kloek J., 1998). Кроме того, удаление опухоли приводит к снижению внутричерепного давления (ВЧД) как за счет удаления прилежащего малофункционального белого вещества мозга, так и за счет краниотомии.
Лучевая терапия является одним из методов послеоперационной терапии и в ряде случаев приводит к повышению продолжительности жизни, в особенности пациентов моложе 65 лет. Лучевую терапию рекомендуют проводить почти всем больным с анапластическими астроцитомами, глиобластомами, а также больным с анапластическими олигодендроглиомами, смешанными глиомами и анапластическими эпендимомами. Общепринятая фракционированная лучевая терапия обычно выполняется с использованием высокой энергии фотонных лучей, генерированных магнитными ускорителями, или же используется телегамматерапия. Традиционная схема состоит из проведения 25-30 сеансов облучения в течение 5-6 нед. Частота облучения 5 раз в неделю в дозе 1,8-2,0 Гр, используя 3 поля подведения (Chacko A.G., 2003). Общая суммарная доза облучения составляет 60 Гр. Наряду с обычной лучевой, терапией может применяться радиохирургия и брахиотерапия, однако рандомизированные исследования не выявили значительного увеличения выживаемости больных.
Химиотерапевтическое лечение в сочетании с предварительным удалением опухоли и послеоперационной лучевой терапией позволяет повысить одно- и двухлетнюю выживаемость больных со злокачественными глиомами (Gray F., 1996) .
Оценка проницаемости сосудов опухоли до и после ФДТ
Темодал (Шеринг-Плау, США) вводили дважды per os в суммарной дозе 50 мг/кг. Лизомустин вводили однократно внутривенно в дозе 80 мг/кг. Использовали лиофилизат для приготовления раствора (100 мг во флаконе, ООО «ГЛЭС», Москва)
Опухолевые модели. Глиома С6 была получена Benda К., Schmidek J. и соавт. в Sweet s лаборатории (Германия) у крыс породы Wistar путем повторного введения нитрозометилмочевины в течение 8 месяцев. Затем эта опухоль была выделена и переведена в клеточную культуру. Эта опухоль по гистологическому строению классифицирована как астроцитома, которая имеет сходство с глиомой человека. Глиома С6 поддерживается in vitro как клеточная культура в ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
Глиобластома 101/8 была получена в феврале 1967 года на 186-ой день после имплантации пилюли 7,12-диметил-а-бензантрацена (ДМБА) в правое полушарие мозжечка крысы-самки породы Wistar (Яблоновская, Спрышкова, 1971). Первоначально - протоплазматическая астроцитома, состоящая из мономорфных астроцитарных клеток с эксцентрично расположенными ядрами. Срок развития на первых пассажах составил в среднем 32 дня, а прививаемость - 50%. Начиная с 14 пассажа произошло озлокачествление опухоли. Сначала она приобрела строение анапластической астроцитомы с участками мультиформной глиобластомы, типичными некрозами и многочисленными митозами. Вскоре после этого опухоль 101/8 приобрела более устойчивое строение изоморфной злокачественной глиобластомы, которое устойчиво сохранялось на протяжении всей дальнейшей работы с данной опухолью. Ампулы с опухолевым материалом хранились в замороженном состоянии в жидком азоте (при —196С) в лаборатории экспериментальной гистопатологии ЦНС НИИ морфологии человека РАМН. Для экспериментальных исследований опухоли поддерживались с помощью интрацеребрального пассирования на беспородных крысах.
Методика перевивки опухоли.
Перед трансплантацией животных анестезировали хлоралгидратом (3,6% раствор по 1,0 мл) внутрибрюшинно. Кожу головы обрабатывали спиртом, а затем йодом. Трансплантацию опухоли в мозг производили через трепанационное отверстие в теменной кости черепа на расстоянии 2-3 мм справа от сагиттального шва и 2 мм каудально от венечного шва, которое наносили зубоврачебным шаровидным бором диаметром 1,5 мм. В случае глиобластомы 101/8 размельченную ткань опухоли (1-2 млн. опухолевых клеток) подсаживали троакаром на глубину 3-4 мм в дно правого бокового желудочка (верхние отделы таламуса и хвостатого ядра). В случае глиомы С6 опухолевые клетки (400 х 103) в 10 мкл среды RPMI-1640 шприцем «Hamilton» с ограничителем на конце иглы вводили в мозг на глубину 3-4 мм, т.е. в полость правого бокового желудочка, достигая дна желудочка. В случае появления кровотечения его останавливали перекисью водорода. В рану помещали порошок стрептоцида или другие сульфамидные препараты. Края кожной раны сближали- и заклеивали коллодием. Прививаемость составила - 90-100%.
