Содержание к диссертации
Введение
1. Озор литературы 10
1.1. Макрофаги 10
1.1.1. Морфологические особенности и молекулярногенетическая организация макрофагов 10
1.1.2. Реактивность макрофагов как механизм, регулирующий воспаление 13
1.2 Апоптоз и некроз - две формы гибели клетки 17
1.3. Роль липидов в апоптозе и некрозе 25
1.3.1. Липидыядра 25
1.3.2. Роль липидов в рецепции и внутриклеточной сигнализации. 28
1.3.3. Перекисное окисление липидов и его роль в реализации рограммы апоптоза и некроза 33
1.4. Роль липополисахаридов, активных форм кислорода и ме иаторов воспаления в апоптозе и некрозе макрофагов 37
2. Мтериалы и методы 43
2.1. Материалы 43
2.2. Методы 43
2.2.1 Объект исследования 43
2.2.2. Получение перитонеальных макрофагов 44
2.2.2.1.Постановка эксперимента 44
2.2.3. Выделение ядер ПМФ 45
2.2.4. Определение жизнеспособности клеток 45
2.2.5. Экстракция липидов из ПМФ и их ядер 46
2.2.6. Определение диеновых, триеновых коньюгатов и малоно ого диальдегида в ПМФ и их ядрах. 46
2.2.7. Фракционирование липидов в тонких слоях силикагеля и их количественное определение 47
2.2.8. Определение активности СОД и каталазы в ПМФ и их ядрах 49
2.2.9. Определение концентрации общего белка в ПМФ и их ядрах 50
2.3. Выделение и электрофорез ДНК макрофагов в агарозномеле 51
2.3.1. Приготовление агарозного геля 52
2.3.2. Определение концентрации ДНК 53
2.3.3. Световая и флуоресцентная микроскопия ПМФ 53
2.3.4. Окрашивание по Паппенгейму-Крюкову 54
2.3.5. Окрашивание акридиновым оранжевым. 54
2.3.6. ОкрашиваниеHoechst33258 55
2.3.7. Статистическая обработка данных 55
3. Рзультаты исследований 56
3.1 Влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на гибель перионеальных макрофагов 56
3.2. Влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на спектр липидов перитонеальных макрофагов и их ядер 65
3.3. Изменение окисленности липидов при Н2О2 и ЛПС Е..coli — индуцируемой гибели ПМФ 75
3.4. Влияние Н2Ог и ЛПС Е. coli на активность некоторых анти-оксидантых ферментов 82
3.5. Влияние модификаторов фосфоинозитидного цикла на гибель перитонеальных макрофагов 88
3.6. Влияние модификаторов Са -проницаемости на Н2О2-индуцированный апоптоз перитонеальных макрофагов 93
4. Осуждение 97
Вводы 108
Сисок литературы 110
- Апоптоз и некроз - две формы гибели клетки
- Методы
- Выделение и электрофорез ДНК макрофагов в агарозномеле
- Изменение окисленности липидов при Н2О2 и ЛПС Е..coli — индуцируемой гибели ПМФ
Введение к работе
Актуальность проблемы. В формировании и функционировании многоклеточного организма, принимают участие две формы клеточной гибели — некроз и апоптоз, имеющие морфологические, биохимические и генетические особенности. Некроз ассоциируется с действием вредоносных агентов и факторов, характеризуется нарушением целостности клеточной мембраны. Апоптоз, как генетически детерминированный процесс гибели реализуется при наличии внешних стимулирующих сигналов и внутренних предпосылок, связанных с появлением нерепарируемых повреждений ДНК.
В последние годы получены веские доказательства участия липидов не только в функционировании клеточных мембран, но и в молекулярной организации хроматина и хромосом, в регуляции генетических процессов — транскрипции и репликации (Слюсарь Н. Н., 1999; Стручков В. А., 2000; Martelli А. М. et al., 2004). В ядре обнаружены сигнальные системы, включая фосфоинозитидный и сфигномиелиновый циклы (Marshall С. J., 1995; Alan W., Ulrich М., 2002). Важной формой участия липидов в межклеточной стимуляции является то, что модификация липидного микроокружения рецепторов изменяет их чувствительность (Белоконева О. С. , 1993; Проказова Н. В. и др., 1998; Самуилов В. В., 2000; Gordon S. et al., 1995). Очевидно, что изменения в обмене липидов могут играть важную роль в регуляции клеточных процессов, включая и ядерную активность. При этом нарушения липидного гомеостаза, обусловленные активизацией процессов пероксидации липидов и фосфолипазами, приводящие к изменению клеточного статуса, в конечном итоге могут способствовать апоптозу или некрозу клетки (Егорова А. Б. и др., 2001; Butthe Т. М., Sadstrom Р. А ., 1994; Hale A. J. et al., 1996).
Для изучения роли липидов в реализации программы апоптоза и некроза подходящим объектом выступают перитонеальные макрофаги, которые являются реактивными клетками, реализующими широкий спектр функциональных возможностей при воспалении (Щербаков В. И., 1990; Зубова С. Г., Окулов В. Б., 2001). При этом в очаге воспаления перитонеальные макрофаги функционируют в среде, содержащей в больших количествах активные формы кислорода и липополисахариды, мишенями действия которых могут выступать липиды (Пескин А. В., 1996; Weinstein S. L., et al., 1991; Vesy С. J., 2000). Известно, что при воспалении в МФ усиливается липидный метаболизм, усиливаются процессы пероксидации липидов (Gordon S. et al., 1997). Макрофаги отвечают на воздействие разнообразных агонистов, быстро гид-ролизуя мембранные фосфолипиды, что приводит к генерации большого числа внутриклеточных и экстраклеточных мессенджеров, в результате чего реализуется многофункциональный потенциал этих клеток (Клебанов Г. И., Владимиров Ю.А., 1999). Одним из наиболее ранних событий, запускаемых в макрофагах при воспалительных реакциях, является активация сигнальных путей с участием фосфоинозитидспецифической фосфолипазы С и фосфоли-пазы Аг, играющих ключевую роль в хемотаксисе, секреции, фагоцитозе (Попова Е. Н. и др., 2002; Rao D.M. et al., 1995; Lee S. В., Rhee S. G., 1995; Yoshinori N., 2002).
