Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Запрограммированная смерть клетки, или апоптоз, и некроз — «сверхчувствительность» 8
1.1.1. Отличия апоптоза от некроза 12
1.1.2. Механизмы апоптоза и сверхчувствительности у растений 21
1.2. Активные формы кислорода и их значение для клеток в норме и патологии 24
1.2.1. Антиоксидантная система в борьбе с активными формами кислорода 29
1.3. Защита растений от вредителей и болезней 44
1.3.1. Роль биотехнологии в защите растений 45
1.3.2. Индуцирование иммунитета у растений 47
1.3.3. Иммунизация биологически активными препаратами 49
1.3.3.1. Роль макроэлемента магния в метаболизме растений 50
1.3.3.2. Гриб Trichoderma и его роль как антагониста патогенным организмам 52
1.4. Механизм устойчивости гороха к возбудителю корневых гнилей и разработка средств защиты от патогена Fusarium oxysporum 58
2. Объекты и методы исследования 65
3. Экспериментальная часть 74
3.1. Выделение из колеоптилей пшеницы индуктора апоптоза и изучение его влияния на фрагментацию ДНК здоровых и инфицированных Fusarium oxysporum проростков гороха 74
3.2. Влияние индуктора апоптоза и Fusarium oxysporum на антиоксидантную систему гороха 102
3.2.1. Влияние ионов Mg на активность компонентов антиоксидантной системы здоровых и индуцированных фактором апоптоза проростков гороха 102
3.2.2. Влияние Mg на активность компонентов антиоксидантной системы здоровых и инфицированных Fusarium oxysporum проростков гороха 109
3.2.3. Влияние активного вещества Trichoderma на активность компонентов антиоксидантной системы здоровых и индуцированных фактором апоптоза проростков гороха 112
3.2.4. Влияние активного вещества Trichoderma на активность компонентов антиоксидантной системы здоровых и инфицированных Fusarium oxysporum проростков гороха 117
3.3. Влияние возбудителя корневых гнилей на рост и развитие проростков гороха 120
4. Влияние ионов магния на хозяйственно-ценные признаки гороха 140
4.1. Влияние ионов магния на хозяйственно-ценные признаки гороха на здоровом фоне 140
4.2. Влияние ионов магния на хозяйственно-ценные признаки гороха на инфекционном фоне 147
Заключение 156
Выводы 159
Список литературных источников 161
Приложения 183
- Активные формы кислорода и их значение для клеток в норме и патологии
- Механизм устойчивости гороха к возбудителю корневых гнилей и разработка средств защиты от патогена Fusarium oxysporum
- Влияние ионов Mg на активность компонентов антиоксидантной системы здоровых и индуцированных фактором апоптоза проростков гороха
- Влияние ионов магния на хозяйственно-ценные признаки гороха на инфекционном фоне
Активные формы кислорода и их значение для клеток в норме и патологии
Согласно одной из гипотез, важнейшей причиной старения или запрограммированной гибели клеток (ЗГК) является накопление поперечных связей в жизненно важных полимерах клеток: в ДНК, белках, нуклеопротеидах (Bjorksten J., 1974). Под влиянием агентов типа свободных радикалов образуются поперечные сшивки в молекулах ДНК и белков, что изменяет и затрудняет их функционирование. Накопление этих отклонений способствует процессам старения. Действительно, белки старых организмов более стабильны в условиях повышенной температуры, что может быть связано с большим количеством в них поперечных сшивок. Образовавшиеся поперечные сшивки могут стать причиной соматических мутаций и нарушать репликацию ДНК. Ошибки в работе генного аппарата, способствующие старению, возможны также при химической модификации ДНК ферментами-ДНКазами, в результате чего по месту повреждения образуется жесткая ковалентная связь ДНК с РНК, гистонами и негистоновыми белками. Это увеличивает долю неактивного хроматина в ядре. Экспериментально доказано, что в старых клетках ДНК прочнее связана с гистонами (Лэмб М., 1980).
