Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 9
1.1 Современные представления о плазматических мембранах. Многообразие внутриклеточных путей.
1.2 Внутриклеточный транспорт рицина. 19
1.3 Эпидермальный фактор роста и трансферрин 23
1.4 Рецепторы эпидермального фактора роста и трансферрина. 26
1.5 Внутриклеточный транспорт TFR и EGFR. 32
1.6 Современные подходы к синтезу и использованию препаратов направленного действия . 39
Заключение. 42
Глава 2. Материалы и методы. 45
2.1 Материалы. 45
2.2 Методы. 45
2.2.1. Клеточные линии. 45
2.2.2 Получение гибридом. 46
2.2.3 Системы ТИФА. 47
2.2.3.1 Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами .
2.2.3.2. Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина. 47
2.2.4 Биотинилирование белков. 48
2.2.5 Очистка моноклональных антител (мАт). 49
2.2.6 Иммобилизация мАт 2RBK1 на BrCN-активированную сефарозу 4В. 50
2.2.7 Дополнительная очистка RTA. 51
2.2.8 Клеточные лизаты и супернатанты. 51
2.2.9 Трансфекция клеток линий А431. 51
2.2.10 Электрофорез в ПААГ. 52
2.2.11 Конъюгаты EGF-RTA и TF-RTA. 52
2.2.12 Получение конъюгатов трансферрина (Тф), epidermal growth factor (EGF), рицина и его субъединиц с различными флуорохромами . 53
2.2.13 Реассоциация субъединиц токсинов. 54
2.2.14 Цитотоксический тест. 55
2.2.15 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. 56
Глава 3. Результаты и обсуждение. 58
3.1. Гибридомы, продуцирующие моноклопальные антитела, дискриминирующие RTA от нативного токсина. 60
3.2 Дополнительная очистка субъединиц рицина. 63
3.3 Сравнительный анализ внутриклеточного распределения рицина и различных векторных молекул . 65
3.3. Цитотоксическая активность конъюгатов EGF-RTA и TF-RTA. 78
3.4 Сравнительный анализ взаимодействий рицина, вискумина и химерных молекул RTB-MLA и MLB-RTA с клетками. 80
3.4.1. Различия во взаимодействии рицина и вискумина с клеточной мембраной. 80
3.4.2. Цитотоксическая активность химерных молекул MLB- RTA и RTB-MLA. 89
Выводы. 92
Список литературы. 93
Благодарности 108
- Современные подходы к синтезу и использованию препаратов направленного действия
- Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами
- Получение конъюгатов трансферрина (Тф), epidermal growth factor (EGF), рицина и его субъединиц с различными флуорохромами
- Сравнительный анализ внутриклеточного распределения рицина и различных векторных молекул
Введение к работе
Конъюгаты, содержащие каталитическую субъединицу рибосоминактивирующего белка (РИБ) рицина и векторную молекулу, представляют собой препараты направленного действия, способные к избирательной элиминации клеточных популяций. Это одна из возможных реализаций концепции «магической пули», предложенной Паулем Эрлихом еще на рубеже 18 и 19 столетий. В настоящее время достигнуты определенные успехи в применении конъюгатов на основе РИБ при терапии лейкозов, а также в качестве специфических иммунодепрессантов в трансплантологии. Однако современный уровень реализации концепции не позволяет широко применять препараты этой группы в клинической практике. Несмотря на кажущуюся легкость создания и применения таких терапевтических агентов, пока не создано препарата, который являлся бы абсолютно эффективным при лечении онкологических заболеваний. Причина неудач кроется в недостаточном понимании механизмов взаимодействия конъюгатов, содержащих фрагменты РИБ, с клетками-мишенями. Интоксикация клеток такими молекулами - сложный многоступенчатый процесс, в ходе которого молекула токсина вступает во взаимодействие с различными клеточными структурами. Опубликовано много работ о внутриклеточном транспорте различных РИБ и рицин является одной из наиболее изученных молекул, однако существует мало данных, отражающих внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих субъединицы РИБ. Связывающая субъединица рицина (RTB) не только обуславливает взаимодействие молекулы с поверхностью клетки, но и направляет ее в клеточные компартменты, откуда происходит транслокация каталитической субъединицы (RTA) в цитозоль, в результате чего RTA достигает своей клеточной мишени - рибосомы. Взаимодействие RTA с рибосомой приводит к остановке синтеза белка и гибели клетки. Замена векторной составляющей не только меняет специфичность связывания с поверхностными рецепторами, но и оказывает влияние на взаимодействие интернализуемой молекулы с клеточными структурами, что может приводить к доставке конъюгата в компартменты, из которых затруднена транслокация. Особый интерес представляют данные сравнительного анализа внутриклеточного пути и биологической активности рицина и его структурного и функционального аналога - вискумина (MLI) [Krauspenhaar et al, 1999]. Активность каталитической субъединицы вискумина (MLA) в бесклеточной системе сопоставима с активностью RTA [Barbieri et al, 1993]. Связывающая субъединица вискумина (MLB) отличается от RTB пространственной организацией галактозсвязывающих центров, что приводит к существенным различиям в цитотоксической активности и внутриклеточном транспорте рицина и вискумина [Moisenovich et al, 2002].
