Содержание к диссертации
Введение
3 Обзор литературы 1 О
3.1 Ингибиторы синтеза белка 10
3.1.1 Высокомолекулярные ингибиторы синтеза белка 1 0
3.1.1.1 Рицин 11
3.1.1.2 Вискумин 21
3.1.1.3 Внутриклеточный транспорт белковых токсинов 25
3.1.1.4 Транслокация токсинов 29
3.1.2 Низкомолекулярные ингибиторы синтеза белка 3 1
3.1.2.1 Циклогексимид 33
3.1.2.2 Различные пути гибели клетки 34
3.1.3 Действие РИБ2, отличное от ингибирования синтеза белка 46
4 Материалы и методы 48
4.1 Материалы 48
4.2 Клеточные линии 4 8
4.3 Очистка моноклональных антител 48
4.4 Проведение электрофореза 49
4.5 Системы ТИФА 50
4.5.1 Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами 50
4.5.2 Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина 50
4.5.3 Определение концентрации R60 и RTA в лизатах клеток, предобработанных R60 51
4.6 Биотипилирование белков 5 1
4.7 Получение конъюгатов белков с флуорохромами 52
4.8 Оценка цитотоксических свойств ИСБ 53
4.8.1 МТТ-тест 53
4.8.2 SRB-тест 53
4.9 Приготовление 4,5% параформальдегида 54
4.10 Анализ митогенной активнос ИСБ 54
4.11 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу 54
4.12 Исследование кинетики выхода вискумина из полилактидной матрицы 55
4.13 Анализ количества вискумина, высвободившегося при деградации полилактида 56
4.14 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 56
5 Результаты и обсуждение 58
5.1 Выявление свободной RTA в клетках, предобработанных рицином 58
5.1.1 Тест-система для выявления свободной RTA в клетке 60
5.1.2 Определение свободной каталитической субъедипицы рицина в клетках, предобработанных R60 63
5.1.3 Накопление свободной RTA в клетках, предобработанных рицином 66
5.1.4 Характеризация компартмента, содержащего свободную RTA 68
5.1.4.1 Совместное распределение RTA с рицином 69
5.1.4.2 Совместное распределение RTA с эндоплазматическим рстикулумом 74
5.1.4.3 Совместное распределение с аппаратом Гольджи 77
5.1.5 Объём компартмента, содержащего рицин 78
5.2 Влияния РИБ, непосредственно не связанные с ингибированием синтеза белка 82
5.2.1 Митогенное действие рибосом-инактивирующих белков 2 типа Подбор митостатика и его концентраций 84
5.2.1.1 Влияние времени инкубации с митостатиком на митотический и апоптотический индексы 87
5.2.1.2 Митогенная активность ингибиторов синтеза белка 88
5.3 Апоптотические изменения под действием токсинов 92
5.3.1 Выявление экспозиции фосфатидилсерина во внешнем слое плазматической мембраны с помощью Annexin V 92
5.3.2 Анализ фрагментации ДНК 96
5.3.2.1 Анализ деградации ДНК с помощью электрофоретического разделения в агарозном геле 96
5.3.2.2 Количественный анализ фрагментации ДНК методом проточной цитофлуориметрии 98
5.3.3 Анализ фрагментации ядер 100
5.4 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу 102
6 Выводы 1 1 1
7 Благодарности 112
8 Список литературы
- Внутриклеточный транспорт белковых токсинов
- Очистка моноклональных антител
- Анализ митогенной активнос ИСБ
- Митогенное действие рибосом-инактивирующих белков 2 типа Подбор митостатика и его концентраций
Введение к работе
Многие процессы в клетке определяются взаимодействиями различных молекул как внуїри неё, так и на поверхности. На клеточной мембране имеется большое количество различных рецепторов. Лектины специфически взаимодействуют с гликопротеинами мембраны и могут активировать рецепторы клеточной поверхности. Результатом такой активации, в частности, может быть запуск как пролиферации, так и гибель клетки.