Старение разных органов у растений обычно сопровождается запрограммированной гибелью клеток (ЗГК). ЗГК у растений, как и у животных является обязательным процессом на разных этапах онтогенеза и без нее невозможно нормальное развитие растений (Ванюшин Б.Ф. 2001; Александрушкина и др., 2008; Vanyshin B.F. et all., 2004). Одно из ключевых событий генетически детерминированной программы гибели клеток -деградация клеточного ядра является одним из главных биохимических маркеров апоптоза и ЗГК в целом. Фрагментация ДНК у растений в ходе ЗГК наблюдается при старении колеоптилей и листьев злаков (Кирнов М.Д. и др., 1997), гороха (Orzaen D., Granell А., 1997), она выявляется при развитии и прорастаниии семян злаков (Fath A. et all. 2000) , в ходе гаметогенеза пшеницы (Marchetti S. et all., 2001), при гиперчувствительном ответе у табака (MittlerR., 1999).
Существующие предположения о пусковых механизмах старения и ЗГК можно разделить на две группы. В одних гипотезах старение рассматривается как результат накопления случайных повреждений в клетках и системах органов (Лэмб М., 1980), другие связывают старение с генетически обусловленной программой (Анисимов В.Н., 2000; Гунин А.Г., 2001).
К гипотезам об индукции старения случайными изменениями в макромолекулах относятся гипотезы о роли активных форм кислорода, или свободных радикалов, мутаций и др. Свободные радикалы, или активные формы кислорода (АФК) (англ. Reactive oxygen species, ROS) -высокореакционноспособные нестойкие молекулы промежуточных продуктов обмена, имеющие неспаренный электрон на внешнем энергетическом уровне. АФК постоянно образуются в живой клетке как продукты нормального метаболизма кислорода. Активные формы кислорода образуются также под действием ионизирующего излучения. Некоторые АФК могут играть роль медиаторов важных внутриклеточных сигнальных путей. Однако, повышенная продукция АФК приводит к оксидативному стрессу. Нормальные функции АФК включают индукцию иммунной системы и мобилизацию систем ионного транспорта. Например, клетки крови на месте повреждения начинают продуцировать АФК, что рекрутирует тромбоциты, необходимые для начала процесса заживления раны. АФК также запускают программируемую клеточную смерть (апоптоз).
Они образуются как в нормальных метаболических реакциях, так и спонтанно при действии различных стрессоров, при окислительном стрессе и разнообразных патологиях (Обухова Л.К., Эмануэль Н.М., 1984; Обухова Л.К., 1986; Beckman К. В., Ames В. N. 1998). К ним относятся радикалы НО", НОО (пероксид), 02 (супероксид), NO" и др. Это, как правило, небольшие молекулы с исключительной реактивностью благодаря наличию неспаренного электрона на внешней электронном уровне. Свободные радикалы повреждают молекулы ДНК, белков, липидов, образуя перекисные соединения. Радикал НО может присоединяться, например, по двойной связи между 5- и 6-м положениями в молекуле тимидина и тем самым нарушать структуру ДНК. Радикалы вызывают значительные повреждения мембран: плазматической, мембран органоидов (митохондрий, хлоропластов, вакуолей, лизосом и др.)? образуя пероксиды липидов, которые изменяют проницаемость мембран, их жесткость. Вследствие этого происходят нарушения транспортных процессов на мембранах, компартментации продуктов обмена веществ, выход из органоидов гидролитических ферментов в цитоплазму, что в свою очередь вызывает нарушения обмена веществ. Очень опасно для клетки нарушение целостности мембран лизосом. При старении увеличиваются повреждения, вызванные избыточным образованием свободных радикалов.
В организме человека и животных первичным АФК служит супероксид, возникающий при одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода. Супероксид превращается в Н2О2 под действием супероксиддисмутазы, а Н202 неферментативно дает ОН в присутствии ионов Fe2+ или СіГ+. ОН - сильнейший окислитель (редокс-потенциал около +1,35 В), способный разрушить практически любое органическое вещество биологического происхождения. (Sen С.К. 2003; Krotz F., Sohn HY., Gloe Т., Zahler S., Riexinger Т., Schiele T.M., Becker B.F., Theisen K., Klauss V., Pohl U 2002; Pignatelli P., Pulcinelli F.M., Lenti L., Gazzaniga P.P., Violi F.,1998; Guzik T.J., Korbut R., Adamek-Guzik Т., 2003).