Сравнительный анализ внутриклеточного транспорта нативного рицина и различных конъюгатов на основе RTA позволит получить информацию о роли векторной части РИБ и их производных в интоксикации клетки. Эта информация необходима для создания нового поколения препаратов направленного действия, обладающих высокой специфической цитотоксической активностью и незначительными побочными действиями при клиническом применении.
Цель и задачи работы: Целью данного исследования является проведение сравнительного анализа транспорта и цитотоксической активности конъюгатов RTA с векторными молекулами, использующими разные внутриклеточные пути
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методы дополнительной очистки и контроля чистоты препаратов субъединиц рицина. 2. Синтезировать и провести очистку конъюгатов трансферрин-RTA (TF-RTA), эпидермальный фактор роста-RTA (EGF-RTA), а также химерных молекул MLB-RTA, RTB-MLA.
3. Провести сравнительный анализ внутриклеточного транспорта EGF, трансферрина, рицина и вискумина.
4. Оценить цитотоксическую активность TF-RTA, EGF-RTA, MLB-RTA, RTB-MLA, а также нативных молекул рицина и вискумина.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен сравнительный анализ цитотоксической активности конъюгатов RTA с векторными молекулами, определяющими ее доставку в различные клеточные компартменты. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладали конъюгаты, содержащие вектор, который направляет RTA в компартмент, вовлеченный в транспорт основного пула нативного рицина. Полученная информация важна для разработки дизайна иммунотоксинов нового поколения. Синтезированные конъюгаты EGF-RTA и TF-RTA представляют собой потенциальные терапевтические агенты.
Нами показано, что рицин влияет на внутриклеточный транспорт EGF, снижая процент молекул, попадающих в лизосомы.
Совместно с к.б.н. Е.Н. Поповой получена серия моноклональных антител, дискриминирующих изолированную каталитическую субъединицу рицина от нативного токсина. На основе этих антител разработана тест-система, позволяющая выявлять нанограммовые количества RTA в присутствие нативного рицина.
Разработаны методы дополнительной очистки компонентов цитотоксически-активных конъюгатов, позволяющие в дальнейшем минимизировать побочные эффекты при применении их в терапии онкологических заболеваний.