Известно, что рибосом-инактивирующие белки 2 типа (РИБ2) состоят из двух субъединиц, одна из которых обладает лектиновоГі активностью и играет ключевую роль в связывании токсина с клеткой. Наиболее полно изучены представители РИБ2 -рицин (R60) и вискумин (MLI). Оба эти токсина имеют сходную структуру, но различаются по ряду характеристик, в частности, по строению галактозосвязывающих центров. Имеющиеся различия приводят к неодинаковому внутриклеточному пути транспорта этих белков [Moisenovich М. et al., 2002]. Обязательным общим этапом интернализации обоих токсинов является попадание в ранний эндосомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Из ранних эндосом большая часть токсина возвращается к клеточной поверхности, откуда снова попадает в клетку. Таким образом, происходит постоянное движение токсина у клеточной мембраны [Moisenovich М. et al., 2004].
Минорная часть интернализовавшихся молекул РИБ2 через аппарат Гольджи (АГ) транспортируется в эидоплазматический ретикулум (ЭР) и далее попадает в цитозоль, где инактивирует рибосомы [Wesche J. el al., 1999]. В пользу такой теории свидетельствуют следующие данные:
введение в RTA сигнальной последовательности KDEL, адресующей белки в ЭР, усиливает цитотоксичность химерной молекулы fZhan J. et al., 1998];
блокировка везикулярного транспорта с использованием брефелдина А приводит к приобретению клетками устойчивости к рицину [Bilge A. et al., 1995].
мутантные клетки, в которых заблокирован ретроградный транспорт, также не чувствительны к рицину [Cosson P. and Letoiirneur P., 1994; Simpson J.С. et al., 1995a].
При этом клетки, мутантные по ГТФазам, и клетки, обработанные блокатором везикулярного транспорта, остаются чувствительными к дифтерийному токсину, способному создавать поры в мембранах и транспортироваться в щпозоль, минуя ЭР [Simpson J.C. ct al., 1996].
Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA. экранированных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсинов для транслокации в цитозоль [Tonevitsky A.G. et al., 1995; Малюченко Н.В. и др., 2003; Бенедиктова О.Л. и др., 2005]. Считается, что высвободившаяся R.TA транспортирутся из ЭР, используя существующий путь экспорта дефектных эндогенных белков [Rapak A. et al., 1997].
Все вышеизложенное не исключает возможности транслокации свободной RTA на более ранних этапах внутриклеточного транспорта в количествах, достаточных для остановки синтеза белка. Выход А-цепи из ранних эндосом может быть обусловлен несколькими причинами. Так, высокий уровень содержания ненасыщенных лип идо в и малое количество сфинголипидов и холестерола приводит к тому, что мембраны эндосомального компартмента оказываются чрезвычайно гибкими и подвижными [Kobayashi Т. et al., 1998; Hussain М.М., 2000]. Повышенная лабильность мембран и их постоянный рециклинг у клеточной поверхности повышает вероятность трансмембранного переноса токсина. Увеличение эффекта возможно также за счет повышенного содержания в данных мембранах трнглицеридов, к которым обнаружена липолитическая активность рицина [Lombard S. ct al., 2001]. Концентрация рицина в ранних эпдосомах, по нашим оценкам, составляет до 10" М. Это может привести к значительному нарушению целостности мембран, что, в свою очередь, возможно, инициирует транслокацию А-цепи в цитоплазму.
Таким образом, выявление компартментов, в которых присутствует свободная RTA, может внести существенные изменения в современные представления о транспоріе токсинов и может быть использовано при синтезе иммунотоксинов на основе РИБ2.
Изучение путей транспорта РИБ2 в клетке привело к открытию ряда их особенностей, которые непосредственно не связаны с ингибированием синтеза белка. Такие свойства как митогенная или липолитическая активность присущи высокомолекулярному токсину и не наблюдаются при воздействии низкомолекулярных ингибиторов синтеза белка [Morlon-Guyot J. et al., 2003]. Данные
свойства могут объяснить природу более высокой токсичности РИБ2 по сравнению с низкомолекулярпыми ингибиторами.
Целью работы было исследование роли эндосомального компартмепта в транспорте РИБ2 па примере рицина и вискумина, а также возможности восстановления межсубъединичной дисульфидной связи в данном компартменте.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработать тест-систему для выявления свободной R.TA внутри клетки. Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления RTA в клетке. Определить ассоциацию А-цепи с клеточными органеллами.