Механизм устойчивости гороха к возбудителю корневых гнилей и разработка средств защиты от патогена Fusarium oxysporum
Устойчивость растений к патогенным грибам определяется следующими факторами: гидролазами растений, разрушающими клеточные стенки грибов, фитоалексинами - специфическими антибиотическими веществами, ферментами биосинтеза лигнина, укрепляющими клеточную стенку, оксидазами, ингибиторами протеиназ и другими белками (Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В., 1976; Павловская Н.Е., Шалимова О.А., Андрюхина P.M., Азарова Е.Ф., 1997; Cavalieri A., Czapla Т., Howard J., 1995; Cruickshank J.A.M., Perrin D.R.,1965; Shalimova O.A., Pavlovskay N.E., 1998; Алексидзе Г.Я., Выскребенцева Э.И., 1986; Лахтин B.M., 1986; Голышкин Л.В., Павловская Н.Е., Азарова Е.Ф., Зубарева К.Ю., Жук Г.П., 2006).
Для создания устойчивых форм растений методы генной инженерии являются дорогостоящими и не везде могут быть использованы. В связи с этим нетрадиционная селекция может вестись и другим путем, а именно с помощью подбора для скрещивания тех форм растений, в которых биосинтез выше перечисленных компонентов обмена веществ наиболее интенсивен, или путем регуляции и активации соответствующих генов (мутагенез, фитогормоны, минеральное питание и пр.). Следует отметить, что механизмы устойчивости растений к биотическим факторам среды, как правило, неспецифичны и не зависят от природы гриба-паразита. Специфика заключается лишь в кол-личественных проявлениях, что может служить маркерным признаком на устойчивость (Павловская Н.Е., Шалимова О.А., Азарова Е.Ф., Андрюхина P.M., 2002).
Весь защитный механизм растения условно можно разделить на три группы факторов: конституционные, присущие здоровым растениям, активный индуцированный иммунитет, проявляющийся под влиянием элиситоров (индукторов), и приобретенная устойчивость, создаваемая искусственно. К числу факторов конституционной устойчивости растений относятся лектины - гликопротеидные рецепторы, обеспечивающие специфическое узнавание патогена и передающие первичный сигнал в клетку, что определяет дальнейшее взаимоотношение между растением и микроорганизмом (Алексидзе Г.Я. и др., 1986). Ряд исследователей относят к этой системе защиты лигнины, присутствующие в клеточной стенке растения. Их относят к специфическим растительным полимерам опорных тканей вторичных клеток растений. Содержание лигнина зависит от поражаемости растения-хозяина грибом-паразитом. Комплексно устойчивые сорта гороха характеризуются более высоким содержанием лигнина в клетках здоровых и инфицированных тканей, что позволяет использовать данный физиологический параметр в качестве теста на устойчивость к патогенным грибам, вне зависимости от их специфичности (Голышкин Л.В. и др., 2006, Павловская Н.Е. и др., 2002). Способность клетки синтезировать дополнительное количество лигнина в патогенезе позволило некоторым исследователям отнести лигнин к системе активной защиты, что указывает на условность деления клеточных реакций на коституционные и индуцированные.
Такие реакции растений как образование фенолов, фитоалексинов, лигнинов, каллозы, а также наличие гидролитических и окислительных ферментов, свободные радикалы, ингибиторы протеиназ относят к факторам индуцированной устойчивости (Shalimova О.А. и др., 1998; Лахтин В.М., 1986). Но эти же факторы часто играют роль в защите от стрессов вообще и являются скорее следствием, чем причиной специфического узнавания. Строго говоря, только фитоалексины являются молекулами активного иммунитета, поскольку они отсутствуют в здоровых тканях растения.
Изучение механизмов устойчивости гороха на разных этапах патогенеза и анализ различий между поражаемыми и толерантными сортами гороха позволит создать экспресс-методы быстрой оценки устойчивости форм растений, что позволит существенно снизить материальные, земельные и временные затраты на скрининг сортообразцов на устойчивость к грибам.
