Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБУСЛОВЛЕННАЯ ГИПОКСИЕЙ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОПУХОЛЕЙ И ПУТИ ЕЕ ПРЕОДОЛЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 9
1. Кислородный эффект на клеточном уровне 9
2. Недостаток кислорода в опухолях как фактор, определяющий их радиорезистентность 12
3. Оксигенация нормальных тканей 16
4. Гипоксичность опухолей как проблема лучевой терапии 19
5. Кислородная константа К, трудности ее определения 20
6. Защитное действие радиапдонно-химического поглощения кислорода in vivo при высокой мощности дозы излучения 27
7. Преимущественная защита нормальных тканей при гипоксирадиотерапии 30
8. Протоны высоких энергий в лучевой терапии опухолей 32
9. Искусственная гипергликемия как способ избирательного усиления действия излучения на опухоли 33
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
I. Исследования in vitro 42
1.1. Культура клеток и оценка их клоногенной активности 42
1.2. Методика создания различных условий оксигенации 43
1.3. Облучение проб 44
1.4. Обработка данных по выживаемости клеток ... 44
1.5. Исследование метаболического и радиационно-химического поглощения кислорода 45
2. Исследования in vivo 46
2.1. Экспериментальные животные и опухоли .... 46
2.2. Локальное облучение опухолей и создание гипоксии в опытах на медицинском пучке протонного синхротрона ИТЭФ 47
2.3. Локальное рентгеновское облучение опухолей и создание при этом газовой гипоксии 48
2.4. Создание индуцированной кратковременной гипергликемии 49
2.5. Оценка реакций опухолей на облучение 49
2.6. Оценка острых лучевых реакций кожи 52
2.7. Оценка модификации радиочувствительности опухолей и нормальных тканей и выбор наиболее благоприятных режимов терапии 55
ГЛАВА III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИСЛОРОДНОЙ КОНСТАНТЫ К ПРИ ОБЛУЧЕ НИИ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИИ 7 57
ГЛАВА IV. ГИПОКСИРАДИОТЕРАПИЯ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЭРЛИХА ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ПРОТОНАМИ С РАЗНОЙ МОЩНОСТЬЮ ДОЗЫ 74
ГЛАВА V. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КРАТКОВРЕМЕННОЙ ГИПЕРГЛИ КЕМИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОКСИРАДИОТЕРАПИИ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ 89
ЗАКЛКЯЕНИЕ 108
ВЫВОДЫ 116
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 118
- Кислородный эффект на клеточном уровне
- Культура клеток и оценка их клоногенной активности
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИСЛОРОДНОЙ КОНСТАНТЫ К ПРИ ОБЛУЧЕ НИИ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИИ
- ГИПОКСИРАДИОТЕРАПИЯ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЭРЛИХА ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ПРОТОНАМИ С РАЗНОЙ МОЩНОСТЬЮ ДОЗЫ
- ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КРАТКОВРЕМЕННОЙ ГИПЕРГЛИ КЕМИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОКСИРАДИОТЕРАПИИ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ
Кислородный эффект на клеточном уровне
Усиление кислородом лучевого повреждения биологических объектов - от макромолекул до целого организма - одна из наиболее общих закономерностей при действии ионизирующей радиации. Кислород является естественной и необходимой компонентой живой клетки, его концентрация варьирует в организме в довольно широких пределах и поддается внешней регулировке, а кислородозависимая модификация радиочувствительности обычно наиболее сильно выражена и потому во многом определяет эффект лучевого воздействия. В связи с этим понятен неослабевающий интерес к изучению "кислородного эффекта" (КЭ). Современные представления о роли кислорода в радиобиологических явлениях, включая наиболее важные аспекты практического применения радиации, обобщены в ряде монографий и обзоров, вышедших в последнее время (46, 63, 64, 68, 75).
