Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Тепловая закалка и связанные с ней явления 12
1.2. Роль межорганизменной изменчивости уровня устойчивости для оценки нормы реакции у поикилотермных животных 20
1.3. Зависимость реакции объекта от исходного функционального состояния 24
2. Экспериментальная часть 32
2.1. Материал и методика 32
2.1.1. Характеристика объекта 32
2.1.2. Определение показателя устойчивости 34
2.1.3. Характеристика растворов, тестирующих устойчивость 34
2.1.4. Способ выражение показателя устойчивости 35
2.1.5. Экспериментальное обоснование схемы постановки опытов 42
2.1.6. Статистическая обработка данных 51
2.2. Результаты экспериментов 53
2.2.1. Действие этилового спирта (исследование влияния интенсивности предварительного воздействия на устойчивость мышц к 3.48 М этиловому спирту) 53
2.2.2. Действие хлоралгидрата (исследование влияния интенсивности тестирующего устойчивость мышц воздействия вещества) 64
2.2.3. Действие 2,4-динитрофенола (исследование влияния предварительного воздействия повреждающей концентрации вещества) 77
3. Обсуждение результатов 90
3.1. Приобретенная толерантность мышц лягушки к исследованным химическим веществам. Сравнение химической и тепловой закалки 90
3.2. Сравнение адаптивного ответа клетки и целого организма 97
3.3. Биохимические механизмы адаптивного ответа клетки на стрессорные воздействия 101
3.4. Зависимость адаптивного ответа клетки от исходного уровня устойчивости к повреждающему воздействию 104
3.5. Значение исследования статистических параметров ответа клеток на повреждающее воздействие 113
Выводы 121
- Роль межорганизменной изменчивости уровня устойчивости для оценки нормы реакции у поикилотермных животных
- Результаты экспериментов
- Сравнение адаптивного ответа клетки и целого организма
- Значение исследования статистических параметров ответа клеток на повреждающее воздействие
Введение к работе
Проблема приспособления клеток животных к абиотическим факторам среды всегда находилась в поле зрения многих исследователей, поскольку организм исторически развивался во взаимодействии с определенными факторами среды или "данными их интенсивностями" (Шмальгаузен, 1968).
Исследование механизмов адаптации на разных уровнях организации живых систем проводилось давно и является одним из приоритетных научных направлений физиологической школы И.М. Сеченова - Н.Е. Введенского - А.А. Ухтомского (Январева и др., 2000).
Современные достижения физико-химической биологии связывают адаптацию с рецепцией внеклеточного сигнала, проведением его внутрь клетки и экспрессией защитных стрессорных белков.
По временным параметрам выделяют адаптации: эволюционную (генетическую), фенотипическую (акклимация, акклиматизация) и немедленную, происходящую настолько быстро, что она не может быть связана с изменениями в экспрессии генов или со значительной перестройкой клеточных структур в результате биосинтетических процессов (Хочачка, Сомеро, 1988).
Наиболее изученными являются температурные адаптации, поскольку температурные условия существования видов представляют собой один из универсальных и поэтому решающих факторов среды (Камшилов, 1974; Одум, 1975; Медников, 1977; Ушаков, 1982; Lagerspetz, 1987; Кайданов, 1996 и др.).
Реакцию клеток на температурное воздействие можно оценить во-первых, по интенсивности показателей функционирования клеток при новой температуре и, во-вторых, по слому функций и потере жизнеспособности клеток в условиях экстремального нагрева (Precht,. 1958). Потеря клетками жизнеспособности при экстремальных температурных воздействиях является мерилом их теплоустойчивости (ТУ).
Обширный фактический материал показывает, что уровень ТУ клеток пойкилотсрмных животных является видоспецифическим признаком, и в про-
6 цессе эволюции видов поддерживается в соответствии с температурными условиями существования популяции организмов (Battle, 1926; Patzl, 1933; Adensa-mer, 1934; Александров, 1952; Ушаков, 1955-1968 и др.).
Консервативность уровня ТУ клеток как видового признака не исключает возможности его изменения (см. обзор: Ушаков, 1973). При этом имеют место как облигатные, то есть обязательные, изменения в ТУ клеток, например в онтогенезе, связанные с сезоном, циклом размножения, так и ситуационные, связанные с изменением условий среды, в частности температуры. Поэтому приобретенная термотолерантность клеток растений и животных изучена достаточно хорошо. Особенно детально это явление было изучено на примере тепловой закалки растений в школе В.Я. Александрова, где впервые был применен этот термин (Александров, 1956), и в меньшей степени тепловая закалка исследована на клетках пойкилотермных животных (Александров, 1975, 1985).