Фенольные соединения в растениях являются одними из наиболее распространенных представителей вторичного метаболизма. Во многих случаях именно они защищают растения от действия патогенных микроорганизмов (Запрометов М.Н., 1974, 1993) и обуславливают устойчивость к действию биотических и абиотических факторов. Фенольным соединениям отводится и роль сигнальных молекул при формировании бобово-ризобиального симбиоза и арбускулярно-везикулярных микориз.
По данным Павловской Н.Е., Зубаревой К.Ю., Азаровой Е.Ф. (2009), высокое содержание фенолов в створках бобов и в семенной кожуре в фазу начала налива семян, по-видимому, связано со степенью устойчивости-восприимчивости гороха к Brnchiis pisorum L.
В настоящее время трудно назвать какую-либо другую реакцию растений на инфекцию, с которой бы лучше коррелировала их устойчивость к болезням, чем образование фитоалексинов — соединений фенольной природы. Фитоалексины обладают широким спектром действия — они подавляют рост самых разнообразных грибов. Тем не менее они сильнее подавляют неспециализированные к данному виду паразитарные грибы, чем специализированные. Величина ЭД 50 (концентрация пизатина, необходимая для того, чтобы подавлять рост 50% спор) у устойчивого сорта гороха должна превышать 100 мкг/мл. Наибольшая концентрация пизатина в инфекционной капле накапливается спустя 24 часа инкубирования и превышает в 1,5-2 раза значение ЭД 50 для неспецифических грибов (Павловская Н.Е. и др., 2002).
Большое внимание исследователей привлекают ингибиторы ферментов в качестве: природных составляющих защитных систем растений (Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., 2000; Конарев А.В., 2002; Москвич И.А., 2003; Павловская Н.Е., Гагарина И.Н., Мирошникова М.И., 2008), и перспективных объектов для придания растениям устойчивости к вредным организмам путем трансгеноза (Ryan С.А., 1981), элементов сопряженной эволюции растений и фитофагов, антипитательных компонентов корма сельскохозяйственных животных (Ибрагимов Р.И., Хабибулин СИ., Марданшин И.С., 2004).
Генная инженерия широко применяет растительные ингибиторы протеиназ для получения устойчивых к насекомым трансгенных растений: вигна, батат, картофель, соя, рис (Дунаевский Я.Е. и др., 2000).
Влияние ионов Mg на активность компонентов антиоксидантной системы здоровых и индуцированных фактором апоптоза проростков гороха
Изучение активности супероксиддисмутазы в проростках восприимчивого сорта гороха Смарагд показало, что у здоровых проростков в процессе прорастания активность фермента повышается незначительно от величины плотности Е=150 у.е. у 2-дневных до 260 у.е. - у 10-дневных (рис. 34, а). Под влиянием обработки семян индуктором апоптоза, выделенном из колеоптилей пшеницы, активность СОД плавно снижается от 580 у.е.- у 2-дневных проростков до 200 у.е.- у 10-дневных.
Это может служить . одним из признаков апоптоза. Возможно, супероксиддисмутаза разрушается активирующимися в процессе характерного для апоптоза каспазного каскада сериновыми и цистеиновыми протеазами или действие супероксиддисмутазы блокируется специфичными высоко- или низкомолекулярными ингибиторами указанного фермента. Индуцированное снижение активности супероксиддисмутазы приводит к накоплению супероксидных радикалов, что способствует супероксидной деструкции компонентов клетки. Контролируемую внутриклеточными химическими механизмами супероксидную деструкцию компонентов клетки можно считать одной из «подпрограмм» апоптоза: известно, что при инкубации проростков пшеницы в присутствии экзогенных сильных гидрофобных перехватчиков супероксид-радикала в колеоптилях на фоне резко пониженного содержания супероксида (Шорнинг Б.Ю. и др., 2000) апоптозная фрагментация ДНК блокируется полностью.