Современные подходы к синтезу и использованию препаратов направленного действия
. Движение кластеров может зависеть также от взаимодействия с цитоскелетными элементами и вторичными мессенджерами, такими как phosphoinositide PtdIns(4,5)P2, который является регулятором формирования актиновых связей на цитоплазматической поверхности рафтов [Simons et al, 2000]. Липиды в мембранах эндоплазматического ретикулума являются в основном ненасыщенными, тогда как в других мембранах преобладают насыщенные липиды. Толщина мембран соответствует гидрофобной длине трансмембранных доменов, а насыщенные и ненасыщенные липидные якоря локализуют белки в разных областях на цитозолыюй стороне плазматической мембраны. Интересно отметить, что взаимодействие разных липидов может формировать липидные фазы с разной степенью подвижности (жидкости). Их разделение происходит в липосомах с липидной композицией, сходной с плазматической мембраной и происходит спонтанное отпочковывание одной фазы от другой. В везикулярном транспорте эти отпочковавшиеся пузырьки содержат специфические белки и направляются к целевым органеллам. Каждую стадию везикулярного транспорта можно разделить на три этапа: отпочковывание от донорной мембраны, узнавание везикулой органеллы-мишени и слияние. Отпочковывающиеся везикулы содержат на своей поверхности комплекс белков - коатомеры (СОР) или белки оболочки. Известны а-, р-, у-, б-, є-, -СОР. Коатомеры изначально находятся в цитозоле в виде олигомеров. Присоединение белков оболочки к мембране компартмента-донора происходит с участием ГТФ-связанной формы N-миристоилированного белка ARF (фактора ADP-рибозилирования), который связан с мембраной и обладает ГТФ-азной активностью. Гидролиз ГТФ необходим для высвобождения ARF и последующей диссоциации СОР-белков с поверхности транспортной везикулы. Такое «раздевание» - одно из необходимых условий для дальнейшего взаимодействия мембран. Так как ARF - слабая ГТФ-аза, в этом процессе участвует ARF-специфичный ГТФ-аза-активирующий белок (GAP) [Munro et al, 2003]. В процессах взаимодействия и слияния транспортных везикул с мембраной органеллы-мишени принимают участие ансамбли белков: v-SNARE - (v - расположены на мембранах везикул), t-SNARE - (/ - target membranes, расположенные на мембранах целевого компартмента). Правильная адресация везикулы происходит благодаря множественным межбелковым взаимодействиям. Кроме того, если бы родственные v-, t-SNARE постоянно образовывали комплементарные пары, то все органеллы в цитоплазме были бы ассоциированы вместе в виде огромного комплекса. Поэтому в клетке существуют механизмы, препятствующие слипанию органелл. Во-первых, t-SNARE, находятся в неактивной форме, если они локализованы в местах, отличных от тех, в которых они должны функционировать. Вероятно, v-SNARE после биосинтеза остаются в неактивной конформации до тех пор, пока не будут корректно встроены в мембрану. Во-вторых, существует ряд белков-протекторов, блокирующих доступы к SNARE. Среди них известен белок типе 18; СОР-белки видимо тоже проявляют такие свойства. Активация белков SNARE возможно включает как конформационные изменения, так и высвобождение (удаление) белков-протекторов [Schimmuller et al., 1998]. Связывание транспортной везикулы с органеллой-акцептором и специфическое узнавание v- и t-SNARE опосредовано Rab-ГТФ и цитозольными белками эффекторами, которые привлекаются белками семейства Rab. Каждая Rab ГТФ-аза взаимодействует как со строго специфичными, так и с общими регуляторными и эффекторными белками. В настоящее время обнаружено множество Rab-модулирующих молекул. Результаты исследований свидетельствуют, что Rab-белки не только облегчают процесс слияния мембран, но также функционируют в формирующихся и отпочковывающихся везикулах, взаимодействуют с белками цитоскелета [Stenmark et al, 2001]. Благодаря высокому уровню содержания ненасыщенных липидов и низкому уровню сфинголипидов и холестерола, мембраны ER оказываются чрезвычайно гибкими и обладают высокой скоростью спонтанной транслокации липидов через бислойную мембрану. Изгибы в этой мембране генерируются с помощью СОРИ оболочек. В ретроградном пути комплекс COPI отпочковывается от мембран Гольджи и этот комплекс также способствует отпочковыванию везикул от липосом [Bigay et al, 2003].
Холестерол спонтанно перемещается между мембранами и вдоль них в виде мономера. Его локализация предопределеляется его высоким сродством к сфинголипидам и насыщенным глицерофосфолипидам. Ориентация сфинголипидов во внутрь клетки указывает на то, что комплекс может специфически включаться в эндоцитический путь или исключаться из везикул, следующих в ретроградном направлении. Действительно, везикулы аппарата Гольджи, несущие COPI пузырьки имеют пониженные уровни содержания сфингомиелина и холестерола [Brugger et al, 2000].