При исследовании тепловой закалки было показано повышение ТУ клеток после предварительного супероптимального нагрева к последующему нагреву при высокой сверхпороговой температуре. Было показано, что реакция клеток при тепловой закалке зависит от исходного уровня их ТУ, от дозы предварительного воздействия, и имеет разное проявление в зависимости от сезона года. Отмечено, что наряду с повышением ТУ клеток обнаруживаются параллельные или обратные по знаку изменения их устойчивости к другим повреждающим агентам, то есть эффект носит относительно неспецифичесий характер (Шляхтер, 1959; Александров, 1975, 1985).
В настоящее время в связи с нарастающим давлением на организм, и, соответственно, на его клетки, абиотических факторов среды, и, в частности, избыточного накопления в биосфере химических веществ, вопрос о возможности адаптации клеток к химическим веществам и оценка адаптивных возможностей клеток приобретает важное значение.
Так, в сводке загрязнения окружающей природной среды в стране по материалам наблюдений за 1989-1990 г. показано, что валовый объем выброса вредных веществ от 4668 тыс. промышленных предприятий и автотранспорта в целом составил 95.9 млн. тонн. При этом в ряде регионов концентрация поллю-тантов превышает предельно допустимые концентрации (ПДК) (Израэль, Ро-винский, 1991).
Исследование возможности адаптации на клеточном уровне организации к этим "новым экологическим факторам" имеет не только теоретическое значение для анализа становления адаптивных реакций клеток в эволюции, но и практическое. Последнее связано с тем, что по наличию или отсутствию адаптации клеток к этим факторам можно судить как о состоянии интактных организмов, так и о самой ситуации в биотопе (Израэль, 1979; Дрегольская, 1993; Миронова и др., 1996).
Данных, касающихся непосредственного действия на специализированную ткань (клетки) высших многоклеточных животных химических веществ в плане химической закалки нет, хотя приобретенная толерантность к химическим веществам достаточно представлена в литературе (Metaxes, Levis, 1991; Haga et al., 1997; Ren et al., 1998; Gebel, 2001 и др.). В литературе отсутствуют сведения о систематических исследованиях по изучению в таком аспекте действия химических веществ, с которыми животные не встречаются в процессе своей жизнедеятельности (неадекватные раздражители). Однако на целом организме описана фазность реакции на химическое воздействие: фаза первичных реакций, связанная с поисками доминирующей системы реагирования (для нее характерна широкая изменчивость); фаза неспецифической резистентности, стабилизация; и, наконец, слом адаптации при усилении воздействия (Основы общей промышленной токсикологии, 1976).
В 70-80-е годы под руководством профессора Б.П. Ушакова был разработан оригинальный подход для оценки реакции организмов и их клеток на экспериментальное воздействие. В основе его лежит наблюдение за индивидуальными реакциями объектов, то есть учитывается полиморфизм изучаемого функционального показателя в популяции. Наряду с этим анализируется зависимость изменения функционального показателя от исходного уровня, и изменение диапазона межорганизменнои изменчивости показателя, что позволяет интерпретировать полученные результаты с позиции популяционной биологии (Ушаков, 1978, 1982).
Так, было обнаружено, что при относительно слабом для популяции организмов (акклимационном) воздействии температуры существует четкая обратная зависимость между реактивным сдвигом ТУ объекта и ее исходным уровнем. Это, в свою очередь, приводит к сужению диапазона межорганизмен-ной изменчивости признака ТУ. Таким образом, при слабом воздействии происходит нивелировка организмов по уровню ТУ, что позволяет им при последующем интенсивном воздействии "уйти от отбора". Описанные механизмы рассматриваются как физиологические механизмы гомеостаза на уровне популяции (см. обзор: Ушаков, 1982).
Однако обратная зависимость между реактивным сдвигом ТУ объекта и ее исходным уровнем и соответствующее ей сужение диапазона межорганиз-менной изменчивости признака ТУ характерны и для реакции гетерогенной выборки образцов ткани (клеток) от разных животных в популяции в ответ на повышение температуры, либо выдерживание в физиологическом растворе (Схолль, 1971; Чмшкян, 1972; Ушаков, Амосова, 1972; Кесаманлы, 1974, 1975; Миронова, 1980).
Оценка действия химических веществ на клетки пойкилотермных животных методами популяционной биологии до сих пор не проводилась.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось установление закономерностей изменения статистических показателей при тестировании функциональной активности мышц травяной лягушки химическим воздействием.
В работе были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Оценить возможность использования парных портняжных мышц травяной лягушки Rana temporaha L. от разных особей в популяции для анализа реакции гетерогенной выборки биологических объектов на химическое воздействие.
2. Изучить закономерности изменения среднего уровня устойчивости изолированных мышц травяной лягушки R. temporaria L. к токсическому дей ствию этилового спирта, хлоралгидрата, 2,4-динитрофенола после воздействия на мышцы слабых концентраций этих веществ.