Под влиянием ионов магния в обеих концентрациях 10" и 10" М после 5-го дня прорастания семян гороха происходит резкая активизация СОД- активности от 100 у.е. - у 2-дневных проростков до 1000-1300 у.е., xjTo способствует, видимо, снижению уровня свободных радикалов накапливающихся в результате запрограммированной смерти клеток (апоптоза) и фрагментации ДНК, что наблюдалось ранее. Эта тенденция сохраняется и у восприимчивой формы гороха 139-04 Эффект апоптоза выражается в плавном снижении активности СОД от 2-х до 10 дней прорастания с 700 у.е. до 100 у.е., а под влиянием ионов магния активность СОД повышается с 120 у.е. у 2-дневных до 600-650 у.е. - у Ю-дневных (рис. 34, б). У устойчивой формы гороха Т-206 активность СОД у индуцированных индуктором апоптоза проростков снижается примерно в таких же параметрах, как и у восприимчивых сортов - от 500 у.е.- у 2-дневных до 150 у.е.- у 10-дневных (рис.35, а). Ионы магния способствуют повышению активности СОД до 100-1100 у.е. от 2 до 10 дней прорастания индуцированных апоптозным фактором проростков. У сорта гороха Dun Dale тенденция сохраняется. При апоптозе активность СОД падает, что подтверждает этот факт как маркер программируемой смерти (рис. 35, б). Ионы магния оказывают реанимирующее действие и прерывают апоптоз. Следует отметить, что восприимчивые и устойчивые сорта гороха практически не отличаются реакцией СОД-активности на индуктор апоптоза. Активность пероксидазы в норме у восприимчивого сорта гороха Смарагд и формы 139-04 у 2-дневных проростков составляет 100 у.е. и возрастает до 170 у.е.- у 10-дневных (рис. 36, 37). При апоптозе активность пероксидазы имеет колебательный характер с пиком в 7-дневных проростках и снижением активности к 10-му дню. Величина активности у восприимчивых сортов составляет от 100 до 250 у.е.. Под влиянием ионов магния активность пероксидазы повышается от 2-х дней с 175 у.е - у Смарагда, а у 139-04 - от 248-250 у.е. до 280-300 у.е.у Смарагда и 320-350 у.е.-у 139-04. Активность пероксидазы в норме у устойчивой формы Т-260 составляет от 200 до 480 у.е. в течение 10 дней прорастания, у сорта Dun Dale от 200 до 580 у.е. (рис. 38, 39). Действие индукторов апоптоза на активность пероксидазы и у устойчивых и у восприимчивых приводит к снижению активности пероксидазы с обязательным подъемом в 7-дневных проростках. Однако величина активности пероксидазы у устойчивых сортов на протяжении всего периода измерений значительно выше, чем у восприимчивых. Пик активности в 7-дневных проростках равен 580 у.е. - у Т-206, а у Dun Dale - 746 у.е. Пероксидаза использует накопленные при работе СОД перекиси для окисления фенолов, способствует лигнификации клеточных стенок, тем самым приводит к образованию механического барьера на пути инфекции. Растительные пероксидазы инактивируют вирусные и грибные патогены и участвуют в генерации синглетного кислорода (Роговин и др. 1987). Под влиянием ионов магния активность пероксидазы у устойчивых сортов к 10-му дню прорастания составляет 1000-1200 у.е., что в 3-4 раза превышает активность пероксидазы у восприимчивых сорто гороха.
Влияние ионов магния на хозяйственно-ценные признаки гороха на инфекционном фоне
Применение Mg" способствует обеззараживанию семян, что в дальнейшем влияет на показатели лабораторной всхожести и энергии прорастания: обработка семян Mg во 2-й концентрации снизила зараженность семян гороха на 23,5 %, способствовала увеличению энергии прорастания на 1,7 % и лабораторной всхожести - на 4,2 % по сравнению с контролем.