Методика хирургического удаления опухоли.
На пятый день после перевивки крыс реанестезировали хлоралгидратом (3,6% раствор по 1,0 мл) внутрибрюшинно, животных фиксировали к операционным столикам. После кожного разреза и удаления мягких тканей в области теменной кости вокруг трепанационного отверстия буром выпиливали участок кости размером 4X5 мм. Кость надламывали и удаляли вместе с твердой мозговой оболочкой, часть опухолевого узла извлекали с помощью хирургической ложечки с острыми краями. После удаления опухоли для остановки кровотечения в ложе опухоли помещали гемостатическую губку соответствующего размера. В конце хирургической процедуры и облучения проводили контроль гемостаза и наложение швов.
Измерение накопления фотосенсибилизатора в опухолевой и нормальной ткани мозга.
Уровень накопления Фотосенса и Тиосенса в ткани мозга и опухоли крыс осуществляли спектрально-флуоресцентным методом с использованием спектроанализатора "ЛЭСА-01-БИОСПЕК". Возбуждение флуоресценции проводилось He-Ne лазером с длиной волны 632,8 нм в случае Фотосенса и лазером "ЛФД-730-01-БИОСПЕК" с длиной волны 720 нм в случае Тиосенса. Концентрация (уровень накопления) фотосенсибилизатора выражалась в условных единицах (усл. ед.) и оценивалась по интегральной интенсивности его флуоресценции путем сравнения ее с интенсивностью флуоресценции фталоцианин-содержащего полимерного образца с известной концентрацией фталоцианина, сопоставимой с терапевтической концентрацией, и оптическими характеристиками рассеивания, близкими к свойствам человеческих тканей. Селективность накопления Фотосенса и Тиосенса рассчитывали как отношение интенсивности флуоресценции препарата в опухоли и в здоровой ткани мозга и выражали в виде индекса селективности.
Фотодинамическая терапия.
Для проведения ФДТ с использованием Фотосенса и Тиосенса, препараты вводили крысам за 24 часа перед облучением в хвостовую вену в дозах 2 мг/кг и 3 мг/кг, соответственно. С целью уменьшения отека мозга после проведения ФДТ вводили дексаметазон подкожно в дозе 1 мг/кг. ФДТ проводили двумя способами: опухоль облучали поверхностно через твердую мозговую оболочку, либо интерстициально с помощью специального световода, вводимого в полость черепа через трепанационное отверстие на глубину 1 мм. При облучении использовали лазер ЛФТ-630/670-01-БИОСПЕК и ЛФД-730-01-БИОСПЕК для Фотосенса и Тиосенса, соответственно. Величина мощности облучения и время воздействия варьировали: от 50 мВт/см" до 200 мВт/см и от 5 минут до 10 минут, соответственно.
Оценка радикальности резекции глиомы С6 спектрально-флуоресцентным методом
Учитывая литературные данные, свидетельствующие о значительной корреляции между объемом резецируемой глиомы и продолжительностью жизни пациентов (Quinn J.A., 2002; Stupp R., 2005) оценивали радикальность проведенной операции спектрально-флуоресцентным методом. Для этого на 7 день опыта животных реанестезировали. Далее выполняли теменную краниотомию с правой стороны размером 5x4 мм. Во время операции удаляли максимально возможный объем глиомы Сб. Контроль за объемом, резецируемой глиомы, проводили спектрально - флуоресцентным методом по интенсивности флуоресценции в ложе опухоли Фотосенса, который вводили за 24 часа до операции. Учитывая данные о высоком накоплении фотосенсибилизаторов в коже, для контроля динамики накопления Фотосенса в организме, измеряли интенсивность флуоресценции в коже уха и лапы (области тела, где отсутствует шерсть).