Исследовать зависимость индивидуальных реакций мышц разных особей в репрезентативной выборке из популяции на воздействие химических веществ от исходного индивидуального уровня устойчивости мышц, установить характер корреляции между исходной устойчивостью и ее изменением.
Исследовать зависимость изменения диапазона межорганизменнои изменчивости химической устойчивости от длительности воздействия химических веществ.
Основные положения, выносимые на защиту
Экспозиция мышц в растворах этилового спирта (0.87 М), хлоралгидрата (0.005 М) и 2,4-динитрофенола (0.002 М) вызывает двухфазную реакцию мышц: увеличение среднего уровня устойчивости при относительно кратковременном воздействии, то есть наблюдается эффект приобретенной толерантности (закалки), и понижение среднего уровня при увеличении его длительности.
Эффект приобретенной толерантности зависит от сочетания доз предварительного и тестирующего устойчивость воздействий и носит относительно неспецифический характер, так как одновременно повышается или снижается устойчивость мышц к действию других агентов и температуре.
При относительно кратковременном воздействии химических веществ установлена отрицательная корреляция между исходным индивидуальным уровнем устойчивости мышц и величиной и направлением реактивного сдвига устойчивости и сужение диапазона межорганизменнои изменчивости уровня устойчивости мышц. Эти эффекты выявляются раньше, чем повышается средний уровень устойчивости мышц.
4. При удлинении срока предварительного воздействия агентов обнаруживается нарушение отрицательной корреляции между исходным индивидуальным уровнем устойчивости и величиной и направлением его изменения и расширение диапазона межорганизменной изменчивости уровня устойчивости. Это наблюдается раньше, чем падает средний уровень устойчивости мышц в выборке, и служит сигналом последующей их гибели.
Научная новизна
Впервые проведено систематическое изучение закономерностей реагирования специализированной ткани высших пойкилотермных животных на химические раздражители с применением методов популяционной биологии.
Показано увеличение резистентности мышц к токсическим воздействиям исследованных химических агентов после предварительного кратковременного воздействия на мышцы низких концентраций этих же агентов. Показано уменьшение среднего уровня резистентности изолированной ткани при относительно длительном предварительном воздействии этих концентраций.
В работе предложен и апробирован отличающийся от традиционного набор статистических методов оценки реакции клеток на химическое воздействие и показано, что подход к реакции выборки изолированных мышц, как к гетерогенной системе, повышает чувствительность методов оценки функционального состояния клеток.
Выявлены закономерности динамики реагирования гетерогенной выборки мышц от разных животных в популяции: двухфазное изменение таких интегральных показателей реакции, как коэффициент корреляции между исходным индивидуальным уровнем устойчивости мышц и величиной и направлением (знаком) изменения исходного уровня и диапазон межорганизменной изменчивости уровня устойчивости мышц. В первую фазу реакции наблюдалась отрицательная корреляция между исходным индивидуальным уровнем устойчиво-
11 сти мышц и величиной и направлением его изменения и сужение диапазона межорганизменной изменчивости уровня устойчивости.
Впервые описан критерий раннего повреждения клеток - расширение диапазона межорганизменной изменчивости уровня устойчивости, который отражает нарушение гомеостаза клеток раньше, чем это показывает средний уровень устойчивости. Обсуждается возможность применения этого критерия к изучению функциональных характеристик популяций организмов.
Научно-практическое значение работы
Работа представляет собой фундаментальное исследование, посвященное изучению динамики устойчивости сократительной активности портняжных мышц лягушки в ответ на неспецифическое химическое воздействие (этиловый спирт, хлоралгидрат, 2,4-динитрофенол).
Закономерности, полученные на модели изолированных парных мышц лягушки были подтверждены исследованиями ТУ на мерцательном эпителии моллюсков (Миронова, 19986). Они могут быть использованы для оценки конкретной ситуации в биотопе, например загрязнения его тяжелыми металлами и может проявляться как первая фаза описанной закономерности (Миронова, 19986).
Нарушение отрицательной корреляции между исходным индивидуальным уровнем устойчивости и его изменением и расширение диапазона межорганизменной изменчивости уровня устойчивости могут служить показателями загрязнения биотопа, превышающего адаптивные возможности клетки. Эти показатели являются более чувствительными, чем средний уровень устойчивости.
Использование методов, применяемых для изучения популяционного уровня организации, позволяет открыть новые закономерности в реакции другого (клеточного) уровня организации.