Таким образом, ПМФ являются функционально активными клетками и снижение их активности приводит к снижению эффективности воспалительного процесса. Очевидно, что поврежденные ПМФ должны быть элиминированы.
В связи с этим, представлялось целесообразно исследовать изменения в спектре липидов перитонеальных макрофагов и их ядер при индуцированной гибели клеток перекисью водорода и липополисахаридом из Е. Coli.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении изменений состава липидов перитонеальных макрофагов и их ядер при апоптозе и некрозе.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов.
2. Исследовать изменение спектра липидов перитонеальных макрофагов и их ядер при Н2О2 и ЛПС Е. coli индуцируемой гибели клеток. 3. Исследовать активность процессов перекисного окисления липидов и ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и каталазы) в перитонеальных макрофагах и их ядрах при Н2О2 и ЛПС Е. coli индуцируемой гибели клеток.
4. Изучить влияние модификаторов фосфоинозитидного цикла на гибель перитонеальных макрофагов.
5. Изучить влияние модификаторов Са2+-проницаемости на Н2Ог- индуцированный апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов..
Научная новизна работы. Впервые проведено широкое комплексное исследование липидного компонента перитонеальных макрофагов и их ядер при апоптозе и некрозе. Показано, что перекись водорода в концентрации 1 мМ и ЛПС Е. coli в концентрации 1 мкг/мл вызывают гибель перитонеальных макрофагов преимущественно путем апоптоза. Определена склонность перитонеальных макрофагов к гибели по пути апоптоза или некроза при соответствующих изменениях в спектре липидного компонента клеток и их ядер, при изменении активности процессов перекисного окисления ЛИПИДОВ; и ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и каталазы) макрофагов. С помощью модификаторов ФИ-цикла показано, что нарушение в обмене ФИ-цикла является одной из причин толкающих клетку на путь апоптоза; выявлено влияние модификаторов Са -проницаемости на Н2О2-индуцированный апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов. Положения, выносимые на защиту:
1. Перекись водорода и ЛПС Е. coli дозозависимым образом стимулируют апоптоз и некроз перитонеальных макрофагов. 2. Перестройки в спектре липидов перитонеальных макрофагов и их ядер происходят при развитии как апоптотического так и некротического процесса, индуцируемого перекисью водорода и ЛПС Е. coli.
3. Перекись водорода и ЛПС Е. coli усиливают процессы пероксидации липидов и снижают антиоксидантную защиту перитонеальных макро фагов и их ядер, что провоцирует их гибель.
4. В реализации программы апоптоза перитонеальных макрофагов важную роль играют ФИ-цикл и ионы Са2+.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы биологии клетки - проблемы молекулярных механизмов гибели клетки, расширяя представления об участии липидов в апоптозе и некрозе. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и практическую значимость. На основании динамики изменения со-держания индивидуальных липидов можно выявлять склонность клетки к апоптозу или некрозу.
Практическую ценность имеют данные о влиянии перекиси водорода, ЛПС Е. coli, модификаторов ФИ-цикла и Са -проницаемости на гибель перитонеальных макрофагов. Полученные данные позволяют рекомендовать использование перекиси водорода как эффективного индуктора апоптоза, выявляющего и элиминирующего популяцию клеток с генетическими повреждениями.
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на международной научной конференции «Биотехнология на ру беже двух тысячелетий» (Саранск, 2001 г), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино-на-Оке, 2003 г.), на III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Диз-регуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004 г.), на ежегодных Огаревских чтениях (научных конференциях Мордовского госуниверситета) (Саранск, 2001, 2003, 2004 г.), на международной научной конференции «Современные медицинские технологии» (Хорватия, У маг, 2004 г.).
Апоптоз и некроз - две формы гибели клетки
В настоящее время изучение клеточной гибели становится одной из бурно развивающихся областей биологических наук. Гибель клеток играет важную роль в формировании и функционировании многоклеточного организма. Патогенез многочисленных заболеваний связан с потерей нормального контроля организма над клеточной гибелью. Существуют два типа гибели - апоптоз и некроз. Апоптоз - программируемая гибель клеток, есть механизм регулирования количественного содержания клеток в тканях и органах. Некроз - это патологическая форма клеточной смерти (Ярилин А. А., 1996; Проскуряков С. Я. и др., 2002). Основные морфологические признаки апоптоза - вакуолизация и конденсация цитоплазмы и хроматина с последующей клеточной фрагментацией на апоптотические тельца, содержащие остатки ДНК и клеточные органеллы, при этом сохраняется целостность внешней мембраны и, поэтому, в отличие от некроза, апоптоз не сопровождается развитием воспаления (Самуилов В. Д. и др., 2000; Белушина Н. Н., 2001; Higuchi Y, 2003). На биохимическом уровне апоптоз сопровождается угнетением включения в клетки глюкозы и нуклеозидов: снижением синтеза липидов, белков и АТФ; фрагментацией ДНК на 180 - 200 н. п. в результате активации эндонуклеаз (Bursch W, 1992; Тронов В. А., 1999). Некроз характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизо-сомальных ферментов, разрывам ДНК случайным образом, кариолизу ядра и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство (Проскуряков С. Я. и др., 2002). Форма клеточной гибели — по пути апоптоза или некроза — во многом определяется внутренним состоянием клеток: их типом, степенью дифференцировки, состоянием генома, стадией клеточного цикла, внутриклеточной концентрацией НАДФ+ и АТФ. Снижение уровня НАДФ+ и АТФ ведет к индукции некроза (Новиков В. С. и др., 1996; Ярилин А. А., 1996; Самуилов В. Д. и др., 2000). Существуют рецепторы и механизмы для реализации той или иной формы гибели. Важнейшей характеристикой апоптоза является то, что этот процесс находится под строгим регуляторным контролем (Чумаков П. М, 1998; Скулачев В. П., 1999; Самуилов В. Д. и др., 2000; Белушина Н.Н.,2001).