Эти везикулы могут отпочковываться от предсуществующих доменов. Напротив, образование изгиба может индуцировать сортировку с помощью специфического включения ненасыщенных липидов в формирующуюся почку. В этом случае сильно искривленные тубулы, вовлеченные в ретроградный транспорт также будут удалять ненасыщенные липиды из АГ [Drecktrah et al, 2003]. Происходит ли подобная сортировка на цитозолыюй поверхности, за исключением цитозолыю ориентированных фосфатидилсеринов ретроградного пути, остается неизвестным, т.к. липидная организация цитозольной стороны доменов сфинголипида-холестерола, обращенных к цитоплазме пока не изучена. Важную роль в регуляции мембранных потоков между АГ и плазматической мембраной играет цитозольный белок FAPP2, который содержит гликолипид-связывающий домен [Godi et al, 2004].
Недавние исследования показали, что антероградный транспорт в АГ оказался чрезвычайно чувствительным к изменениям концентрации холестерола [Stuven et al, 2003], возможно это ведет к дефектной сегрегации липидов и белков [de Almeida et al, 2003] или к неправильному отложению белков на цитозольной поверхности. Транспорт сфинголипидов и холестерола в АГ прекращается при накоплении липидов в эндоцитотических органеллах (как это наблюдается при многих болезнях лизосомного накопления). Удаление холестерола из эндосом зависит от белка NPC1, который содержит стерол-чувствительный домен. Подобно своему аналогу в плазматической мембране NPC1L1 [Altmann et al, 2004], он транспортирует холестерол (и возможно сфинголипиды) в цитозоль с помощью механизма, который неизвестен, но, возможно, использует везикулярный транспорт.
Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами
Добавление EGF резко уменьшает количество рецептора в кавеолах. Тогда как мотивы для интернализации и деградации локализованы в цитоплазматической области EGFR, полное отсутствие этого региона не препятствует концентрированию этого рецептора во фракции кавеол/рафтов. Yamabhai М and Anderson R.G. W. установили, что участок из 60 аминокислот во втором, богатом цистеином участке EGFR отвечает за направление цитоплазматической части рецептора в кавеолы/рафты. Было показано, что на миграцию активированного рецептора из кавеол в клатрин-окаймленные ямки влияет как собственная киназная активность, так и киназная активность Src [Mineo et al, 1999]. Попадая в клатрин-окаймленные ямки, активированный рецептор интернализуется и оказывается в эндосомах, откуда частично возвращается на поверхность плазматической мембраны. Однако, основная его часть гидролизуется в лизосомах [Yamabhai and Anderson, 2000].
Один из путей передачи сигнала в клетку, активируемых рецептором эпидермального фактора роста, - это метаболизм фосфатидилинозитол бисфосфата (PIP2), катализируемого PLCy. Продукты, образуемые PLCy, - инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерин (DG), - являются вторичными мессенжерами. DG взаимодействует с клеточной мембраной и активирует протеинкиназу С, в то время как, IP3 остается в цитоплазме и вызывает увеличение ионов Са2+, посредством высвобождения последнего из внутриклеточных хранилищ. Ионы кальция в свою очередь вовлечены в активацию Са и кальмодулин-зависимой САМ-киназы (серин/треонин-киназы). На гломерулярно-мезангиальных клетках человека и клетках линии А431 было показано, что EGF в концентрации начиная со 100 нМ, вызывает заметное усиление работы канальных белков мембраны, обеспечивающих приток ионов кальция в цитоплазму.
Другой путь передачи сигнала связан с активацией ras белков. Ras белки - мембраносвязанные ГТФ-связывающие белки. Связывание ГТФ активирует ras, а последующий гидролиз ГТФ до ГДФ приводит к их инактивации. Образование активных ГТФ-связанных ras форм катализируется активирующими тирозин-киназами. Ras белки играют роль ключевых регуляторов митогенеза, так как они являются посредниками между тирозин-киназными рецепторами на плазматической мембране и внутриклеточным каскадом реакций, вызываемым треонин/серин-киназами. При этом показано, что активированный рецептор может участвовать в активации ras белков, даже находясь в эндосомах [Carpenter, 2000].