Роль межорганизменной изменчивости уровня устойчивости для оценки нормы реакции у поикилотермных животных
Еще в ранних работах была показана большая внутрипопуляционная изменчивость клеточной ТУ, что объяснялось высокой полигенностью признака, с одной стороны, и большими фенотипическими колебаниями уровня ТУ клеток, с другой, (например, по сравнению с фенотипической вариабельностью ТУ белковых комплексов). Эта разнокачественность показателей ТУ клеток внутри популяции, по мнению авторов, является "проявлением гомеостаза генного баланса на популяционном уровне" (Ушаков, Пашкова, 1967). В дальнейшем были разработаны методы специального анализа изменений ТУ клеток в популяциях разных видов животных и при этом изменчивости признака уделялось особое внимание (Ушаков и др., 1968; Ushakov et al., 1968: Чернокожева, 1970; Схолль, 1971; Ушаков, Амосова, 1972; Чмшкян, 1972; Ке-саманлы, 1974, 1975; Ушаков, 1978 и др.). Так, при анализе дивергенции озерных лягушек было показано, что между двумя видами лягушек травяной и озерной существует прерывистая изменчивость, каждый вид имеет свой диапазон изменчивости. Более того, озерные лягушки из Средней Азии и Талыша и отличающиеся от них по среднему уровню ТУ клеток озерные лягушки из Европейской части Советского Союза имеют разные диапазоны изменчивости (Ушаков, 1963г). Дальнейшие исследования, проведенные на большом количестве животных, показали, что вариабельность признака ТУ непосредственно характеризует генотипическую неоднородность популяции по этому признаку. Это подтве-ждалось тем обстоятельством, что оказалось возможным изменить ТУ потомства путем искусственного отбора гамет под влиянием высокой температуры (Ушаков, Чернокожева, 1963). Возможность отбора по ТУ соматических клеток и наследуемость признака установлена на соматических тканях (Амосова, 1967; Алтухов, Ратькин, 1968; Пашкова, 1978) и на целых организмах (Дрегольская, 1977; Чернокожева, 1985). Было показано, что внутри популяци индивидуальная изменчивость уровня ТУ клеток обусловлена генетически. Поэтому подробное изучение различных долей фенотипической изменчивости ТУ клеток, так же как и у интактных организмов приобретает значительный интерес, так как. оценка индивидуального (межорганизменного) диапазона изменчивости дает возможность оценить норму реакции вида и выявить цитофизиологические механизмы формирования фенотипических изменений ТУ белков, клеток и организмов. Так, исследования И.С. Чернокожевой (1970) онтогенетических изменений ТУ мышц у травяной лягушки показали, что в ходе роста и развития головастиков меняется индивидуальная изменчивость признака, она растет до максимума к моменту завершения метаморфоза, затем снижается и достигает минимума у половозрелых животных.
В этой же работе показано, что размах индивидуальной изменчивости ТУ мышц лягушек всех возрастов на протяжении года является стабильной величиной. Особенно хорошо изучены реактивные изменения диапазона изменчивости уровня ТУ клеток в ответ на акклимационные сдвиги температуры среды. Как правило, при этом происходит сужение диапазона индивидуальной (ме-жорганизменной) изменчивости уровня ТУ ткани (Чернокожева, 1970). Наиболее многочисленны данные по изменению индивидуальной изменчивости признака ТУ получены в опытах при изучении адаптивных сдвигов изменчивости на организмах пойкилотермных животных. При этом применялся сибанализ (на братьях, сестрах в семье или клонах агамных организмов) (см. обзор: Ушаков, 1982). Было показано, что при повышении температуры среды наблюдается изменение диапазона индивидуальной (межорганизменной) изменчивости уровня ТУ организма. Оно является следствием неодинакового повышения уровня ТУ у разных индивидуумов из одной популяции. При этом наиболее чувствительные к действию повреждающего нагрева повышают свой уровень ТУ в наибольшей степени. Высокоустойчивые, как правило, его снижают или изменяются в меньшей степени. Наименее лабильны особи со средним уровнем ТУ. Таким образом, наблюдается обратная зависимость между исходным уровнем ТУ и величиной и направлением (знаком) его реактивного сдвига, что констатируется по отрицательному значению коэффициенту корреляции между этими показателями (Ushakov, Bugayeva, 1975; Ushakov et al., 1977a, 1977b; Пашкова и др., 1981; Ушаков, 1982 и др.). Б.П. Ушаковым был проанализирован материал из работ на простейших и тутовом шелкопряде (Ас-тауров и др., 1958, 1962; Ирлина, 1963а, 19636; Суханова, 1968а, 19686 и др.) и выявлена аналогичная закономерность. Автор делает вывод о том, "что норма реакии на повышение температуры среды представляет собой функцию от исходного уровня устойчивости организма, свойственного каждому данному генотипу" (Ушаков, 1982, с. 311). Именно за счет полиморфизма популяции по этому признаку формируется способная к саморегуляции, то есть физиологическому гомеостазу, структура популяции. По Б.П. Ушакову, "способность к са- морегуляции определяется двумя свойствами: во-первых, спецификой генетической структуры популяции, то есть ансамблем генотипов, входящих в ее состав, и, во-вторых, относительно жесткой программой физиологических реакций отдельных генотипов в ответ на изменение внешней среды" (Ушаков, 1982, с. 319). Однако такие же закономерности в зависимости реактивного сдвига ТУ от исходного уровня ТУ, приводящее к сужению размаха индивидуальной (ме-жорганизменной) изменчивости признака, обнаружены и при действии предварительного нагрева разной интенсивности (как умеренно высоких, не повреждающих, так и повреждающих температур) на изолированную ткань: мышечную ткань лягушки, мерцательный эпителий моллюсков (Схолль, 1971; Ушаков, Амосова, 1972). Этот же эффект наблюдали и на изолированном мерцательном эпителии и мышцах лягушки при их выдерживании в растворе Рингера (Чмшкян, 1972; Кесаманлы, 1974).