Реализация генетической программы апоптоза осуществляется при действии на клетку различных стимулов, поступивших извне (гликокортикоиды, антигены, мембраносвязанный Fas-лиганд, ФНО, лимфоксины, интерфероны, адгезивные белки) или возникших внутри клетки (повреждения биомембран и хромосом, многочисленные разрывы ДІЖ, поперечные сшивки полинук-леотидных цепей ДНК) (Ярилин А. А. и др., 1996). Апоптоз стимулируется при действии различных факторов: двухвалентных катионов (Са и Zn ), молекулярных перестроек мембран апоптотических клеток, активацией сигнальных путей гибели клетки (Егорова А. Б. и др., 2001; Yoshinori К, 2002). В реализации программы клеточной гибели могут участвовать прямо или косвенно различные сигнальные пути, в частности, аденилатциклазный путь, сфингомиелиновый путь, каскад тирозиновых киназ и другие (Самуилов В. Д., 2000). Воспринимают сигнал апоптоза и запускают программу клеточной гибели рецепторы фактора некроза опухоли (ФНО-R) и Fas-антигена (Fas/APO-1 или CD-95) (Зенков Н.. К., 1993; Parmer Р. М., 1993; Orrenius S.,1996). Чувствительность рецепторов может модулироваться при участии липидов плазматической мембраны (Белоконева О. С., 1993; Прока-зова Н. В. и др.,1998; Самуилов В. В., 2000; Gordon S. et al., 1995). В трансмембранной передаче проапоптозного сигнала могут участвовать липолити-ческие ферменты (фосфолипазы А, С, Д и сфингомиелиназы), способствующие образованию вторых посредников, регулирующих активность ферментов апоптоза - протеинкиназ, фосфатаз и протеаз (Попова Е. Н. и др., 2002; Rao D.M. et al., 1995; Lee S. В., Rhee S. G., 1995; Yoshinori N., 2002). В проведении сигнала, индуцируемого ФНО-а и Fas-лигандом в ядро, где и происходит активация летальных и/или репрессия антилетальных ге- нов, участвуют продукты гидролиза фосфолипидов (арахидоновая кислота, 1,2-диацилглицерол, церамид) (Ferris С. D., 1991; Vento R. et al, 2000). Критическим моментом в реализации программы апоптоза выступает активация эффекторных каспаз 3, 6, 7, 11, 14. Различают инициирующие каспазы 2, 8, 9, 10, 12, на стадии их активации апоптоз еще можно заблокировать (Самуилов В. Д. и др., 2000). Инициирующие каспазы активируют эф-фекторные. В частности, каспаза 8 активирует эффекторную каспазу 3: путем протеолиза из прокаспазы 3 образуется каспаза 3, после чего процесс апоптоза оказывается необратимым (Хансон К. П., 1997). На ранних стадиях про-граммируемой клеточной смерти катионы Zn2+ , необходимые для защиты нуклеиновых кислот от окисления и деградации, могут защитить клетки от действия каспазы—3, блокируя переход ее из прокаспазы-3 в активную форму фермента (Chai F., Truongran A. Q., 1999). Прокаспазы активируются в результате протеолитической модификации, путем отделения от них регуляторного N-концевого домена (продоме-на). Затем молекула разделяется на большую ( 20 кДа) и малую ( 10 кДа) субъединицы, которые и взаимодействуют друг с другом с образованием ге-теродимера и далее тетрамера, имеющего два каталитических участка (Parmer Р. М., 1993; Chang Н. Y„ Yang X., 2000). Мишенью эффекторных каспаз являются антиапоптозные ядерные белки семейства Вс1-2 (Новиков В. С, 1997; Цыпленкова В.. Г., 1996).