В некоторых случаях EGFR могут являться самостоятельными транскрипционными факторами: рецептор перемещается к ядру, где воздействует на ряд генов контроля клеточного цикла, присоединяясь к АТ-богатым сегментам ДНК [Oksvold et al., 2002]. Участок аминокислотной последовательности, ответственный за связывание с нуклеиновой кислотой, не идентифицирован; энхансером транскрипции служит пролин-обогащенный фрагмент вблизи от С-конца белка. Было показано, что EGFR ассоциирует с промоторным регионом гена циклина D1, играющего важную роль в процессе митогенеза [Lin et al., 2001].
Трансферриновый рецептор (TFR) также является трансмембранным гликопротеином и по молекулярной массе близок к EGFR - 180 kDa. Он состоит из двух одинаковых субъединиц, связанных дисульфидной связью, по 760 аминокислотных остатков каждая. N-концы субъединиц направлены в цитоплазму. TFR имеет четыре сайта гликозилирования: три на N-конце и один на О-конце, причем правильное гликозилирование N-концов играет критическую роль в связывании и переносе лиганда [Hayes et al, 1997]. Гомодимер TFR содержит три домена в каждой полипептидной цепи: протеазо-подобный домен, похожий по структуре на амино- или карбоксипептидазу, апикальный домен и спиральный домен, вовлеченный в гомодимеризацию TFR. Свободный трансферриновый рецептор также включает гликозилированный регион, трансмембранный домен и N-концевой цитоплазматический домен, который содержит тирозиновую эндосомальную сортировочную последовательность (YTRF) [Enns, 2002].
Лимитирующим фактором интернализации TFR является наличие цитоплазматического домена, который содержит несколько сериновых остатков. Один гомодимер TFR связывает 2 молекулы трансферрина с константой ассоциации 107-109 М"1. Исследования с помощью направленного мутагенеза показали, что связывающий сайт TFR содержит консервативную последовательность RGD (ост. 646-648) в составе спирального домена [Dubljevic et al, 1999]. На поляризованных клетках (например, на гепатоцитах или эпителиальных клетках) TFR почти всегда находится на базолатеральной мембране, исключением являются клетки структур гематоэпцефалического барьера [Roberts et al, 1993]. Количество TFR на плазматической мембране зависит от функционального состояния клетки и концентрации ионов железа внутри нее. При ее уменьшении происходит резкое увеличение количества TFR на поверхности за счет повышения стабильности кодирующей его мРНК.
Подсчитано, что типичные клетки фибробластов интернализуют до 2% своей плазматической мембраны в эндосомы в течение минуты. Возвращение фрагментов мембраны из эндосом на клеточную поверхность необходимо для поддержания гомеостаза мембран [Maxfield et al, 2004]. Число как TFR, так и EGFR пропорционально пролиферативной активности или степени активации клеток, и в целом опухолевые клетки, отличающиеся злокачественным активным ростом, экспрессируют больше TFR и EGFR, чем нормальные. Методом проточной цитофлуориметрии было установлено, что на опухолевых клетках эпителиального происхождения существует достоверная корреляция между экспрессией TFR и EGFR [Фильченков и др, 2000]. На клетках эпидермальной карциномы линии KB было выявлено формирование огромных на складчатых образований на плазматической мембране после стимуляции клеток EGF, что сопровождалось повышением уровня экспрессии TFR.