Это свидетельствует о том, что обратная зависимость реактивного сдвига устойчивости к повреждению от исходного уровня, приводящая к сужению внутрипопуляционной изменчивости признака, может обеспечиваться собственно клеточными механизмами и, по-видимому, является универсальной неспецифической реакцией на воздействие, по терминологии Г. Селье (1972), она представляет собой неспецифический адаптационный синдром на уровне популяции. Более того, мы полагаем, что такая реакция популяции на воздействие характерна и для других, во всяком случае количественных показателей реакции биологических объектов. Действительно, было выявлено, что не только влияние, но и само накопление тяжелых металлов в тканях некоторых пресноводных моллюсков из загрязненного биотопа отличается меньшей вариабельностью, чем это наблюдалось у животных из чистого биотопа (Коротнева и др., 1996). 1.3. Зависимость реакции объекта от исходного функционального состояния Зависимость реакции биологического объекта на воздействие от исходного уровня исследуемого показателя наблюдали давно. Это явление широко распространено и изучено на большом экспериментальном материале. Так, Н.П. Смарагдова и Г.Ф. Гаузе (1939) изучали приспособление пресноводных парамеций (Paramecium caudatum, P. aurelia и P. bur-saria) к повышению солености среды. С помощью коньюгаций они получали большое наследственное разнообразие материала. При приспособлении большого числа клонов к постепенному повышению солености среды было установлено, что между исходной стойкостью к солености и величиной модификации в результате адаптации обнаруживается обратная зависимость. Аналогичная закономерность получена Н.П. Смарагдовой (1940) на P.bursaria и Шукма-ном (Schuckmann, 1940) при анализе приобретенной и врожденной стойкости к мышьяку у различных клонов инфузорий Colpoda steini, А.Ф. Орловой (1941, 1947) при изучении резистентности к хлористому кальцию различных рас Paramecium caudatum. Аналогичные данные были получены при анализе врожденной скорости мутирования у различных штаммов D. melanogaster и скоростью мутирования под влиянием облучения Х-лучами (Тимофеев-Ресовский, 1940; Гаузе, Алпатов, 1941). Аналогичные данные получены и при изучении врожденной способности разных животных к адаптации.
Результаты экспериментов
. Действие этилового спирта (исследование влияния интенсивности предварительного воздействия на устойчивость мышц к 3.48 М этиловому спирту) Этиловый спирт или этанол - бесцветная жидкость, хорошо смешивающаяся с водой. Химическая формула (С2Н5ОН) или (СН3-СН2-ОН). Этиловый спирт относится к группе наркотиков жирного ряда. В ранних работах было показано, что действие этилового спирта на клетку проявляется в его способности денатурировать клеточные белки (Насонов, Александров, 1937; Лопатина и др., 1953; Аничков, Беленький, 1955). Это вещество с пороговым действием на мышечную ткань лягушки (Насонов, 1962) (рис. 5). Подпороговые концентрации этилового спирта увеличивают время сохранения возбудимости портняжных мышц лягушки и мерцательного эпителия неба лягушки (Киро, 1964). Изучение устойчивости к повреждающим концентрациям агента показало, что спиртоустойчивость амеб является наследственным признаком (Сопина, 1963, 1968; Сопина, Юдин, 1965). В работе изучали влияние двух субтоксических концентраций этилового спирта (087 и 1.09 М). В контрольных опытах наблюдали за спиртоустойчиво-стью мышц после выдерживания в растворе Рингера при 6-8 С (Миронова, 1976, 1982, 1999, Mironova, 1996). Выдерживание одной из мышц в растворе Рингера в течение 60 мин практически не влияло на средний уровень спиртоустойчивости мышц (к 3.48 М раствору вещества) (рис. 6, а). Помещение одной из мышц в 0.87 и 1.09 М растворы этилового спирта (субтоксические концентрации) приводило к увеличению среднего уровня спиртоустойчивости мышечной ткани при кратковре- менном воздействии. Максимальный эффект в растворах обеих концентраций наблюдался при 60-минутном выдерживании мышц и составлял 20% (Р 0.05). Увеличение времени выдерживания мышц в 0.87 М этиловом спирте до 120 мин практически не повлияло на этот уровень устойчивости. При 240-минутном выдерживании в 0.87 М этиловом спирте наблюдалось резкое снижение среднего уровня устойчивости мышц почти на 50% (Р 0.05) (рис.6, а). Отдельные мышцы разных особей лягушек при кратковременном выдерживании в растворе Рингера меняли свой уровень разнонаправлено. Высокоустойчивые понижали его, а низкоустойчивые повышали, мышцы со средним уровнем устойчивости практически его не изменяли.