Определить концентрацию токсина в эндосомальном компартменте и выявить в нем наличие молекул свободной RTA.
Изучить действия РИБ, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка. Подобрать методы обнаружения митотической активности клеток и повреждений эндосомных мембран под действием РИБ.
Сопоставить динамику накопления токсинов в клетке с этапами её интоксикации.
Научная новизна работы. На основе полученных моноклональиых антител создана уникальная тест-система для определения свободной RTA внутри клетки. Установлено, что период, через который в клетке выявляется свободная RTA, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет =4 часа. Показан широкий спектр действия РИБ2 на клетку-мишень: снижение её устойчивости к физическим воздействиям, таким как центрифугирование и изменение рН среды; разрушение актиповых филаментов; запуск апоптоза.
Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов; существенно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их применении; значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счёт нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилактидиую матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов пролонгированного цитотоксического действия.
3 Обзор литературы
Внутриклеточный транспорт белковых токсинов
Углеводсвязывающая В-еубъединица вискумина состоит из 264 аминокислотных остатков. Шесть из семи цистеинов образуют три дисульфидшле связи внутри В-субъединицы, а один связан с цистсином А-субъсдиницы: Cys64-Cys81, Cysl52-Cysl65 и Cysl92-Cys209. В аминокислотной последовательности В-субъединицы вискумина идентифицировано три потенциальных сайта гликозилирования в положениях 61, 96 и 136, в которых находятся остатки аспарагнна. Однако, исследования степени гликозилирования В-субъединицы МЫ говорят о наличии только двух гликановых частей в молекуле [Eschenburg S. et al., 1998].
Уточненная структура кристалла МЫ в комплексе с галактозой была описана с разрешением 3,0 A [Niwa Н. et al., 2003]. В-субъединица МЫ состоит из двух гомологичных глобулярных доменов. Каждый домен диаметром около 30 А составлен тремя субдоменами (а, р\ у) и содержит углсводсвязывающий сайт. Линксрпьтс участки, обозначаемые АЛ и Х2. соединяют А- и В-субъединицы токсина и два лектиновых домена соответственно [Krauspenhaar R. et al., 1999]. Хотя предполагается, что субдомены а, (З и у произошли от общего галактозевязывающего пептида, только субдомены al и у2 сохранили способность связывать углеводный остаток [Villafranca J.E. and Robertus J.D., 1981]. Данные функциональные субдомены различаются между собой по аффинности к связываемому углеводу (субдомен al является низкоаффинным) из-за различия в аминокислотных последовательностях [Krauspenhaar R. et al., 1999].
В-субьединица вискумина специфически связывается с гликолипидами и/или гликопротеидами. содержащими терминальную галактозу [Ziska P. and Franz Н.. 1981]. С помощью МОНО-, ди- и олигосахаридов показано, что вискумин обладает высокой аффинностью к терминальной галактозе, связанной по альфа- или бета- положению, и слабо взаимодействует с N-ацетилгалактозамином [Franz Н., 1986; Wu A.M. el al.. 1992].
Аминокислотная последовательность А-субъединицы вискумина (ML А) включает 254 остатка fHnguet S.M. et ai.. 1996]. Единственный остаток цистеина Cys247 участвует в образовании дисульфидной связи с Cys5 В-субъединицы. Внутренние ДисульсуфиДНЫе связи в MLA отсутствуют. В аминокислотной последовательности А-субт единицы вискумина идентифицирован один потенциальный сайт гликозилирования в позиции Asn112 в составе триплета аминокислот Asn-X-Ser/Thr. Исследования степени гликозилирования А-субъединицы МЫ подтвердили, что белок содержит один гликановый остаток.
В составе А-субъединицы впскумина можно выделить три домена. Домен I включает 110 N-копцевых аминокислот и состоит из одного спирального участка и шести р-тяжей, домен II (111-203 аминокислотные остатки) составлен четырьмя спиральными участками, домен III (204-254 аминокислотные остатки) содержит один спиральный участок и два антипаралелльных [3-тяжа и взаимодействует как с двумя другими доменами, так и с В-субъединицей [Krauspenhaar R. cl al., 1999].