Получение конъюгатов трансферрина (Тф), epidermal growth factor (EGF), рицина и его субъединиц с различными флуорохромами
Цитотоксическое действие токсинов определяли по выживаемости клеток в присутствии токсинов по методике, описанной ранее [Mossman et al., 1983]. Клетки гибридом, находящихся в логарифмической фазе роста, трижды отмывали от продуцируемых мАт холодной средой RPMI 1640, ресуспендировали в среде RPMI 1640 с 10% ЭТС и распределяли по лункам 96-луночного плейта из расчета 5x104 клеток в 100 мкл на лунку. Предварительно в лунки того же плейта помещали токсины в разных концентрациях в среде RPMI 1640 с 10% ЭТС по 100 мкл в лунку. Клетки с токсинами инкубировали в атмосфере, содержащей 6 % углекислого газа, при +37С в течение 48 часов. По окончании инкубации клетки гибридом трехкратно отмывали от несвязавшегося токсина и в лунки вносили по 10 мкл раствора (2-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) (5 мг/мл в ФСБ) и инкубировали при +37С в течение 3 часов. После центрифугирования 96-луночного плейта (1200об/мин, ЗОмин), супернантную жидкость отбирали, осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, « Sigma»), Колориметрические измерения проводили на униплане «Пикон» при 540 нм. Согласно методике величина оптической плотности прямо пропорциональна числу живых клеток [Mossman et al., 1983]. За контроль (100%) принимали интенсивность окрашивания клеток, которых культивировали в отсутствии цитотоксических агентов. Контрольными клетками в экспериментах по устойчивости новых гибридомных клеток к действию цитотоксических агентов служила линия sp2/0.
Для экспериментов клетки линии А431 так дикого типа, так и трансфецированные выращивали на покровных стеклах при 37С в присутствии 6.1% СОг. Перед получением изображений клетки фиксировали 4%-параформальдегидом и заключали в Мовиол. Для наблюдения за живыми клетками и получения временных серий изображений клетки выращивали на покровных стеклах, заключали в камеры для наблюдения, наполненные средой DMEM, содержащей или не содержащей 10% СПК и забуференной HEPES. В процессе получения изображений живых клеток их содержали в инкубационной камере микроскопа при 37С в присутствии 6.1% С02. Цифровые изображения были получены с помощью микроскопа Axiovert 200М, оборудованного конфокальной сканирующей приставкой LSM51 ОМЕТА Zeiss, Германия. Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Установку размеров pinhole для получения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям производителей системы, для получения временных серий pinhole был открыт полностью для достижения максимальной глубины резкости. Для деконволюции изображений и подсчета колокализации использовали программное обеспечение Imaris 1, Imaris З и «Huygens» (Bitplane, Zurich, Швейцария). Дальнейшую обработку проводили с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop 7.0.
Для полуколичественного анализа на изображении выделяли объекты, размеры которых превосходили 50 пикселей. Такие объекты интерпретировались как отдельные везикулы. Эта операция осуществлялась как для канала детектирующего изображение, обусловленное флуоресцентным сигналом, детектируемым от ФИТЦ (или GFP), так из канала, детектирующего флуоресцентный сигнал от Алекса 568. Считалось, что везикула содержит оба лиганда, если количество пикселей, полученных с каждого канала превышало 30% от общего числа пикселей. Данную процедуру проводили для каждого оптического (среза) слайда в конечном результате получали процент везикул содержащих оба лиганда.
Одной из основных причин, по которой не удается создать иммунотоксин со свойствами «магической пули», является отсутствие векторных молекул, дискриминирующих в организме опухолевые клетки от клеток нормальных тканей. Одна из основных тенденций при конструировании современных иммунотоксинов - это уменьшение их молекулярной массы, что с одной стороны позволяет проникать токсинам в солидные опухоли, через межтканевые барьеры, а с другой стороны выводит иммунотоксины из-под действия иммунной системы. Как правило, такие иммунотоксины содержат один антиген-связывающий центр, вследствие чего их специфичность определяется специфичностью моновалентного взаимодействия антиген-связывающего центра с антигенной детерминантой. При этом взаимное расположение детерминант не влияет на сродство вектор-мишень, в то время как нативные токсины за счет поливалентного связывания обладают специфичностью к супрамолекулярным