Содержание к диссертации
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1 Механизмы химического канцерогенеза
1.2.Химические канцерогены окружающей среды
1.3. Механизмы активации непрямых канцерогенов
1.4. Стимуляция пролиферации как необходимое звено опухолевой промоции
1.5 Митогенный эффект активных форм кислорода
1.6.Транскрипционный фактор NF-kB и его роль в пролиферации опухолевых клеток
1.7.Межклеточные щелевые коммуникации и их ингибирование в ходе опухолевой промоции
1.8. Апоптоз. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Культура клеток
2.2. Проницаемость щелевых контактов
2.3. Определение уровня БП и БеП в клетках
2.4. Реакция связывания NF-kB и АР-1 с консенсусным Олигонуклеотидом (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)
2.5.Электрофорез и Иммуноблотинг
2.6. Транзиторная трансфекция и определение гена-репортера
2.7. Определение влияния ПАУ на образование АФК в клетках гепатомы Г-
3. РЕЗУЛЬТАТЫ. ЗЛ.Ингибирование межклеточных щелевых контактов при действии ПАУ в культуре клеток HepG
3.2.Ингибирование межклеточных щелевых контактов ПАУ в культуре клеток Г-
3.3.Влияние ПАУ на экспрессию белков р21 и р
3.4.Влияние ПАУ на активность NF-kB. а. Влияние ПАУ на транскрипционную активность NF-kB, определяемую методом транзиторной трансфекции. б. Влияние ПАУ на активацию NF-kB, определяемую методом EMS А
3.5.Влияние ПАУ на активацию АР-
3.6. Влияние ПАУ на образование АФК
4.0БСУЖДЕНИЕ
5.ВЫВОДЫ. •
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время для решения целого ряда проблем цитологии, клеточной биологии и биологии развития используются самые разные модели. Это обусловлено поразительным множеством и сходством морфофункциональных, молекулярно-генетических и биохимических изменений, лежащих в основе жизнедеятельности клеток в различных условиях функционирования в норме и при развитии патологических процессов. С этих позиций довольно часто в экспериментальных исследованиях используется модель канцерогенеза. Очевидно, что работы в этой области важны и для биологии, и для практической медицины.
Причины возникновения злокачественных опухолей многообразны. К ним следует отнести ультрафиолетовое излучение, ионизирующую радиацию, инфекционные агенты, генетические факторы и др (11). Лидирующие позиции в этом списке занимают химические канцерогены (8, 17, 18).
Среди химических канцерогенов имеются, так называемые, непрямые и прямые. Непрямые канцерогены (проканцерогены) исходно биологически инертные вещества и для их превращения в активный канцероген требуется метаболическая трансформация в клетке. Прямые канцерогены в исходной форме реализуют свой канцерогенный потенциал. Кроме того, среди химических канцерогенов выделяют «полные» и «неполные».
Полные канцерогены способны индуцировать развитие опухоли без дополнительных воздействий. Неполные - индуцируют или стадию инициации (инициаторы), или стадию промоции (промоторы).
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), используемые в нашей работе, являются полными непрямыми канцерогенами.
Именно ПАУ - наиболее распространенные загрязнители окружающей среды. Эти соединения находятся в выхлопных газах двигателей внутреннего сгорания, в табачном дыме, их выявляют в продуктах питания, подвергшихся термической обработке и пр. Как известно, в течении химического канцерогенеза принято выделять три стадии: инициация, промоция и прогрессия (16). Что касается ПАУ, то в первую очередь следует обратить внимание на то, что до настоящего времени исследования по механизму их канцерогенного действия были направлены на изучение инициации, поскольку считалось, что именно эта стадия является определяющей в развитии опухоли при действии непрямых канцерогенов. Попытки применения и разработка новых препаратов, ингибирующих стадию инициации (в первую очередь антиоксиданты, ингибиторы свободно - радикальных процессов) успеха не принесли. Исследования последнего времени дали основания считать, что стадией, определяющей канцерогенность ПАУ, является стадия промоции (151). Поэтому изучение механизмов промоции при действии непрямых канцерогенов является важной и актуальной задачей, дающей в перспективе возможность создания профилактических и лечебных препаратов, препятствующих (или замедляющих) развитие опухолевого процесса.
Цель исследования - изучение механизмов опухоль-промоторного действия «полных» канцерогенов на примере ПАУ на модели культуры клеток гепатом.
Задачи исследования; 1. провести сравнительное изучение действия канцерогенных ПАУ и их неканцерогенного аналога на функциональную активность межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК) в культуре клеток гепатом, экспрессирующих и неэкспрессирующих ферменты метаболизма и Ah-рецептор.
2. исследовать образование активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах при действии канцерогенных и неканцерогенных ПАУ; 3. сравнить экспрессию белков-супрессоров р21 и р27 в культуре клеток при действии ряда ПАУ.
4. исследовать влияние ПАУ на активацию транскрипционных факторов АР-1 (activated protein 1) и NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс кВ).
Научная новизна работы.
В нашей работе впервые использована в качестве сравнительной модели для изучения опухолевой промоции уникальная культура клеток гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ah-рецептора.
Проведенное сравнительное исследование показало, что наблюдаемые нами эффекты ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционного фактора NF-kB) обусловлены действием исходной химически инертной молекулой вещества.
Мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.
Впервые продемонстрировано существование ранее неизвестного механизма опухоль-промоторного действия канцерогенных ПАУ. Теоретическая и практическая значимость. Известно, что в химическом канцерогенезе выделяют 3 стадии: инициация, промоция и прогрессия. Стадия инициации химического канцерогенеза для ПАУ достаточно хорошо изучена, однако в представлениях о стадии промоции, необходимой для дальнейшего выживания инициированной клетки, остается много невыясненных вопросов. Полученные нами данные позволяют ответить на некоторые из них. В частности, нами установлено, что нарушение функционирования МЩК, активация некоторых белков, регулирующих клеточную пролиферацию и апоптоз на стадии опухолевой промоции, вызываются исходной биологически инертной молекулой ПАУ, по ранее неизвестному механизму.
Полученные данные углубляют существующие представления о механизмах действия ПАУ, реализующихся на стадии опухолевой промоции.
Полученные результаты важны для экспериментальной онкологии, гистологии, биохимии и молекулярной биологии, кроме того, их целесообразно учитывать при разработке новых способов лечения и профилактики онкологических заболеваний.