Данные РСА свидетельствуют, что в построении каталитического аденинсвязывающсго центра впскумина участвуют все три домена. При сравнении аминокислотных последовательностей А-субъсдиниц различных РМБ2 - впскумина. рицина и абрина - были обнаружены абсолютно консервативные аминокислотные остатки, составляющие активный центр молекул. В А-субъединице впскумина это остатки Туг76, Тугі 15, Glul65, ArgI68 и Trpl99 [Huguet S.M. et al., 1996]. Аминокислоты Asn74, Argl26, Gin 162 и Glul97, формирующие окружение активного центра, участвуют в поддержании его структуры [Katzin B.J. et al., 1991].
Единичная дисульфидная связь соединяет Cys247 А-субъединицы и Cys5 В-субъединицы нативного гетеродимера впскумина. Помимо неё для стабилизации ассоциированных субъединиц существует большое количество нековалентных взаимодействий. В таблице показаны полярные, гидрофобные и ароматические взаимодействия между аминокислотными остатками субъединиц.
Во взаимодействии субъединиц впскумина со стороны А-субъединицы в основном участвуют а.о. С-концевого участка, а со стороны В-субъединицы -аминокислоты линкерных участков W и XI, а также С-концевые а.о.
Для достижения своей цитоплазматической мишени токсины проходят несколько ступеней внутриклеточного транспорта [Lord J.M. et al., 2003]. Интернализация токсинов внутрь клетки осуществляется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. В этом процессе принимают участие как клеточные рецепторы, содержащие галактозу, так и рецепторы, связывающие концевую маннозу олигосахаридов [Simmons В.М. et al., 1986; Magnusson S. ct al., 1991; Rutenber E. and Robertus J.D., 1991].
Для некоторых токсинов место и механизм транслокации известны, для других всё ещё остаётся под вопросом. Для многих РИБ2, в частное і и, рицина и вискумина, место транслокации пока не установлено. Возможно, они используют системы ретроіранслокации для выхода из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму [Hazes В. and Read R.J., 1997; Sandvig К. and Van Deurs В., 2000].
Большинство белков, связывающихся с рецепторами на поверхности клетки, эндоцитируются с помощью клатрин-зависимого механизма [Mellman 1., 1996], но есть и рецепторы, интернализующиеся клатрин-независимыми способами: макропиноцитоз, фагоцитоз и захват внеклеточного материала, опосредованный липидпыми рафтами и кавеолами [Johannes L. and Lamaze С, 2002].
Взаимодействие токсина с клетками начинается со связывания с рецепторами на поверхности клетки. Основным способом связывания РИБ2 являє і ся взаимодействие В-субъединпцы с галактозосодержащими рецепторами благодаря её лектиновой активности [Lord J.M. et al., 2005]. На клетках млекопитающих имеется огромное количество рецепторов, с которыми могут связываться токсины. Так, было подсчитано, что для рицина число соответствующих рецепторов колеблется от 2 до 80 млн. на клетку, а для вискумина почти в 2 раза меньше [Barbieri L. et al., 1993]. Среди этого количества обязательно найдутся рецепторы, которые в норме попадают внутрь клетки, используя различные механизмы как клатрин-зависимого, так и клатрин-независимого эндоцитоза [Montesano L. et al., 1982; Sandvig К. and Olsnes S., 1982a; Sandvig K. and Olsnes S., 1982b].
Это предположение подтверждается большим количеством фактов: интернализация рицина продолжается при нарушении формирования клатрин-окаймленных везикул и блокировании клатрин-зависимого эндоцитоза [Simpson J.С. et al., 1995а; Sandvig К. and Van Deurs В., 1996].
Очистка моноклональных антител
Очищенные моноклональные антитела в ФСБ иммобилизовали в лунках 96 луночпой платы (по 1мкг в лунку) в течение 2-х часов при 37С. Для иммобилизации антител из сывороток или супернатангов использовали платы, предсенсибилизированные кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши. В лупки, содержащие иммобилизованные антитела, добавляли на 60 мину г биотииилированные антигены в ФСБ/ 0,05%(V/V) Твин-20/ 25мМ a-D-лактозы. После удаления биотинилированных антигенов в лунки вносили конъюгат стрептавидин-пероксидаза в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20 и инкубировали 60 мин. Все инкубации проводили при 37С. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали 0,5 мг/мг ТМБ в в 0,05 М цитрат-0,1 М фосфатном буфере (pll 5,0-5.5), содержащем 0,5% ЬЬСЬ. После 15-минутной инкубации при 37С реакцию останавливали 10%-ной серной кислотой. Калориметрические измерения выполняли при 492 им на спектрофотометре Multiskan PLUS - 314.