Развивающийся процесс приводит к гидролизу белков ламинов, арминирующих ядерную мембрану; регуляторных белков, включая белки pRb, р-21 и р-27, контролирующих клеточный цикл; гидролизу ингибиторов ДНКазы и Са ,. Mg - эндонуклеазы, ответственных за фрагментацию ДНК. Инактивируют-ся белки, участвующие в репарации и репликации ДНК, сплайсинге мРНК: топоизомеразы; ДНК-протеинкиназы; поли (АОР-рибозо)полимераза (ПАРП) — фермент, участвующий в «сшивании» разрывов в цепях. В тоже время, чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза (Меньшикова Е. Б., Зенков Н. К., 1999). Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. К цитоплазматическим белковым мишеням относят, участвующие в регуляции цитоскелета актин, фодрин, кератины, гельдозин. С протеолизом фодрина связывают изменения поверхности клетки - появление впячиваний и выступов. Мишенями являются регуляторные ферменты - фосфолипаза Аг, протеинкиназа С и некоторые другие. Регуляция активности каспаз в клетке осуществляется несколькими путями. Один из путей активации каспаз связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специальными рецепторами (например, активация каспазы 8 при взаимодействии Fas-лиганда с Fas-рецептором). Другой путь — активация каспазы 9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Всі 2. Третий путь - при помощи гранзимов В сериновой протеазы. Такой путь активации каспаз актуален в случае индукции апоптоза цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые и секретируют эти ферменты (Белушкина Н. Н., Северин С. Е., 2001). Но апоптоз это в первую очередь генетически детерминированный процесс. Разрушительное действие каспаз первого эшелона модифицируют белки генов семейства Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: Al, Bcl-W, Bcl-Xl) и белки генов Box (промоторы апоптоза: Bad, Bah, Вах, Mtd) (Cohen I. I., Duke R. C, 1998). Эти белки являются самым важным звеном в регуляции апоптоза. Они локализуются на митохондриальных мембранах, где контролируют процессы пролиферации и апоптоза путем регуляции проницаемости митохондриальных мембран и выхода цитохрома С в цитозоль. Такая регуляция осуществляется при помощи конкурентного связывания между собой проапоптозных и антиапоптозных белков генов семейства Всі с образованием гомо- и гетеродимеров за счет наличия гомологичных доменов в структурах вышеперечисленных протеинов. В зависимости от того, какие димеры обра зуются, клетка вступает либо в пролиферацию посредством взаимодействия димеров Bcl-2/Bcl-2, Bcl-2/Bcl-XL, Bcl-2/Raf с цитохромом С, либо в апоптоз при образовании димеров Вах/Вах, Bax/Bid, Bak/Bad (Белушкина Н. Н., Северин С. Е., 2001; Пальцев М. А. и др., 2000). К настоящему времени изучена модуляция белков семейства Вс1-2 различными механизмами.
Методы
В работе использованы среда PRMI 1640 («Sigma», США); перекись водорода (Н202) («Sigma», США), липополисахарид из Е. coli (ЛПС) («Sigma», США); 0,25 М сахароза; 96% этиловый спирт, трипановый синий («Sigma», США), краситель-фиксатор М.-Грюнвальда («Sigma», США), Гимза («Sigma», США), акридиновый оранжевый (АО) («Sigma», США), Hoechst 33258 («Serva», ФРГ); комплект «ДНК-сорб-В» для выделения ДНК (Россия); агароза («Sigma», США), буфер ТВЕ (1х), стандартный раствор ДНК фага X («Sigma», США); хлороформ, метанол, ледяная уксусная кислота, гептан, диэтиловый эфир, СаС12, силикагеле- вые пластинки («Sigma», США); аскорбат железа (II), содержащий 10"5 мкМ FeS04x7H20 и 2x10"4 М аскорбиновой кислоты; трихлоруксусная кислота (ТХУ); реагент Бредфорда; раствор фибриногена (1мг/мл); этилендиаминтетрацетат (ЭДТА); молибдат аммония; насыщенный КН2Р04; нитросиний тетразолий (НТС); феназинметасульфат (ФМС); NADH, Са -ионофор А23187, верапамил, LaCl3, A1F4 (50 мкМ А1С13 и 10 мМ NaF), ФМСФ , LiCl, хлорпромазин («Sigma», США). 2.2. Методы --«. 2.2.1. Объект исследования Работа проведена на культивируемых перитонеальных макрофагах крыс линии Wister весом 200-250 г. по методу описанному ранее (Conrad R. Е., 1981). 2.2.2. Получение перитонеальных макрофагов Резидентные ПМФ крыс линии Wister получали промыванием перито- г неальной полости животных охлажденной средой PRMI 1640, с добавлением 15% телячьей сыворотки, 5 ед/мл гепарина, 1000 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Эритроциты удаляли осмотическим шоком с последующим промыванием в среде PRMI 1640 при центрифугировании (1000 об/мин) в течении 10 минут. Клетки культивировали в течение 2 часов, в монослое на предметных стеклах влажных камер и в эппендорфовых пробирках, при температуре 37С, затем среду заменяли на свежую, не содержащую гепарина. Получен-ные таким образом клетки на 95% состояли из макрофагов. Рабочая концентрация суспензии составляла 106 кл/мл. Жизнеспособность клеток проверяли в тесте с трипановым синим. Эксперименты проводили при комнатной температуре (20 — 22 С) на 1-е сутки культивирования макрофагов. 2.2.2.1 .