В результате этого, уже через 5 мин выдерживания в растворе Рингера обнаруживалась значительная отрицательная корреляция между исходным уровнем спиртоустойчивости мышц и величиной и направлением его изменения. Значение этого коэффициента колебалось в зависимости от срока выдерживания в растворе Рингера, но оно всегда было достоверным: от -0.39 до -0.55 (Р 0.05) (рис.6, б). Кратковременное выдерживание одной из мышц в растворе 1.09 М этилового спирта также приводило к возникновению отрицательной корреляции между исходной спиртоустойчивостыо мышц и ее изменением. Максимальное значение ее коэффициента было получено при 30-минутном воздействии вещества и составляло -0.75 (Р 0.05) (рис. 6, б). Из этого рисунка следует, что изменение этого коэффициента носило двухфазный характер: он увеличивался при кратковременном воздействии и снижался при относительно длительном. Следует отметить, что падение коэффициента отрицательной корреляции до недостоверного значения произошло на фоне еще достаточно высокого среднего уровня спиртоустойчивости мышц (рис. 6, а, б). Уменьшение концентрации слабого раствора этилового спирта до 0.87 М в общем не изменило динамику коэффициента отрицательной корреляции. Она также носила двухфазный характер, но была более растянута во времени. А при значительном сроке выдерживания мышц в этом растворе (240 мин) этот коэффициент стал иоложитель- ным, Гд = 0.39 (рис. 6, б), что происходило на фоне резкого снижения среднего уровня устойчивости (рис. 6, а). Положительное значение коэффициента указывает на то, что в этом опыт наблюдается ускорение падения уровня устойчивости мышц, и тем большее, чем ниже их исходный уровень (рис. 7). Выдерживание мышц в растворе Рингера в течение 5-60 мин приводило к резкому падению коэффициента положительной корреляции между уровнями устойчивости парных мышц. Он колебался относительно среднего значения 0.55 в течение всего срока наблюдения (рис. 6, в). Выдерживание мышц в 1.09 М этиловом спирте также приводило к снижению коэффициента положительной корреляции между уровнями спиртоустоичивости парных мышц, однако он и в этом случае оставался достоверно значимым. При выдерживании мышц в 0.87 М этиловом спирте этот коэффициент менялся фазно. Дважды его значение падало до недостоверных значений: при 15 мин г = 0.12; Р 0.05 и при 120 мин воздействия на мышцы г = 0.30; Р 0.05 (рис. 6, в). В первом случае это, вероятно, связано с возникновением значительной отрицательной корреляции между исходным уровнем спиртоустоичивости мышц и ее изменением. Действительно, по данным всех серий опытов было установлено, что между значениями коэффициента корреляции между уровнями устойчивости парных мышц и значениями коэффициента корреляции между уровнем устойчивости у одной из мышц (исходный уровень) и величиной и направлением его изменения у второй существует обратная зависимость: г = -0.47. От нее отклоняется лишь одна точка, в которой представлены опыты с 240-минутным выдерживанием мышц в 0.87 М этиловом спирте (рис. 8). Второе падение значения коэффициента положительной корреляции между уровнями устойчивости парных мышц мы склонны связывать с последующей гибелью мышц. О ней также можно судить по резкому падению среднего уровня спиртоустоичивости мышечной ткани, которое происходило в дальнейшем при увеличении срока выдерживания ее в слабом растворе спирта (рис. 6, а, в). Из рис. 6, г следует, что изменение диапазона изменчивости уровня спир-тоустойчивости мышц, о которой мы судили по отношению его коэффициентов вариации CVVCV,,, где CV„- исходная вариабельность признака устойчивости, a CV3- его изменчивость после воздействия, меняется сопряженно со значением коэффициента отрицательной корреляции (сравни рис. 6, б и рис. 6, г). Индивидуальная изменчивость уровня спиртоустойчивости мышц, так же как и коэффициент отрицательной корреляции менялась двухфазно на всем протяжении эксперимента.