Сендвич-тифа на основе антител IRAK 1-6 использовали для выявления RTA и определения эпитопов, с которыми взаимодействуют эти моноклональные антитела. На 96 луночную плашку сорбировали моноклональные антитела в концентрации 10мкл/мл в ФСБ по 100 мкл на лунку. Инкубировали 16 часов при і4С. Три раза отмывали расівором для отмывки, содержащим 20 тМ/л лакгозы и 0,05% T\veen-20 в ФСБ. Оставшиеся свободными сайты связывания полистироловой поверхности блокировали часовой инкубацией с буфером для нанесения образцов. В качестве такого буфера использовали смесь, состоящую из 0,1% БСА, 20 тМ/л лактозы и 0,05% Tween-20 в ФСБ. Затем вносили по 100 мкл RTA, 1 час инкубировали при 37С и трижды отмывали. В лунки вносили по 100 мкл моноклональных антител, меченных биотином, в концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при 37С в течение 1 часа. Биотииилированные антитела вносили так, чтобы они отличались от первых антител, сенсибилизированных на плашке (всего 36 пар). После трех отмывок инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза и проявляли с помощью субстратного буфера ТМБ. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 20% серной кислоты. Калориметрические измерения проводили при 450 им на спектрофотометре Multiskan PLUS-314.
Клетки линий Сб и ЗТЗ выращивали на чашках Петри 3 суток, после чего добавляли 1 мкг/мл R60 и инкубировали при 37С и 6% СОг различные временные интервалы. Затем клетки отмывали от несвязавшегося токсина холодным раствором лактозы и механически снимали с пластика. Полученную взвесь центрифугировали (7 мин 1500 об/мин). Супернатанты отбирали в новые пробирки, а осадок ресуспендировали в 350 мкл лизирующего раствора (0,lMNaCl, ЮмМ Na2HP04, 1% Triton Х-100 и IMMPMSF, рН 7,4), инкубировали при 4С 20 мин и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин [Iversen T.G. ct al., 2001].
Тест-систему 1 RK2/2RK1 bi использовали для определения концентрации R60, а 1 RAK4/lRAK6bi - для определения концентрации RTA. В качестве контролен использовали лизаты клеток соответствующих линий, не обработанных токсинами.
При построении калибровочных кривых использовали данные для R60 и RTA, разведенных на среде культивирования соответствующих линий клеток. Статистическую обработку результатов проводили в программе «Microsoft Excel 1997».
Белки (монАт, РИБ2 и их субъединицы) конъюгировали с биотиыамид-N-гидросукцинимидным эфиром в соответствии с рекомендациями производителя («Sigma», США). Биотинамид-ТЧ-гидросукцинимидный эфир растворяли в ДМСО (10 мг/мл) и добавляли к монАт, растворенным в ФСБ. Инкубировали в течение 1 часа при +37С и в течение 15 часов при +4С. Концентрация белков составляла не менее 0,3 мг/мл, молярное соотношение белок/биотин - 1/20. Реакцию останавливали 0,01%NaN3. От несвязавшегося с белком биотинамид-М-гидросукцинимидного эфира избавлялись с помощью гель-фильтрации на sephadex G25. Белок элюировали с колонки ФСБ. Качество биотинилирования оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА).
Конъюгация с FITC: сухой FITC разводили в ДМСО до концентрации 100 мг/мл. Белки переводили в карбонатный буфер (рН 9,0), содержащий 1 М NaHC03, 20 тМ лактозу, и концентрировали до содержания 2 мг/мл. За і ем смешивали растворы белка в карбонатном буфере и FITC в ДМСО так, чтобы избыток FITC составлял для рицина 25-кратный молярный избыток, для вискумина - 20-кратный молярный избыток. Инкубировали с перемешиванием 24 ч при комнатной темпераіуре. С помощью гель-фильтрации на колонке PD10 с сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшсгося с белком FITC. Переводили белок в ФСБ (рН 7,4). Количество групп FITC, внесенных в одну молекулу белка, было оценено по следующей формуле:
Моль FITC/Моль белка = 2,87 ОП495/[ОП28о - ОП495 0,35] [Формула 1 ] Соотношение количества красителя к количеству белка составило: для рицина: 4,2; для вискумина: 3,3.