структурам. Конструирование векторных молекул с учетом различий в пространственном расположении детерминант является одним из путей создания высокоэффективных иммунотоксинов нового поколения. Интоксикация клетки-мишени РИБ или химерными молекулами, содержащими фрагменты РИБ - сложный многоэтапный процесс [Di Cola et al, 2005]. Финальной стадией этого процесса является взаимодействие каталитической субъединицы токсина с внутриклеточной мишенью - рибосомой. Этому взаимодействию предшествует многоступенчатый ретроградный транспорт цитотоксического агента [Iversen et al., 2001; Sandvig et al., 2000, Liu et al, 2006]. Нами проведен сравнительный анализ внутриклеточного транспорта и цитотоксической активности конъюгатов RTA и векторных молекул, направляющих RTA в различные участки эндосомалыюго компартмента. Основная часть экспериментов выполнена на клетках линии карциномы человека А431, которые характеризуются повышенным уровнем экспрессии EGF- и трансферрин-специфичных рецепторов [Zerial et al, 2001; Фильченков и др., 2000]. Для сравнительного анализа внутриклеточного транспорта использовали молекулы, меченные флуоресцентными красителями. Предыдущий опыт показал, что модификация молекулы флуоресцентным красителем способна влиять на внутриклеточный транспорт РИБ [Moisenovich et al., 2002]. Поэтому, предварительная часть экспериментов включала выявление влияния флуоресцентной метки на внутриклеточный транспорт и другие свойства молекулы, в том числе цитотоксическую и митогенную активности, а также способность модифицированной молекулы взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами. Для дальнейших экспериментов отбирали только те фракции флуоресцентно меченых молекул, биологическая активность которых не отличалась от активности немеченых предшественников. Еще один фактор, который нам пришлось учитывать при проведении исследований - влияние сыворотки плода коровы на активность цитотоксических агентов. На рис. 6 представлена активность вискумина на клетках Sp2/0 при культивировании клеток в присутствии сыворотки Сс-рго (Германия) в сравнении с действием того же токсина на ту же линию клеток, но инкубированных в среде, содержащей сыворотку Gibco. Вероятно, подобная разница связана с неодинаковым соотношением ростовых факторов, определяемым технологическими особенностями приготовления сывороток. Все эксперименты по изучению цитотоксичности и транспорта проведены на сыворотке Gibco одного лота.
Сравнительный анализ внутриклеточного распределения рицина и различных векторных молекул
Для синтеза конъюгатов EGF-RTA и TF-RTA нами был взят препарат RTA, подвергнутый дополнительной очистке от следовых количеств RTB. Конъюгирование компонентов производили с помощью гетеробифункционального реагента СПДП, который был выбран нами из-за его способности создавать легко восстанавливаемую сшивку. В результате модифицирования в одну молекулу вектора вводили 3-4 пиридилдисульфидные группы. RTA активировали добавлением дитиотреитола. После инкубации конъюгат очищали от непрореагировавших компонентов с помощью гельфильтрации. Полученные фракции анализировались с помощью электрофореза в ПААГ и для дальнейших экспериментов была выбрана фракция, содержащая конъюгат с соотношением вектор-RTA 1:1.
С помощью МТТ теста была определена цитотоксическая активность этих конъюгатов на клетках линии А431. Цитотоксическая активность конъюгата EGF-RTA была сопоставима с цитотоксической активностью нативного рицина. ЛД50 для рицина составляла 10"12 М, а для EGF-RTA 10"" М (рис.22). В тех же экспериментальных условиях ЛД50 TF-RTA составляла 10"9М, что на два порядка меньше, чем у EGF-RTA и на три порядка меньше, чем у рицина. Сходные результаты были получены для клеток линии HeLa (эпителиоидной карциномы шейки матки человека), CaOv (рака яичника человека) (табл. 3). Клеточные линии А431, HeLa и CaOv отличаются по уровню экспрессии рецепторов [Фильченков и др., 2000]. На клетках А431 экспрессировано наибольшее количество рецепторов как для трансферрина, так и для EGF. При этом на клетках CaOv ЛД50 для конъюгата TF-RTA не отличалась от ЛД50 А431. А для конъюгата EGF-RTA ЛД50 была хоть и незначительно, но ниже, чем на клетках А431. Отсутствие зависимости между количеством рецепторов на клетках-мишенях и чувствительностью этих клеток к конъюгатам указывает на определяющее значение внутриклеточного маршрута цитотоксического агента при интоксикации клеток конъюгатами, содержащими RTA.