Флуоресцентные исследования показали, что без хирургического вмешательства (рис.24) или после удаления лишь небольшого объема опухоли (рис.26) наблюдалась интенсивная флуоресценция; при радикальных операциях (рис. 25) уровень флуоресценции значительно снижался (ниже уровня флуоресценции на лапе). Флуоресцентные исследования также позволили обнаружить после радикально выполненных операций отдельные небольшие фокусы опухолевых клеток. После ФДТ интенсивность флуоресценции Фотосенса в ложе опухоли не измеряли из-за скопления в нем крови и образования струпа в результате лазерного воздействия, а, следовательно, высокой вероятности ложноположительных результатов. і
Уровень флуоресценции Фотосенса в ложе опухоли С6, коже уха и стопы. После удаления опухоли. Таким образом, при резекции глиомы С6 удалось радикально удалить опухоль у 4-х из 7 крыс (в 57% случаев) и у 2-х из 7 (в 29% случаев) выявлялись отдельные небольшие фокусы опухолевых клеток.
Оценка эффективности ФДТ с использованием Фотосенса после предварительного удаления опухоли.
С целью уменьшения количества крыс, погибающих от внутричерепной гипертензии вследствие отека мозга, проводили декомпрессию путем краниотомии размером 4x5 мм и введение в течение 5 дней после операции дексаметазона в дозе 1 мг/крысу. Параметры лазерного облучения составляли: 100 мВт/см в течение 15 минут.
Средняя продолжительность жизни контрольных животных, которым не выполняли никакие лечебные вмешательства, составила 20,4 дней (табл. 7). Средняя продолжительность жизни животных, которым выполняли только декомпрессионную краниотомию размером 5 х 4 см и удаление максимально возможного объема опухолевой ткани составила 24,7 дня. Средняя продолжительность жизни животных, которым после краниотомии и удаления опухоли проводили ФДТ с Фотосенсом практически не отличалась от СПЖ предыдущей опытной группы и составила 24,9 дней. Увеличение продолжительности жизни составило 21 и 22%, соответственно (рис. 27). Нам не удалось значительно повысить эффективность лечения с помощью ФДТ. Незначительная разница в УПЖ между группами, вероятно, связана с недостаточным размером краниотомического отверстия, т.е. недостаточной декомпрессионной терапии, что приводило к развитию отеку мозга. При попытке расширить краниотомическое отверстие, крысы погобали от массивного кровотечения, вследствие повреждения венозных синусов.
3.8. Патоморфологическое изучение рецидивирования глиомы С6 после хирургического удаления первичного очага и последующей ФДТ с использованием Фотосенса.
При патоморфологическом изучении рецидивирования глиомы С6 крыс разделили на 2 группы: контрольная - 9 крыс, которым проводили только ФДТ с Фотосенсом и опытную — 10 крыс, у которых удаляли опухоли и проводили интраоперационную ФДТ с Фотосенсом. На 6 день опыта вводили Фотосенс в дозе 2 мг/кг, а на 7 день опыта животных реанестезировали. После удаления опухоли ложе облучали лазером с параметрами: 100 мВт/см" в течение 15 минут. Далее каждые 3 дня по 3 крысы из группы декапитировали, отделяли черепную коробку вместе мозгом и помещали в 10% раствор формалина. Через 10 дней выделяли мозг и оценивали опухоль макроскопически, а затем микроскопически после приготовления гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином.
Примечание: в окружающей ткани выявляется некроз, отек, полиморфноядерно-лейкоцитарная инфильтрация, тромбоз сосудов и кровоизлияния, пролиферация глиальных элементов и эндотелиоцитов и фибробластических элементов оболочек, продуктивные васкулиты, острая воспалительная реакция, острые гемодинамические нарушения и реактивные изменения в мозговых оболочках, репаративные изменения в нервной ткани.
Из таблицы 8 следует, что в контрольной группе у всех 9 крыс микроскопически выявлены опухолевые клетки (в 100% случаев), а макроскопически опухолевая ткань наблюдалась у 6 из 9 (в 66,7% случаев), тогда как в опытной группе из 10 крыс макроскопически опухоль выявлена у 3 (в 30% случаев), а микроскопически - у 7 из 10 крыс (в 70% случаев). Жизнеспособная опухолевая ткань сохранялась после ФДТ в глубине мозговых извилин. Эти данные позволяют сделать заключение, что при комплексном лечении глиомы С6 рецидивы возникают на 30% реже, чем при использовании ФДТ в монотерапии.