Для конъюгации с активированным эфиром СуЗ использовали активированный эфир СуЗ (Biodyc.ru, Россия). 1 мл раствора в ФСБ (рН 7,4) белка, в концентрации 1 мг/мл доводили до рН 9,0 добавлением 100 мкл 1 М NaHCCb. В полученную смесь добавляли сухой СуЗ в молярном соотношении белка к красителю 1 к 20 и инкубировали с перемешиванием 1 ч при 37С. После этого смесь инкубировали при +4С в течение 24 часов. С помощью гель-фильтрации на колонке PD10 с сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшегося с белком красителя.
Анализ митогенной активнос ИСБ
Транслокация в цитозоль - наиболее важный этап внутриклеточного транспорта токсина. Вопрос о том, инактивирует рибосому цельный токсин или для проявления аптирибосомалыюй активности требуется восстановление дисульфидной межсубъединичной связи, интересовал исследователей с момента открытия механизма инактивации рибосомы. После того, как было обнаружено, что активность высвободившейся путём восстановления дисульфидных связей свободной А-субъединицы выше активности цельного токсина [Barbien L. et al., 1993], был поднят вопрос о том, необходима ли диссоциация субъединиц токсина, и если да, то в каком компартменте она происходит.
Изучение гибридом, продуцирующих антитела, выявило их устойчивость к токсинам, против которых образовывались монАт. Иммуноглобулины, как и другие секреторные белки, синтезируются в виде предшественника, содержащего гидрофобную сигнальную последовательность, обеспечивающую их перенос в просвет ЭР. Там происходит проверка на правильность сворачивания белка, после чего они транспортируются через различные везикулярные компартменты и выделяются во внеклеточную среду. В этих же компарментах, например, аппарате Гольджи, удаляются сигнальные последовательности и происходит дополнительная проверка новосинтезированных белков. Некорректно свернутые белки деградируют в лизосомах, а остальные транспортируются к клеточной мембране [Lord J.M. et al., 2000]. Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против токсинов, указывает на инактивацию токсической активности путём связывания токсина с продуцируемыми антителами. Однако этот процесс может происходить как внутри, так и вне клетки. Для исключения взаимодействий вне клетки применяли нейтрализацию антител, находящихся в среде культирирования. Для этого использовали поликлональные антитела кролика, а также удаляли клеточные рецепторы папаином [Youle R.J. and Colombatti М., 1987; Komfeld S.B. el al., 1991; Agapov I.I. et al., 1999b]. Однако, данные операции могли оказать влияние на связывание токсина с клеткой и его внутриклеточный транспорт. Кроме того, такие манипуляции не гарантируют полной нейтрализации внеклеточных антител, поэтому полностью исключить возможность взаимодействия продуцируемых антител с токсинами вне клетки невозможно.
Гибридомы серии RAK, продуцирующие антитела к свободной А-субъединице рицина, и не реагирующие с цельным токсином, являются хорошей модельной системой для изучения механизмов их устойчивости к рицину. Диссоциация цельного токсина происходит только внутри клетки, поэтому ист необходимости анализировать взаимодействия токсин-антитело вне клетки. Устойчивость к рицину гибридом серии RAK. свидельствует о высвобождении RTA до транслокации в цитозоль и подтверждает предположения других авторов о том, что в цитоплазму траислоцируется только каталитическая субъединица [Sandvig К. and Van Deiirs В., 2000; Sandvig К. and Van Deurs В., 2005]. Это следует из іого факта, что синтезированные антитела не попадают в цитозоль пи на одном из этапов транспорта из ЭР вплоть до выделения во внеклеточную среду. Устойчивость гибридом также свидетельствует о том, что восстановление дисульфидиой связи, приводящее к образованию субъедипиц токсина, происходит в компартменте, через который проходят секретируемые иммуноглобулины. Вероятно так же, что связывание А-субъединицы с антителами блокирует возможность её транслокации в цитозоль.