Она уменьшалась при кратковременном воздействии слабых растворов этилового спирта и увеличивалась при более длительном. Наибольшее расширение диапазона изменчивости уровня спиртоустойчивости мышц получено при 240-минутном воздействии на мышцы 0.87 М этилового спирта, то есть когда коэффициент корреляции между исходной устойчивостью и величиной и направлением ее изменения стал положительным. В этом случае диапазон изменчивости увеличился практически в 8 раз (рис. 6, г). Сопряженность изменений коэффициента отрицательной корреляции и индивидуальной изменчивости исследуемого признака иллюстрирует рис. 9. Видно, что она имеет закономерный характер и подчиняется уравнению линейной регрессии у = 1.09х + 1.54, где х - значение гд, у - C\yCV„. Из этого уравнения следует, что падение величины коэффициента отрицательной корреляции до недостоверных значений сопровождается расширением диапазона изменчивости. Это достаточно четко уже прослеживается и из сопоставления рис. 6, б и 6, г. Изменение знака коэффициента корреляции между исходным уровнем спиртоустойчивости мышц и величиной и направлением его сдвига с отрицательного на положительный еще более усиливает этот процесс (см. рис. 9). Из представленных результатов следует, что расширение диапазона изменчивости уровня спиртоустойчивости мышц происходило несколько раньше, чем падение среднего уровня их устойчивости. Более четко это следует из опытов с действием 1.09 М этилового спирта, когда коэффициент отрицательной корреляции был уже недостоверным (-0.26), уже наблюдалось расширение диапазона изменчивости до 1.24, а средний уровень спиртоустойчивости мышц еще на 20.4% превышал исходный средний уровень (рис. 6, а, б, г). Поскольку наибольшее расширение диапазона изменчивости, получено на фоне значительного падения среднего уровня спиртоустойчивости мышц (240 мин воздействия), а анализ изменения индивидуальной изменчивости признака спиртоустойчивости проводился на основании сравнения коэффициентов вариации исследуемого признака до и после воздействия, то исходя из формулы вычисления коэффициента вариации CV = а/М, можно допустить, что расширение диапазона изменчивости могло произойти лишь за счет падения среднего уровня устойчивости мышц.
Сравнение адаптивного ответа клетки и целого организма
Общность динамики, обнаруженная нами при действии всех исследованных веществ, важна для нас, так как позволяет каждое из них использовать для последующего анализа индивидуальных реакций мышц при нарастающей длительности воздействия фактора. Мы полагаем, что для такого анализа вклада индивидуальных реакций изолированных мышц в общую динамику ответа, оцениваемого статистическими методами, инструмент как тепловой, так и химической закалки, является идеальным. Действительно, между парными мышцами имеется изначально высокая корреляция по резистентности к любому изученному агенту. Она близка к 1 (см. раздел 2.2). Сохраняется эта корреляция и через довольно длительное время (см. раздел 2.2). Таким образом, изначально, сразу после изоляции, наблюдаются наиболее комфортные условия для обеспечения нормальной довольно длительной жизнедеятельности данного объекта, то есть зону оптимума. Существует довольно длительно действующий химический фактор, то есть имеется простая модель реакций гетерогенной системы на длительно действующий постоянный фактор. Преимущество этой модели перед моделью популяции организмов в том, что сходство родителей и потомков не столь велико. Коэффициент наследуемости, например, по признаку теплоустойчивости организма у такого широко используемого в генетике популяций объекта, как Drosophila melanogaster, равен всего 0.46 (Ushakov, 1977; Амосова, 1978). При этом количественная оценка степени сходства физиологического признака у родителей с потомством зачастую производится с помощью коэффициента корреляции (Рокицкий, 1974). Напомним, что у нас степень сходства парных мышц лягушки, вычисленная по коэффициенту корреляции между ними почти равна 1. Модель не осложняется панмиксисом, поведенческими реакциями и др. Правомочность использования такой модели для оценки реакции популяции организмов подтверждается данными В.Б. Андроникова (1994) о том, что максимально выносимые организмом температуры отличаются от пороговых температур теплового повреждения ткани не более чем на 2-3 С. Так, для травяной лягушки эти величины равны, соответственно, 29 и 31 С, для озерной -33-34 и 36 С (Андроников, 1994). Закалка является клеточной реакцией, даже если воздействию подвергать интактный организм. Однако известно, что организм гибнет при меньших температурах нагрева, чем клетки. При этом тепловая смерть организма не может быть сведена к одному или ограниченному числу механизмов.
