Введение к работе
Актуальность темы. Высокая цитотоксическая активность белковых токсинов растительного происхождения привлекает к ним особое внимание. Каталитические части токсинов широко применяют для создания химерных соединений - иммунотоксинов (ИТ), способных элиминировать определенные клеточные популяции. Подобные препараты направленного действия используют при терапии опухолевых и аутоиммунных заболеваний, при трансплантации органов. Однако низкая эффективность действия ИТ ограничивает их применение в клинической практике. Одна из причин низкой активности - несовершенство внутриклеточного транспорта искусственных конъюгатов по сравнению с нативными токсинами. Поэтому изучение вігутриклеточного транспорта (ВТ) токсинов и их производных является актуальной задачей не только теоретической, но и практической молекулярной биологии.
Сами токсины представляют собой удобный объект для изучения внутриклеточного транспорта белков. Белки из семейства РИБІІ задействованы в самых разных процессах транспорта: связывание с клеточными рецепторами, рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождение через эндосомальные компартменты, транспорте белков внутри аппарата Гольджи, ретроградном переносе из аппарата Голъджи в эндоплазматический ретикулум и, наконец, в процессе трансмембранного переноса. В ходе своего внутриклеточного транспорта токсины связываются со многими клеточньши структурами, обеспечивающими механизм внутриклеточного движения белков и поэтому могут служить зондами для доставки белков и пептидов в определенный клеточный компартмент [Stenmark et al., 1991]. Например, возможна доставка малых пептидов к молекулам МНС I класса для антигенной презентации на поверхности.
Изучаемый в работе вискумин из омелы белой, является одним из наименее изученных среди известных токсинов семейства РИБИ. Однако, дальнейшее изучение данного белка представляется перспективным благодаря ряду свойств вискумина. Было показано, что ИТ на основе каталитической субъединицы вискумина более активны, чем ИТ на основе А-субъединицы рицина [Tonevitsky et al., 1996]. Кроме того, экстракты омелы белой обладают иммуномодуляторной, апоптотической и антимутагенной активностью, благодаря чему широко используются в течение ряда лет в
?
качестве противоопухолевых препаратов в странах Европы [Bussing et al., 1997а].
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование отдельных этапов внутриклеточного транспорта вискумина с помощью модельных систем - гибридом. Кроме того, целью работы изучение влияния векторной и цитотоксическои части на эффективность иммунотоксинов, направленных к меланомо-ассоциированному антигену - HMW-MAA. Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:
1. Получение гибридом, Гфодуцирующих монАт против нативной и
денатурированной формы А-субъединицы вискумина. Изучение
специфичности, аффинности полученных монАт.
2. Изучение устойчивости данных гибридом к цитотоксическому действию
вискумина и рицина.
3. Получение иммунотоксинов, на основе антител 225.28 и 763.74 и
каталитических субъединиц рицина и вискумина. Изучение свойств
полученных ИТ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получена панель монАт, распознающих различные детерминанты каталитической субъединицы вискумина. Получение высокоаффинных моноклональных антител MNA способствовало созданию чувствительной и селективной тест-системы по определению содержания токсических пектинов из омелы белой.
Получены свидетельства, что вискумин претерпевает различные модификации в ходе внутриклеточного транспорта токсина, а именно, происходит диссоциация субъединиц и разворачивание каталитической субъединицы вискумина до момента транслокации белка в цитозоль.
В целях получения высокоэффективных препаратов направленного действия к меланоме бьши созданы и охарактеризованы ИТ на основе разных монАт к меланомо-ассоциированному антигену HMW-MAA и разных каталитических субъединиц токсинов. Впервые проводили сравнение связывающей и цитотоксическои активности данных конъюгатов на шести меланомных линиях.
Полученные свидетельства о модификациях каталитической субъединицы MLA могут быть использованы для дальнейшего изучения транспорта РИБІІ и их производных.
Наиболее эффективные in vitro конъюгаты к меланоме могут быть использованы для создания рекомбинантных аналогов иммунотоксинов. Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международной конференции COST98 (Германия, 1996), на П съезде биохимического общества РАН (Россия, 1997), на международной конференции для молодых ученых «Экзоцитоз» (Франция, 1998), на III конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99» (Россия, 1999). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова. По материалам диссертации было опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 151 страницах, иллюстрирована 28 рисунками и 8 таблицами. Список литературы содержит 210 источников.