Постановка эксперимента В культуральную среду добавляли Нг02 (1 мМ, 10 мМ), ЛПС Е. coli (100 нг/мл, 1 мкг/мл), модификаторы Са -проницаемости: Са -ионофор Агзі87 в концентрациях 0,1 и 1 мкМ; Са -блокаторы: верапамил в концентра-ции 0,05 мг/мл и LaCb в концентрации 0,5 мМ; Са -хелатор - ЭДТА в концентрации 2 мМ; антиоксиданты карнозин (5мМ), маннитол (5мМ); проокси-дант аскорбат железа (II), для индукции ПОЛ; активатор G-белков AIF4 (50 мкМ А1С13 и 10 мМ NaF), ингибитор сериновых протеаз и ФИ-специфичной фосфолипазы С ФМСФ (1мМ); ингибитор инозитолмонофосфатазы LiCl У (ІмМ), ингибитор протеинкиназы С и фосфолипазы Аг хлорпромазин (10 мкМ). Инкубировали в термостате при температуре 37С в течении 3-х часов. Затем монослои клеток фиксировали и окрашивали для флуоресцентной и световой микроскопии. Суспензию клеток использовали для экстракции ли-пидов, определения диеновых, триеновых коньюгатов и малонового диальде-гида в ПМФ и их ядрах, фракционирования липидов в тонких слоях силика-геля, определения активности СОД и каталазы в ПМФ и их ядрах, для выделения ДНК из макрофагов и проведение электрофореза в агарозном геле. 2.2.3. Выделение ядер ПМФ 10 мл суспензии клеток (10 клеток/мл) центрифугировали при 600 g в течение 10 минут (6000 g-мин), надосадочную жидкость (супернатант) сливали; осадок содержащий ядра, неразрушенные клетки и эритроциты, дважды промывали, суспендируя каждый раз в 2,5 мл 0,25 М сахарозы и центрифугируя (6000 g-мин). Смывы объединяли. Промытый осадок суспендировали в сахарозе (конечным объемом 2,5 мл) и обозначали как ядерную фракцию (разведение в 2,5 раза в расчете на исходную фракцию). , 2.2.4. Определение жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеток определяли по величине проникновения внутрь клеток красителя трипанового синего. К 0,1 мл суспензии макрофагов (106 кл/мл) прибавляли 1 каплю 0,1% трипанового синего. После 5 мин производили подсчет мертвых клеток. Норма 95-98% живых (не окрашивающихся) клеток. } 2.2.5. Экстракция липидов из ПМФ и их ядер Экстракцию липидов проводили по методу Кейтса М. (1975). 1 мл (106 кл/мл) суспензии макрофагов (ядер) центрифугировали (1000 об/мин) в течении 10 минут, супернатант сливали. Полученный осадок мак-рофагальных клеток (ядер) ресуспензировали в стеклянных центрифужных пробирках, содержащих не менее 20 объемов смеси хлороформ/метанол (2:1 по объему) и выдерживали на холоде в течение 1 часа. Затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Для удаления водорастворимых примесей к экстракту добавляли раствор 0,05 М СаС12 из расчета 1:5 по объему и тщательно перемешивали. Для разделения на 2 фазы эмульсию оставляли на ночь на холоде. Из нижней хлороформной фазы получали препарат суммарных липидов. 2.2.6. Определение диеновых, триеновых коньюгатов и малонового ди- альдегида в ПМФ и их ядрах Полученные суммарные липиды упаривали в токе азота, сухой остаток растворяли в 2 мл метанола и регистрировали спектр поглощения при длинах волн 215 нм, 233 нм, 275 нм на спектрофотометре СФ-2000 (Россия). Содержание диеновых конъюгатов, определяемое как индекс окислен-ности, рассчитывали по формуле: С=А2зз/А2і5 где, А2зз - оптическая плотность пробы при длине волны 233 нм; А215 - оптическая плотность пробы при длине волны 215нм. Содержание триеновых конъюгатов рассчитывали по формуле: С=А275/А215 где, А275 - оптическая плотность пробы при длине волны 275 нм.
О накоплении судили по образованию окрашенного комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой (Владимиров Ю. А., Арчаков А. И., 1972), регистрируемого на спектрофотометре СФ-2000 (Россия). К 200 мкл суспензии ПМФ (ядер) приливали 50 мкл индуктора окисления - аскорбата железа (II), содержащего 10 5 М FeS04 х7Н20 и 2x10"4 М аскорбиновой кислоты. Через 30 минут отбирали пробу объемом 200 мкл и вносили в пробирку с 1,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 30 мкл 0,1 М раствора этилендиаминтетрацетата (ЭДТА). Затем в пробирку добавляли 1,5 мл 0,5% раствора ТБК. Пробы инкубировали 30 минут при температуре 80С и измеряли поглощение растворов при длине волны 532нм на спектрофотометре СФ-2000. Параллельно ставили контрольную пробу, не содержащую аскорбат железа (II). Концентрацию МДА рассчитывали по формуле: С = А.(Ех-1), Где, С - концентрация, моль/л; А - оптическая плотность пробы; Ех,- коэффициент молярного поглощения, моль/см; 1— толщина кюветы, см. 2.2.7 Фракционирование липидов в тонких слоях силикагеля и их количественное определение Образцы суммарных препаратов липидов макрофагов и их ядер растворенные в смеси хлороформ-метанол (2:1 по объему), наносили с помощью микрошприца на расстояние 1-1,5 см от краев пластины. При аналитическом разделение нагрузка липидов составляет 60-100 мкг на одну точку. С помощью одномерной хроматографии фосфолипиды разделяли на фракции (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидилхолин, сфингомиелин) с помощью системы хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота / вода (60:50:1:4 по объему). Картина размещения пятен фосфолипидов представлена в таблице 1. Таблица 1 Схема размещения пятен фосфолипидов _ __ _ _ __ _ _ _ 1 - старт, 2 - лизофосфатидилхолин, 3 — сфингомиелин, 4 - фосфатидилхолин, 5 - фосфатидипсерин 6 - фосфатидидилинозит, 7 - фосфатидилэтанола-мин, 8 - нейтральные липиды, мигрируют вместе с фронтом растворителя (Хиггинс Дж. А., 1990). Для хроматографического разделения нейтральных липидов макрофагов и их ядер, использовали систему гептан / эфир / уксусная кислота (60:40:2 по объему). В этих условиях фосфолипиды остаются на старте, тогда как нейтральные липиды хорошо разделяются на три-, ди-, моноацилглицеролы,. холестерол и его эфиры, свободные жирные кислоты. Картина размещения пятен нейтральных липидов представлена в таблице 2. Таблица 2 Схема размещения пятен нейтральных липидов _ _ _ _ _ _ __ 1 - старт, 2 - монооцилглицерол, 3 — холестерол, 4 - диацилглицерол, 5 - свободные жирные кислоты, 6 - триоцилглицерол, 7 - эфиры холестерина (ОсборнН.Н., 1978).