Активность каталитической субъединицы РИБ2 очень высока, поэтому для гибели клетки может быть достаточно 1 молекулы токсина, попавшего в цитозоль [Barbicri L. et al., 1993]. Столь малое содержание токсина, необходимое для остановки синтеза белка, приводит к ещё одному результату: в момент остановки белкового синтеза большая часть внутриклеточного токсина всё ещё находится в ранних эндосомах [Moisenovich М. et al., 2002]. Па фоне этого количества токсина, непосредственно не участвующего в дегликозилировании рибосом, выявить фракцию, вовлечённую в остановку синтеза белка чрезвычайно тяжело. До настоящего времени выявить свободную А-субъединицу токсинов в клетках, предобрабоганных МЫ или R60, не удавалось.
В то же время, исследование этой минорной фракции важно для выявления как клеточных компартмеитов, в которых восстанавливается дисульфидная связь, так и молекулярных механизмов, задействованных в её восстановлении. Определение мес і а, где происходит высвобождение свободной А-субъединицы, позволит показать компартменты из которых происходит её трапелокация в цитозоль, и определить внутриклеточные пути транспорта токсинов, приводящие к гибели клеток. Знание точных механизмов и путей транспорта РИБ2 может быть использовано при создании оптимального иммунотоксина, который можно будет использовать в терапии опухолевых заболеваний.
Для выявления свободной RTA использовали тест-системы на основе моноклональных антител серии RAK. Эти антитела способны выявлять малые количества А-субъединицы в присутствии цельного рицина. Кристаллографический анализ молекулы рицина выявил на поверхности RTA области площадью около 1600 A2 [Katzin B.J. et al., 1991; Riitenber E. et al., 1991], экранированной B-субъединицей в составе цельного токсина. Вероятнее всего, эпитопы. распознаваемые антителами группы RAK, находятся в данной области. Это объясняет наличие эпитопов на свободной RTA и их экранирование в молекуле рицина (RTA-RTB). Кроме того, при восстановлении дисульфидпой связи в области контакта двух субъединиц рицина наблюдается частичное разворачивание полипептидной цепи [Simpson J.С. et al., 1995b], что может приводить к формированию дополнительных уникальных эпитопов на восстановленных субъединицах.
В настоящей работе мы использовали 6 моноклональных антител серии RAK (IRAK 1-6), полученных нами ранее, выявляющих RTA в присутствии R60. Анализ совместного связывания пар антител со свободной А-субъединицей позволил определить наличие минимум двух неперекрывающихся эпитопов свободной RTA. С каждым эпитопом возможно связывание одного из трёх мопЛт (см. Таблица 3).
Митогенное действие рибосом-инактивирующих белков 2 типа Подбор митостатика и его концентраций
Рибосом-инанактивирующие белки не только необратимо модифицируют рибосомы, но также приводят к другим различным эффектом. Велика вероятность того, что эти эффекты возникают под действием связывающей субъединицы РИБ2. Неспецифическое связывание с какими-либо клеточными рецепторами вполне может приводить к неожиданным эффектам. При исследовании аноптотнческого действия РИБ2 на клетки линии ЗТЗ было замечено незначительное увеличение делящихся клеток. Для уточнения корректности этого наблюдения нами был проведён ряд опытов.
Митотический индекс (% клеток, вступивших в митоз) различается для разных линий клеток. Известно, что для линии ЗТЗ митотический индекс составляет примерно 0,5-1,5%. Изменения при столь низких значениях достаточно тяжело учесть, кроме того, процент ошибки в таком случае будет очень высоким. Для оценки изменения митотического индекса было решено использовать митостатик. Митостатиками (или цитостатиками) называют вещества, прямо или косвенно блокирующие прохождение клетки по митотическому циклу. Чаще всего они воздействуют на клетку в S-фазе клеточного цикла.
В настоящее время известно большое количество митостатических агентов. Установлено, что их использование может приводить не только к остановке митоза, но и запуску апоптоза по неизвестным пока механизмам [Catsicas М. el al., 1992; Ginn S.R. and Peterson G.M., 1992; Nakagawa-Yagi Y., 1994; Lindenboim L. et al., 1995; Vaux D.L. etal., 1996; Suzuki Y. et al., 1998].