Однако, несмотря на большое количество экспериментальных исследований, полной ясности в механизме КЭ пока нет и этот вопрос продолжает интенсивно разрабатываться. Сейчас общепринято, что усиление поражения клеток при облучении в присутствии кислорода определяется не особенностями их функционирования и/или метаболизма, а исключительно физико-химическими взаимодействиями облучаемых соединений со свободным кислородом. В присутствии кислорода усиливается так называемое прямое действие излучения; в определенной степени возрастает и эффективность его косвенного действия. Наиболее обоснованной представляется схема механизма КЭ, предложенная Л.Х.Эйдусом и Ю.Н.Корыстовым (64). В результате прямого или косвенного действия радиации возникают первичные короткоживущие кислород чувствительные повреждения (переход в радикальную форму) мишени (уникальных структур, в первую очередь ДНК), которые могут взаимодействовать как с кислородом, так и с донорами электронов. В первом случае повреждения становятся необратимыми, а во втором - образуются состояния, сами по себе летальные, но поддающиеся ферментативной репарации. Таким образом, на первом, физико-химическом, этапе модификации определяется доля первичных повреждений, поддающихся репарации, которая зависит от соотношения концентраций доноров и акцепторов электронов в клетке в момент облучения, а пострадиационные условия сказываются на том, какая часть из этих в принципе репарируе-мых повреждений окажется фактически элиминирована в результате восстановительных процессов.
Культура клеток и оценка их клоногенной активности
Данная часть работы выполнена на клетках китайского хомячка линии В-Н-ГАГ-28 анеушюидного клона 431. Методика работы с клетками была в основном такой же, как и в ранее проведенных в лаборатории исследованиях (5, 36, 38). Клетки выращивали в среде, состоящей из 40$ среды Игла, 40$ среды 199, 10$ сыворотки крупного рогатого скота и 10$ эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл калиевой соли бензилпенициллина и 100 мкг/мл стрепто-мицина сульфата. Через 3 суток после посева 10 клеток на флакон Карреля, когда они уже образовывали монослой и находились в ранней стационарной фазе роста, питательную среду меняли на среду, в которой концентрация сыворотки была снижена до 1$, что еще больше замедляло размножение клеток. После этого в течение суток до облучения клетки находились либо в условиях обычной хорошей оксигенации (так называемые "нормоксические" клетки), либо - в гипоксии, создаваемой заменой воздуха во флаконах Карреля на смесь, содержащую лишь 2$ 0g ("хронически гипоксические" клетки).
Перед облучением монослой клеток снимали со стекла 0,3$-ным раствором трипсина и доводили до одиночных клеток пипетировани-ем. Получившуюся взвесь, после определения концентрации клеток в ней с помощью камеры Горяева, разводили питательной средой до требуемых при облучении концентраций.
После облучения клеток в суспензии и соответствующего разведения их рассевали в стеклянные чашки Петри диаметром 10 см - по 2-3 чашки на точку - и выращивали 8-Ю суток в термостате с подачей 5$ С0р. Образовавшиеся колонии фиксировали Ю$-ным формалином и окрашивали метиленовим синим. Выживаемость определяли по соотношению числа колоний, содержащих не менее 50 клеток, выросших при данной дозе облучения и в контроле,
Определение кислородной константы к при облуче нии клеток в суспензии
В данном разделе работы, выполненном на клетках в суспензии, демонстрируется влияние на получаемые в гипоксических условиях результаты поглощения кислорода во время облучения и предлагается способ корректной оценки зависимости радиочувствительности клеток от концентрации кислорода. С помощью разработанной методики проверяется сделанный ранее вывод о различии этой зависимости для "нормоксических" и "хронически гипоксических" клеток, имеющий принципиально важное значение с позиций гипоксирадиоте-рапии и других кислородзависимых методов модификации лучевой терапии опухолей.
Все эксперименты по оценке влияния на получаемые результаты поглощения кислорода во время облучения проведены на "нормоксических" клетках, эффективность высева которых в разных опытах колебалась от 30 до 70$.