Выделение и электрофорез ДНК макрофагов в агарозномеле
Выделение и электрофоретический анализ ДНК проводили по стандартной методике (Kaufmann S. Н. et. al., 2000). ДНК макрофагов выделяли с помощью комплекта «ДНК-сорб-В» фирмы «Sigma» (США). Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 прогревали при 65С до полного растворения кристаллов. В пробирки с лизирующим раствором вносили по 100 мкл суспензии макрофагов (3 хЮ6 кл/мл). Пробы тщательно перемешивали на вортексе, прогревали 5 мин, при 65С и центрифугировали 5 с при 5 000 об/мин на микроцентрифуге. По 100 мкл надосадочной жидкости, переносили в новые пробирки, для выделения ДНК. В каждую пробирку добавляли по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешивали на вортексе два раза с интервалом в 2 минуты. Осаждали сорбент в пробирках центрифугированием при 5 000 об/мин в течение 30 с. Удаляли супернатант и добавляли в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Вновь осадили сорбент центрифугированием при 5 000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с и удалили супернатант. Отмыли сорбент два раза следующим образом. Добавили в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировали 30 с при 10 000 об/мин на микроцентрифуге. Удалили супернатант. Поместили пробирки в термостат (65С) на 5-Ю мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты. В пробирки добавили по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешали на вортексе.
Поместили в термостат (65С) на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. Процентрифугировали пробирки при 12 000 об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДІЖ. Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять молекулы ДНК по их размерам. Этот метод основан на сравнительном анализе исследуемого и стандартного препаратов ДНК на фотографии геля, окрашенного бромистым этидием, являющимся интеркалирующим красителем связывающимся с ДНК. Ультрафиолетовый свет, поглощенный бромистым этидием и ДНК (возбуждение передается на краситель), испускается затем в виде флюоресценции в области видимого света при 590 нм. Размер фрагментов ДНК определяли путем сравнения их подвижности с маркером (рестрикционные фрагменты фага X). Количественное определение ДНК в агарозном геле проводили путем сравнения яркости полос анализируемых фрагментов и стандартного препарата ДНК. Минимальное количество ДНК, которое можно увидеть при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием, - 2 нг при ширине полосы 0,5 см (обычная ширина лунки), оптимальное количество - 40-60 нг. 2.3.1. Приготовление агарозного геля Все растворы для электрофореза готовятся заранее. Для приготовления 1,5% агарозного геля, мы добавляли 1,5 г агарозы к 100 мл буфера ТВЕ (1х). Нагревали смесь в. кипящей водяной бане до полного растворения агарозы. Охлаждали раствор агарозы до 5 0-5 5 С и добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Заливали раствор в специальную электрофоретическую кювету и немедленно вставляли на расстоянии примерно 1 см от одного из концов кюветы гребенку для формирования лунок. Высота гребенки подбирается таким образом, чтобы между ее зубьями и дном кюветы оставался зазор.в 0,5-1,0 мм.
Оставляли камеру в строго горизонтальном положении до полного застывания геля при комнатной температуре (от 30 до 40 мин). Затем, аккуратно вынимали гребенку и помещали кювету с гелем в электрофоретическую камеру. Заполняли камеру 500 мл электрофоретического буфера ТВЕ (1х), чтобы он покрыл гель слоем толщиной 1-3 мм. 2.3.2. Определение концентрации ДНК Готовили пробы анализируемой ДНК. Для этого к 10 мкл раствора выделенной ДНК добавляли 2 мкл 6-ти кратного утяжеляющего раствора для нанесения проб на гель. Готовили три разведения стандартного раствора ДНК фага X (25 мкг/мл) с содержанием ДНК 25, 50 и 100 нг. Для этого к 1, 2 и 4 мкл стандартного раствора ДНК добавляли 9, 8 и 6 мкл Н20, соответственно, и по 2 мкл раствора для нанесения проб на гель. Наносили пробы в лунки геля с помощью автоматической пипетки. Проводили электрофорез при 5-ЮВ/см до тех пор, пока краситель не продвинется на 4-5 см. Фотографировали гель в коротковолновом УФ-свете. Определяли концентрацию ДНК в анализируемом препарате путем визуального сравнения интенсивности полос выделенной и стандартной ДНК. 2.3.3. Световая и флуоресцентная микроскопия ПМФ Апоптотически измененные клетки выявляли методами флуоресцентной (микроскоп «Люмам-ИЗ», длина волны возбуждающего света 320-390 нм, барьерный фильтр 420-450 нм) и световой микроскопии (микроскоп «Биолам Р-11»), используя акридиновый оранжевый (АО), Hoechst 33258, краситель-фиксатор М.-Грюнвальда и Гимза. Увеличение х 900 (окуляр 15 х, объектив 60х). Апоптотический индекс (АИ) рассчитывался как соотношение числа клеток в состоянии апоптоза к 100 клеткам (в %). 2.3.4.