Анализ митотического индекса может быть затруднён при большом количестве апоптотических ядер, поэтому первой задачей было подобрать митостатик и его концентрации, которые останавливали бы клеточный цикл и при этом не приводили бы к апоптозу. Подбор митостатика и его концентраций Для анализа клетки линии ЗТЗ выращивались на покровных стёклах как описано в «Материалах и методах». В чашку Петри добавляли различные концентрации митостатиков. В качестве исследуемых митостатиков были выбраны колхицин (Colchicine) и демеколцин (Demecolcine). Первый давно известен и широко используется как блокировщик клеток в метафазе посредством нарушения функций микротрубочек [Borisy G.G. and Taylor E.W.. 1967]. Второй является производным КОЛХИЦИНУ и считается менее апоптозогенным.
По оси ординат отложен митотический индекс линии ЗТЗ после 6 часовой инкубации с митостатиками. На оси абсцисс первые 5 групп данных; действие дсмеколцина в концентрациях 0.5 - 8 мкМ (D 0.5 - D 8): группы 6-9 - действие колхицина в концентрациях I - 8 мкМ (С ! - С 8): последняя группа - контроль, инкубировавшийся без добавления чего-либо. Серым цветом обозначено количество митотических ядер, полосатые столбики - апоптотических ядер. Подсчет вели с помощью флуоресцентного микроскопа. Фиксированные клетки метили красителем Picogreen
По литературным данным известно, что колхицин и демсколцин используют для остановки митоза в различных концентрациях от 0.5 мкМ до К) мкМ в зависимости от типа клеток, подвергающихся воздействию. Время инкубации, необходимое для полной остановки митотической активности, также различается и обычно составляет от 6 до 9 часов. Для подбора оптимальной концентрации митостатикИ мы инкубировали клетки линии ЗТЗ в присутствии демеколиина (0.5 - 8 мкМ) и колхицина (1-8 мкМ) в течение 6 часов. В качестве контроля использовались клетки, не подвергавшиеся воздействию мнтостатиков (см. Рисунок 25).
Клетки инкубировали с колхицином, после чего их фиксировали и окрашивали. Хроматин мечен Picogreen. цитоплазма - синькой Эванса. Видно четкое различие между митотическими и немитотическими ядрами. ЛинеПка -20 мкм. После инкубации клетки фиксировали 4% ПФА, и метили ДИК флуоресцентным красителем Picogrcen. С каждого стекла считали около 30 произвольных захватов, так чтобы общая сумма всех учтённых ядер была не менее 2000. Митотическими признавались ядра, в которых чётко прослеживались отдельные хромосомы (см. Рисунок 26).
Оптимальной концентрацией демеколцина можно принять 1 мкМ, т.к. в данном случае наблюдается увеличение видимых митозов до 1 1,5%, что почти в 7,5 раз больше чем в контроле (1,5%). При этом как уменьшение (0,5 мкМ), так и сильное увеличение (8 мкМ) концентрации демеколцина приводит к уменьшению количества видимых митозов.
Изменение концентрации колхицина в среде от 1 до 8 мкМ практически не сказывается на количестве видимых митозов. Однако при увеличении концентрации растет количество детектируемых апоптотических ядер: от 1 до 3,5%. Исходя из этих данных, в качестве оптимального митостатического агента был выбран колхицин к минимальной концентрации 1 мкМ. Хотя такая же концентрация демеколцина позволяет детектировать немного больше митозов (11% против 10%), она приводит к образованию в четыре раза большего количества апоптотических ядер (см. Рисунок 25). Выбранная концентрация отмечена на рисунке более толстой рамкой у столбиков.
После определения оптимальной концентрации колхицина было изучено влияние времени инкубации с митостатиком на митотический и апоптотический индексы. Установлено, что увеличение времени инкубации с б до 9 часов практически не влияет на количество детектируемых митозов. При этом апоптотический индекс увеличивается более чем в два раза (см. Рисунок 27). Суммируя полученные данные, в дальнейшем для анализа митотического индекса мы инкубировали клетки с колхицином в концентрации 1 мкМ в течение 6 часов.