Ростимулирующий эффек Mg" в наибольшей степени стал заметен в фазу плодообразования: высота растений увеличилась на 7,7-8,0 %, вес зеленой массы - на 1,1-2,3 % по сравнению с контролем. Развитие корневой гнили в варианте с применением Mg снизилось. Так, в фазу бутонизации обработка семян Mg + в первой и второй концентрациях привела к снижению развития болезни на 34,5 и 63,3 %, соответственно, по сравнению с контролем, что, однако, ниже показателей с применением химического и биоэталонов. В фазу плодообразования развитие болезни в вариантах с обработкой семян Mg" сократилось на 23-28 % по сравнению с контролем и не превосходило по действию эталонные препараты. Так, в фазу бутонизации при обработке семян Mg2+ в первой и второй концентрациях развитие болезни уменьшилось на 34,5 и 63,3%, соответственно, по сравнению с контролем, что, однако, ниже показателей химического и биоэталонов На развитие листостеблевых болезней гороха — аскохитоз, ржавчину и пероноспороз опрыскивание растений Mg влияния не оказало. Снижение развития незначительно, в пределах ошибки опыта, - на 3,8 % по аскохитозу, на 11,2-12,1 % по пероноспорозу. Численность вредителей - гороховой тли и трипсов сократилась как в период цветения в вариантах с обработкой семян, так и после опрыскивания. В фазу бутонизации в варианте с обработкой семян Mg во 2-й концентрации численность гороховой тли сократилась на 20,7 % по сравнению с контролем, в фазу плодообразования - на 28,9 % в этом же варианте, и на 43 % в варианте с комплексным применением Mg2+ (обработка семян + опрыскивание). Учет численности и вредоносности трипсов по бобам показал, что опрыскивание и обработка семян Mg не имеют влияния на сокращение вредоносности фитофага: при сокращении численности трипсов на бобах на 4,4-25 % поврежденность составляет 100 %. Урожайность культуры в вариантах с комплексным применением Mg2+ (обработка семян + опрыскивание) урожайность возросла с применением 2-й концентрации на 4 % по сравнению с контролем, в остальных вариантах урожайность была на уровне контроля.
Обработка проростков устойчивых и восприимчивых сортов гороха индуктором апоптоза, выделенном из колеоптилеи пшеницы, приводит к типичной для апоптоза картине — на электрофореграмме и темпорально рассчитанным линейным профилям ДНК можно наблюдать лестницеобразные пятна на электрофореграмме, связанные с апоптотической формой деградации ДНК и хроматина. "Лестница" не настолько четко различима, как в случае естественного апоптоза в колеоптиле, тем не менее на линейных профилях, начиная с 5-х суток, видно волнообразное искажение нисходящей ветви главного пика, являющееся следствием суперпозиции главного и группы малых пиков, появляющейся только в случае лестницеобразных электрофореграмм.
По электрофореграмме и темпорально рассчитанным линейным профилям в контрольных проростках гороха в течение всего периода изучения структура ДНК изменяется очень слабо. Основное различие заключается в увеличении главного пика светимости на линейных профилях, свидетельствующем о накоплении в растущем листе ДНК, не подвергающейся ни апоптозной, ни некрозной деградации.
При некрозе под влиянием заражения Fusarium oxysporum в проростках гороха на электрофореграммах и линейных профилях ДНК имеет бесформенное строение. Можно наблюдать следующее: по монотонному убыванию высот пиков на линейных профилях хорошо заметно, что ДНК быстро разрушается без межнуклеосомной фрагментации, которая приводила бы к сегментированным электрофореграммам. Электрофореграмма ДНК дает на линейном профиле пики, слабо превышающие шумовой предел, что говорит о глубокой бессистемной деструкции.
При апоптозе и некрозе в клетках растений накапливаются активные формы кислорода. В норме и при патогенезе ферменты супероксиддисмутаза (СОД), каталаза и пероксидаза, защищающие аэробную клетку от «самозагрязнения» потоками 0{ и Н2Ог , действуют как синергисты. При апоптозе активность каталазы снижается, а активность пероксидазы возрастает, как в норме, так и под влиянием стресс-факторов. Активность СОД резко снижается при апоптозе (в клетках колеоптиля пшеницы), а также в проростках гороха, индуцированных фактором апоптоза.
ДНК на электрофореграммах имеет вид лестницы. Деградация хроматина при апоптозе происходит ступенчато под действием индуцированных различными факторами (например, каспазами), эндонуклеаз, которые сначала атакуют хроматин в областях относительно протяженных розеточных петель (доменов) с высвобождением крупных 50-300 kb фрагментов.
После этого наступает фаза межнуклеосомной фрагментации ДНК, крупные фрагменты хроматина атакуются эндонуклеазами в области межнуклеосомных спейсеров, которые по сравнению с ассоциированной с октамерами гистонов нуклеосомной ДНК более доступны действию эндонуклеаз. При электрофоретическом разделении в агарозном геле такая ДНК выглядит в виде некой лестницы (Ванюшин Б.Ф., 2001).