Окрашивание по Паппенгейму-Крюкову Принцип. Комбинированная окраска красителем-фиксатором М.-Грюнвальда и краской Гимза, позволяющая дифференцировать составные части клеток. Методика. На нефиксированный мазок наливали пипеткой 10-15 капель готового красителя-фиксатора М.-Грюнвальда через 3 мин прибавляли по каплям столько же дистиллированной воды и продолжали окрашивание еще 1 мин, после чего краситель смывали дистиллированной водой и мазок высушивали на воздухе. Затем на высушенный мазок наносили свежеприготовленный водный раствор красителя Романовского на 8-15 мин в зависимости от температуры помещения, смывали водой, затем сушили на воздухе (Фрейфельд Е. И.., 1947; Досон Р. и др., 1991). 2.3.5. Окрашивание акридиновым оранжевым Высушенный мазок фиксировали в течение 20 минут в смеси 96% этилового спирта и ацетона (1: 1), затем в течение 15 мин - 96 % этиловым спиртом, 10 мин - 60 % этиловым спиртом, 5 мин. - 30 % этиловым спиртом. Далее мазок промывали дистиллированной водой и помещали в цитратно-фосфатный буфер рН 4,2 на 4-5 мин. Обработанный таким образом мазок окрашивали акридиновым оранжевым в концентрации 2: 25000 в течение 10 мин. В каждом мазке оценивали соотношение интенсивности свечения в красный (640 нм) и зеленой (530 нм) полосах спектра. Анализировали не менее 100 клеток на экспериментальную точку (Карнаухов В. Н., 1978; Завго-родняя Е. Т. и др., 1993). 2.3.6. Окрашивание Hoechst 33258 В окрашивании использовали рабочий раствор Hoechst 33258, приготовленный разведением в 20 раз цитрат — фосфатным буфером, рН 5,2-5,4. Высушенные на воздухе мазки фиксировали в этаноле 96 % 20 мин. Затем мазки выдерживали 15 мин в этаноле 60% , 10 мин в этаноле 30% , 5 мин в этаноле 15%. После чего промывали мазки дистиллированной водой. Промытые мазки выдерживали 5 мин в цитрат-фосфатном буфере. Затем окрашивали рабочим раствором Hoechst 33258 10-15 мин, после чего промывали тем же буфером. Анализировали не менее 100 клеток на экспериментальную точку (Карнаухов В. Н., 1978; Завгородняя Е. Т. и др., 1993). 2.3.7. Статистическая обработка результатов Полученные данные статистически обрабатывали методом вариационной статистики с использование критерия t Стьюдента. Достоверность различия определяли в каждой серии по отношению к исходному значению Р.
Изменение окисленности липидов при Н2О2 и ЛПС Е..coli — индуцируемой гибели ПМФ
Один из основных механизмов в реализации провоспалительной и ци-тотоксической активности макрофагов выступают свободнорадикальные процессы, включающие гиперпродукцию АФК. В то же время при окислительном стрессе создаются условия для интенсификации процессов перекис-ного окисления липидов биомембран и модификации липидного компонента ядра клетки. В этой связи нами определялись продукты ПОЛ, как в самих макрофагах, так и в их изолированных ядрах. Показано, что перекись водорода и ЛПС из Е. coli стимулируют образование первичных и вторичных продуктов пероксидации липидов как в пе-ритонеальных макрофагах, так и их ядрах в токсичных для клетки количествах, увеличивая тем самым вероятность гибели клеток путем апоптоза (Н2О2 1 мМ, ЛПС Е. coli 1 мкг/мл) и некроза (Н202 10 мМ, ЛПС) (табл. 3). i» . Под действием перекиси водорода (1 мМ) в перитонеальных макрофагах возрастает содержание диеновых и триеновых коньюгатов, соответственно на 10 и 62 %. В этих условиях отмечается увеличение содержания малонового диальдегида (МДА) на 35 % по сравнению с контролем. При инкубации клеток с Н2Ог (10 мМ) содержание диеновых коньюгатов увеличилось на 48 %, триеновых коньюгатов на 131 %, МДА на 205 % (табл. 3; рис. 14). В ядрах перитонеальных макрофагов содержание диеновых коньюгатов при действии Н202 (1 мМ) увеличилось на 21 %, содержание триеновых коньюгатов на 30 %, МДА увеличилось на 6 %.
Липиды ядра окисляются в меньшей мере, чем липиды цельных клеток. По-видимому, это связано с тем, что в ядре система антиоксидантной защиты функционирует на более высоком уровне активности, так как направлена на эффективную защиту ДНК от свободнорадикальной модификации. Перекись в концентрации 10 мМ приводила к дальнейшему увеличенному выходу продуктов ПОЛ в ядрах: содержание диеновых коньюгатов возрастало на 57 %, триеновых коньюгатов на 100 %, доля МДА увеличилась на 89 % относительно контроля (табл. 3; рис. 14). Инкубация перитонеальных макрофагов в присутствии Fe способствовала увеличению содержания диеновых и триеновых коньюгатов соответственно на 18 и 87 %, МДА на 150 % по отношению к контролю. При совме-стном действии Н2О2 (1 и 10 мМ) и Fe уровень диеновых коньюгатов соответственно возрастал на 35 и 75 %, триеновых коньюгатов на 87 и 150 %, МДА на 139 и 249 % относительно контроля (табл. 4; рис. 15). Ионы Fe и Н2Ог (1 и 10 мМ) способствовали накоплению продуктов перекисного окисления липидов (МДА, ДК, ТК) в ядрах резидентных перитонеальных макрофагов (табл. 4; рис. 15). В этих условиях возросло содержание диеновых коньюгатов на 39 %, триеновых коньюгатов на 30 %, МДА на 18 % по отно-шению к контролю. При совместном действии Н2О2 (1 и 10 мМ) и Fe , выход диеновых коньюгатов соответственно возрастал на 69 и 114 %, триеновых коньюгатов на 60 и 170 %, МДА на 41 и 202 % относительно контроля (табл. 4; рис. 15). В присутствии Fe -аскорбата концентрация МДА по сравнению с контролем возрастает особенно заметно. Это связано с тем, что ионы Fe взаимодействуя с гидроперекисями, инициируют появление новых цепей окисления. Однако даже при инициации процессов пероксидации липидов Fe2+липиды ядра окисляются в меньшей мере, чем это происходит в целом в макрофагах. Отметим, что Н2О2 увеличивает прооксидантное действие Fe-аскорбата.