Площадь некроза в контрольной группе составила 55,5%, а в опытной — 87,5%. Процент жизнеспособной опухолевой ткани с митозами в контрольной группе выше (около 50%) по сравнению с опытной (20%). В связи с выраженным отеком и некрозом, а также гемодинамическими изменениями в прилежащей ткани макроскопически определяемые размеры узла в обеих группах превышали размеры, выявленные при микроскопическом исследовании.
Рецидивы возникали вследствие сохранения жизнеспособных опухолевых клеток в глубине мозговых извилин, как в группе подвергшийся только ФДТ, так и при комбинированном применении хирургической резекции опухоли и интраоперационной ФДТ - на 6 - 9 день после лечения (рис.28-35).
Оценка эффективности ФДТ с липосомальнои дисперсией Тиосенса в монотерапии на глиобластоме 101/8
Около 2% больных со злокачественными новообразованиями умирают от опухолей головного мозга (Peng Q., 1990). Наиболее опасными являются высокозлокачественные анапластическая астроцитома и мультиформная глиобластома. В настоящее время не существует методов их излечения. Несмотря на комбинированное лечение, включающее резекцию опухоли, послеоперационную лучевую и химиотерапию, прогноз для больных, страдающих опухолевыми заболеваниями головного мозга, остается крайне неблагоприятным. Хирургический метод лечения направлен на максимально полное удаление опухоли, что приводит к снижению повышенного внутричерепного давления, а, следовательно, уменьшению неврологической симптоматики, связанной с отеком мозга, и, кроме того, обеспечивает окончательную гистологическую верификацию диагноза. Химиотерапия и лучевая терапия в качестве основного метода лечения применяются крайне редко, лишь при такой локализации опухоли, когда резекция ее невозможна. В монотерапии они не имеют существенной эффективности. В большинстве случаев их применяют после хирургического удаления глиомы с целью профилактики ее рецидивирования. Тем не менее, мультиформная глиобластома рецидивирует в 100% случаев, при этом, как правило, в пределах нескольких сантиметров от первичного очага. Рецидивы происходят из опухолевых клеток, оставшихся после ее резекции или из отдельных опухолевых клеток, инфильтрирующих окружающую, функционально интактную ткань мозга, в которую проникают с отечной жидкостью. Эффективная дополнительная терапия, следовательно, должна быть направлена именно на уничтожение этих инфильтративных опухолевых клеток. В связи с этим, в последнее время внимание большого числа исследователей направлено на поиск интенсивного локального метода лечения применяемого после хирургического удаление опухоли. Одним из перспективных направлений является фотодинамическая терапия.
ФДТ основана на селективном накоплении фотосенсибилизатора в ткани опухоли мозга. Последующее облучение лазером с определенной длиной волны приводит к повреждению и гибели фотосенсибилизированных клеток (Jiang F., 1998). К настоящему времени в клинических исследованиях ФДТ в качестве фотосенсибилизирующих препаратов использовали гетерогенную смесь порфиринов, производных гематопорфирина или его улучшенный коммерческий препарат Фотофрин (Gupta S., 2003).
Рядом исследователей было показано, что эти фотосенсибилизаторы селективно накапливаются только в глиоме и не проникают в инфильтрирующие опухолевые клетки, находящиеся в нормальной ткани мозга. Результаты применения ФДТ при лечении опухолей головного мозга на животных (Geldard Н., 2001) и людях (Stylli S.S., 2005) при использовании этих фотосенсибилизаторов многообещающие, но больший интерес представляет использование более очищенных новых фотосенсибилизаторов.
К оптимальному фотосенсибилизатору предъявляется ряд требований: доступный способ получения или синтеза, однородный химический состав; устойчивость при хранении и введении в организм; достаточная фотоустойчивость; низкая темновая токсичность, включая нейротоксичность; высокая селективность накопления в тканях новообразований и быстрое выведение ФС из организма; слабое накопление в коже (для минимизации кожной фототоксичности); высокий квантовый выход триплетного состояния с энергией не менее 94 кДж/моль для эффективного образования синглетного кислорода; высокий квантовый выход флуоресценции; интенсивный максимум спектра поглощения в области 700 — 900 нм (красный и ближний инфракрасный свет), т.е. в спектральном диапазоне, где невелико собственное поглощение биологической ткани (Tuettenberg J., 2005).