В табл. 3 представлены результаты двух независимых экспериментов, в каждом из которых клеточные суспензии облучали в дозах 18 Гр при 22С после одновременного продувания газовой смесью, содержащей 0,29$ 02« Облучение части проб проводили непрерывно, в виде одной фракции, остальных - за 2 или 3 фракции с 30-40 секундными промежутками между ними. При этом в одних случаях и до начала радиационного воздействия и между фракциями ампулы интенсивно встряхивали для восстановления в среде равновесной с газовой фазой концентрации кислорода, в других - нет.
Как видно из табл. 3, процедура дробления дозы со встряхиванием образцов приводила к значительному уменьшению выживаемости клеток, причем сами по себе перерывы в облучении на ней практически не сказывались.
Гипоксирадиотерапия солидных опухолей эрлиха при облучении протонами с разной мощностью дозы
В этом разделе излагаются результаты исследований по изучению действия протонов высоких энергий синхротрона ИТЭФ на опухоли и кожу мышей при облучении с разной мощностью дозы в условиях дыхания животными воздухом и газовыми гипоксическими смесями.
На рис. 5 и 6 представлены зависимости длительности задержки роста опухолей и степени лучевых реакций кожи в зоне роста опухолей от дозы протонного излучения. Каждая точка представляет среднее время задержки роста опухолей или среднюю интенсивность реакций кожи для группы из 10-15 животных. В каждом опыте облучение протонами проводилось при "высокой" и "низкой" мощностях дозы (ВД и НМД) как на воздухе, так и в условиях гипоксии в приблизительно одинаковых дозах. В связи с тем, что из пяти проведенных экспериментов два последних были поставлены через год после трех первых, а опухоли в этих сериях опытов несколько отличались по своим характеристикам (в последних опытах время удвоения объема опухолей уменьшилось приблизительно на 15%, а их радиорезистентность возросла более чем на 20$), данные по опухолям представлены на двух отдельных графиках. Кожные реакции во всех экспериментах укладываются в единый график и поэтому на рис. 6 приводятся сводные данные сразу по пяти опытам.
Представленные на рисунках результаты приведены также в табл. 7 и 8. Материалы частично дублированы для того, чтобы,не перегружая графики,указать в таблицах величины стандартных ошибок всех точек, а также продемонстрировать варьирование результатов от опыта к опыту.
Оценка эффективности кратковременной гипергли кемии при экспериментальной гипоксирадиотерапии солидных опухолей
Опыты, описанные в данной главе, являются одним из фрагментов радиобиологических исследований по применению газовой гипоксии и кратковременной гипергликемии (КГ) в лучевой терапии опухолей, выполняемых в рамках Всесоюзной межведомственной программы "Модификатор" (58) и развивающих идею полирадиомодификапии (65, 66).
На рис. 9 и в табл. 9 показаны результаты четырех экспериментов, в которых по критерию задержки роста опухолей оценивали эффективность использования КГ при облучении на воздухе и в гипо-ксических условиях. В последних двух опытах, поставленных спустя год после первых, свойства опухолей, как уже отмечалось в предыдущей главе, заметно изменились - несколько уменьшилось время удвоения, более чем на 20$ увеличилась радиорезистентность, а кроме того, ослабло модифицирующее действие КГ. Поэтому полученные данные представлены на двух отдельных графиках, каждый из которых объединяет результаты двух экспериментов.
В обеих сериях опытов применение при облучении газовых смесей, содержащих &f0 02, привело лишь к слабой защите опухолей: ФЙД на уровне задержки в 30 дней составил всего 1,08 и 1,03. Это согласуется с результатами, полученными при облучении протонами и определяется значительной фракцией аноксических клеток в исследуемых опухолях.
При анализе результатов, полученных с применением КГ, следует иметь в виду, что она уже сама по себе, без облучения, вызывала небольшую, продолжительностью около трех дней, задержку в росте опухолей.