Причем, наиболее значительная активизация процессов перекисного окисления липидов происходила при использовании перекиси водорода в более высокой концентрации. В то же время известно, что функциональная активность клетки изменяется при действии интермедиатов и продуктов ПОЛ, способствующих повреждению биомолекул и инициирующих гибель клетки., ЛПС E.coli (1мкг/мл) увеличивает окисленность липидов перитонеальных макрофагов и их ядер, хотя и в гораздо меньшей мере, чем перекись водорода. Таким образом, нами показано, что при действии Н202, Fe и ЛПС Е. coll в перитонеальных макрофагов усиливаются процессы перекисного окисления липидов. При этом отмечается накопление как начальных продуктов ПОЛ - диеновых и триеновых коньюгатов, так и вторичных ТБК-активных продуктов. В свою очередь интенсификация процессов пероксидации липидов и окислительная модификация липидов могут способствовать изменению качественного и количественного состава липидов, и в конечном итоге приводить клетку к гибели. Механизмы реализации отмеченного эффекта различны. Перекись водорода в отличии от ЛПС легко проникает в клетку, в том числе и в ее ядро, подвергая непосредственно окислительной активации или инактивации факторов транскрипции (Зенков Н. К. и др., 2001; Kronke М. et. al., 1990). Липополисахарид не имеет такой возможности, и реализует свою активность посредством трансдукции сигнала через CD 14 рецептор, то есть действует рецепторопосредованным образом (Park С. Т., Wright S. D., 2000; Verbon A. et al., 2001; Hennekke P., Golenbock D.T., 2001). 3.4. Влияние H2O2 и ЛПС E. coli на активность некоторых антиоксидантах ферментов При активизации свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов жизнеспособность клеток может поддерживаться при условии их достаточной обеспеченности антиоксидантами. Макрофаги функционируют в очаге воспаления, где в больших количествах образуются свободные радикалы, оказывающие на биомолекулы повреждающее действие. Поэтому для макрофагов обеспеченность антиоксидантами представляет актуальную задачу. В то же время, мощный радикальный пресс очага воспаления неизбежно должен приводить к окислительной модификации липидов, белков, ДНК и, как следствие, к функциональным нарушениям макрофагов и необходимости элиминирования поврежденных клеток. Нами изучено влияние перекиси водорода и ЛПС Е. coli на активность ключевых антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) и ка-талазы (КТ), участвующих в утилизации активных форм кислорода на первых этапах их образования. Активность СОД в ПМФ составила 2,85+0,3 усл. ед/мг белка, а КТ — 23,38+1,4 мкат/г белка. В ядрах ПМФ активность СОД составила 3,03+0,4 усл. ед/мг белка, в то время как каталазная активность - 60,4+4,1 мкат/г белка. ядрах ПМФ под влиянием ІмМ Н2О2 активность КТ уменьшается на 50 %, а активность СОД увеличивается на 65 % относительно контроля. При действии 10 мМ Н2О2, активность каталазы также уменьшается на 64 %, а активность СОД увеличивается на 28 % по сравнению с контролем (табл. 5; рис. 17, 18). Таким образом, под влиянием перекиси водорода в макрофагах отмечается увеличение активности каталазы и уменьшение активности супероксид-дисмутазы в среднем примерно на 50 %. В тоже время в изолированных ядрах макрофагов наблюдалась обратная динамика: активность каталазы уменьшалась, а активность супероксиддисмутазы, напротив, имела тенденцию к росту в среднем на 55 %.
Изучив влияние Fe2+ и Н2О2 (1 и 10 мМ) in vitro на активность антиок-сидантных ферментов (СОД, КТ) в перитонеальных макрофагах, мы получили следующие результаты. При стимуляции ионами Fe перекисного окисления липидов в макрофагах активность СОД понижалась на 23 %, а активность каталазы возрастала на 30 % относительно контроля (табл. 5; рис 17,18). При совместном действии Н2Ог (1 мМ) и Fe , в условиях, когда в реакции Фентона образуется гидроксильный радикал, и прооксидантная активность индукторов резко возрастала, активность СОД в макрофагах понижалась на 56 %, в то время как активность КТ возрастала незначительно. При увеличении концентрации перекиси водорода до 10 мМ активность СОД понижалась на 63 %, а каталазы возрастала на 28 % по сравнению с контролем (табл. 5; рис 17, 18). В ядрах перитонеальных макрофагов при Fe -индуцированном пере-кисном окислении липидов активность СОД возросла на 40 %, а каталазная активность понизилась на 58 % по сравнению с контролем (табл. 5; рис 17, 18). Отметим, что под влиянием ионов Fe активность антиоксидантных ферментов макрофагов и их ядер изменяется по-разному в зависимости от места локализации фермента и его изоформы. При совместном действии Н2О2 (1 и 10 мМ) и Fe на макрофаги в ядрах клеток активность СОД повысилась незначительно, а активность КТ снизилась в среднем на 72 % по сравнению с контролем. Таким образом, под влиянием перекиси водорода активность СОД в макрофагах понижается, но в изолированных ядрах отмечается повышение активности этого фермента.