В настоящем исследовании изучалась эффективность ФДТ при лечении опухолей головного мозга крыс с использованием Фотосенса и Тиосенса 118 отечественных фотосенсибилизаторов, отвечающих основным вышеперечисленным требованиям.
За рубежом для изучения. ФДТ используют перевиваемые модели опухолей мозга крыс разного гистологического строения: глиосаркома 9L, астроцитома С6, анапластическая глиома F98, глиобластома RG2 (D74), анапластическая астроцитома RT-2 (Schreiber S., 2002).
Для исследования противоопухолевой активности ФДТ с использованием Фотосенса и Тиосенса были выбраны глиобластома 101/8 и глиома С6, которые обладают высокой степенью прививаемости (90-100%) и способностью к интрацеребральной трансплантации.
Одним из факторов, определяющих эффективность ФДТ, является достаточная концентрация (интенсивность флуоресценции) и высокая селективность накопления фотосенсибилизатора в опухолевых клетках. Отношение накопления фотосенсибилизатора в опухолевой и нормальной ткани (селективность накопления в опухоли) имеет огромное значение, т.к. при высоком ее значении высока вероятность поражения опухолевой ткани без повреждения нормальной ткани мозга. Gupta S. и соавт (2003) на крысах с 9Ь-глиосаркомой, леченных Фотофрином-2, показано, что это отношение составляет 8:1. В исследованиях Hebeda R.M. и соавт (1998) с производными бензопорфирина это отношение для глиом составило 7:1 с максимумом накопления ФС в опухоли между 3 и 5 часами.
Как и при использовании в качестве сенсибилизаторов ПГП и Фотофрина, нами выявлены высокий уровень и селективность накопления Фотосенса и Тиосенса в опухолевой ткани, что свидетельствует об их прохождении через ГЭБ.
На глиобластоме 101/8 при оценке интенсивности флуоресценции Фотосенса в опухолевой ткани показан дозозависимый уровень накопления, увеличивающийся по мере роста опухоли. Также показано, что селективность накопления Фотосенса увеличивается в течение суток и 1 достигает максимума через 24 часа после введения препарата, что, главным образом, связано с выведением- фотосенсибилизатора из нормальной ткани мозга, и продолжающемся его накоплении в опухолевых клетках.
При введении Фотосенса в дозе 10 мг/кг максимальный уровень накопления в глиобластоме 101/8 был выявлен через 24 часа после введения фотосенсибилизатора на 9 день опыта и составил 7,2 усл.ед. При снижении дозы Фотосенса этот показатель также снизился: 4,9 усл. ед. при дозе 5,6 мг/кг и 3,2 усл. ед. при дозе 3,5 мг/кг. Однако, при введении Фотосенса в таких высоких дозах, он в достаточно значительных количествах накапливался и в нормальной ткани мозга, что может привести к ее повреждению при проведении ФДТ. При оценке селективности накопления Фотосенса в глиобластоме 101/8 показано, что индекс селективности растет в течение суток. Максимальный индекс наблюдался при введении препарата в дозах 10 мг/кг и 5,6 мг/кг через 24 часа после введения Фотосенса и составил 12,8 и 12,5, соответственно. При введении Фотосенса в дозе 3,5 мг/кг через 24 часа индекс селективности составил - 7,8. С целью определения срока начала проведения ФДТ после перевивки глиобластомы 101/8, была изучена динамика уровня накопления Фотосенса в процессе роста опухоли с 6 по 10 сутки опыта, при этом, учитывая зависимость уровня накопления от дозы Фотосенса, препарат вводили в еще меньшей дозе - 2 мг/кг. Получено, что уровень накопления Фотосена в опухолевой ткани через 24 часа после его внутривенного введения уже на 6 день опыта составлял 1,7 усл.ед. и сохранялся на высоком уровне до 10 дня опыта. Индекс селективности по мере роста опухоли увеличивался с 6 до 9.