EGF в составе конъюгата EGF-RTA доставляет каталитическую субъединицу в ту же часть эндосомального рециклингового компартмента, в котором аккумулируется рицин. По всей видимости, именно в этом компартменте происходит восстановление межсубъединичной дисульфидной связи (см. динамику накопления свободной А-цепи в лизатах и супернатантах клеток, предобработанных нативным рицином, представленную на рис. 9). Альтернативным местом восстановления дисульфидной связи могут являться цистерны аппарата Гольджи или эпдоплазматический ретикулум. Однако свободная А-цепь обнаруживается в клеточных лизатах до того, как токсин проникает в аппарат Гольджи в количествах, достаточных для его визуализации. Рицин накапливается в эндосомах, что создает возможность для его агрегации и взаимодействия с люминалыюй частью эндосомальной везикулы. Нами было показано, что токсин присутствует в ранних эндосомах в мембран-связанной форме. Этот компартмент очень динамичен. Рицин-содержащие эндосомы постоянно сливаются друг с другом и другими везикулами, после чего образующиеся структуры вновь распадаются на мелкие везикулы. Этот процесс можно изучать при прижизненном наблюдении за обработанными флуоресцентно-мечеными токсинами клетками [Moisenovich et al., 2002]. Из литературных данных известно, что рицин обладает фосфолипазной активностью [Morlon-Guyot et al., 2003]. Все вышеперечисленные факторы создают предпосылки для нарушения целостности мембран рицин-содержащих везикул. Предположение о способности рицина нарушать целостность эндосомальной мембраны подтверждается имеющимися литературными данными о том, что токсин способен проникать через эндосомальную мембрану АТФ-зависимым путем [Beaumelle et al, 1993]. Таким образом, свободная А-цепь предположительно может через поврежденные участки эндосомальной мембраны попадать непосредственно в цитозоль без участия механизмов ретроградного транспорта.
Важную роль в процессе нарушения целостности эндосомальной мембраны играет В-цепь рицина, которая направляет токсин в оптимальный для транслокации субкомпартмент и обеспечивает взаимодействие токсина с люминальнои частью везикулы. Замена В-цепи на другую векторную молекулу может нарушать этот процесс, что ведет к существенному снижению цитотоксической активности подобных конъюгатов. Цитотоксическая активность большей части иммунотоксинов, полученных на основе различных векторных молекул, включая моноклональные антитела против меланомассоциированного антигена B3F7, маркеров Т- и В-лимфоцитов (CD3, CD5, CD7, CD20, CD25), была ниже цитотоксичности нативного рицина на два порядка.
EGF обладает способностью к димеризации [Mayawala et al, 2005] и в составе конъюгата не только направляет RTA по характерному для нее пути, но и обеспечивает поливалентное взаимодействие с люминальнои частью мембраны.
Несмотря на то, что рицин и вискумин являются структурно-функциональными аналогами, их транспорт начинается с разных участков мембраны и осуществляется через разные участки ранних эндосом, что было показано ранее на клетках линии ЗТЗ [Moisenovich et al., 2002]. На рисунке 23 представлено взаимодействие токсинов с поверхностными рецепторами мышиных фибробластов линии ЗТЗ. Рицин преимущественно взаимодействует с кластерами рецепторов, расположенными в центре клетки вокруг ядра и непосредственно над ядром. Вискумин связывается с рецепторами практически на всей клеточной поверхности. Вискумин также выявляет кластеры рецепторов в центре клетки, причем расположение рицин-специфичных и вискумин-специфичных кластеров совпадает не всегда.
При проведении эксперимента были созданы условия, исключающие проникновение токсинов внутрь клетки через повреждения мембраны, вызванные действием фиксатора. Для предотвращения такого проникновения использовался 0,2% раствор желатина, увеличивающий вязкость раствора, содержащего флуоресцентно-меченые токсины. Контролем служили ФИТЦ-меченые антитела против клатрина, которые взаимодействовали с некоторыми клетками препаратов, фиксированных формалином. При добавлении желатина такое взаимодействие не наблюдалось. Таким образом, в присутствие желатина выявляются только структуры, ассоциированные с поверхностью клеток.