Считается, что тепловая смерть организма не является результатом необратимого повреждения клеток или тканей. Селектирующее действие температуры направлено на фенотипы организмов, представляющих собой самостоятельные интегрированные системы, которые характеризуются взаимосвязанностью отдельных систем организма- их функциональной комплементарностью (Grawshaw, 1979; Фридрих, 1986, цит. по: Андроников, 1994). Тепловая гибель организма обусловлена рассогласованностью функционирования этих систем, наиболее чувствительной из которых является нервная система. Гибель изолированных тканей организма, в частности мышечной ткани при повреждающем нагреве, обусловлена непосредственным действием повреждающих температур, вызывающих денатурацию клеточных белков (Буткевич, 1948; Ушаков, Гастева, 1953; Ушаков, 1965; Джамусова, 1965; В. Ушаков, 1963, 1964, 1965; В. Ушаков, Васильева, 1965). В последнее время основная роль в термальном повреждении клеток отводится инактивации АТФ-азы клеточных мембран (Cossins et al., 1977; Bowler, 1981; Cossins, Bowler, 1987, цит. по: Андроников, 1994). Большое внимание при любом виде стресса уделяется повреждению биомембран, которое осуществляется путем активации липаз, фосфоли-паз, усилению перекисного окисления липидов, и меняет липидиое микроокружение жизненно важных мембраносвязанных белков: рецепторов, каналов ионного транспорта, таких ключевых ферментов, как Na, К-АТФаза, Са-АТФаза, аденилатциклаза (Меерсон, Пшенникова, 1988). В целом, резистентность клеток пойкилотермных животных по сравнению с организмом является более высокой, а ее изучение почти исключительно проводится на изолированных из организма тканях. Имеются лишь единичные работы по изучению резистентности ткани в системе организма. Так, И.М. Пашковой (1980) было обнаружено, что при нагреве мышц хвостов головастиков травяной лягушки в системе организма мышечная ткань во всем исследованном диапазоне температур 34-36 С обладает существенно более низкой ТУ, чем в случае, если нагреву подвергались изолированные мышцы. Разница тем больше, чем ниже температура, при которой определялась ТУ. Следовательно, изолированная из организма ткань по своим физиологическим параметрам отличается от этой же ткани в системе организма. И, возможно, судя по приведенным данным, в норме, то есть в системе организма, резистентность ткани гораздо ниже и более приближена к уровню ТУ организма. Если представить себе, что регулирующее влияние организма на клетки будет снято, то тогда на арену экологических и собственно эволюционных преобразований уже выступит клеточный уровень организации, и это может наступить и при существовании клеток в системе организма. О значительной самостоятельности клеток в системе организма свидетельствуют данные о злокачественном росте соматических клеток. По-видимому, степень обособленности клеток находится в обратной зависимости от степени сложности организации живой системы. К идее о существовании самостоятельной роли клеток приводит и анализ данных В.Б. Андроникова (1994), полученных на мантийных мышцах мидии Mytilus galloprovincialis, нагреваемых в системе организма и в изолированном состоянии. Ткань нагревалась в системе организма при температуре 32 С - 60 мин, при 34 С - 30 мин, при 36 С - 10-15 мин, при 38 С - 5 мин. Такое тепловое воздействие не приводило к гибели организмов животных ни во время опыта, ни через 2-3 сут их последующего содержания при оптимальной для животных температуре. Заметим, что температуры нагрева являлись повреждающими для изолированной ткани. При этом в системе организма изменение ТУ было одинаковым с наблюдавшимся на изолированной ткани. Однако после перенесения животных в оптимальные условия оно через 24 ч исчезало.
Отмечая регулирующую роль организма в изменении резистентности ткани, автор пишет "... что при кратковременном сублетальном тепловом воздействии на организм может происходить (по крайней мере, в некоторых случаях) повреждение тканей, подобное тому, какое вызывается термальным воздействием на изолированную ткань". (Андроников, 1994, с. 96). Имея в виду эти данные, а также сравнение выносимых и пороговых температур, о близости которых говорилось выше, по-видимому, приспособитель- ному значению степени резистентности клеток и тканей пойкилотермных животных стоит придавать гораздо большее значение. Тем более, что имеется достаточное количество данных (среди многих и весьма противоречивых) о скор-релированности ТУ организмов и их тканей (см. обзор: Ушаков, Пашкова, 19866). 3.3. Биохимические механизмы адаптивного ответа клетки на стрес-сорные воздействия Сравнение концентраций химических веществ, вызывающих эффект закалки, антагонизма и УВП (увеличения времени переживания) показывают, что для выявления всех этих эффектов концентрации этанола и хлоралгидрата совпадают (Черепанова, Суздальская, 1954; Киро, 1964; Суздальская, 1968; Мороз, 1969 и др.). По мнению этих авторов, а также В.Я. Александрова и Б.П. Ушакова, защитное, проявляющееся во всех этих эффектах действие веществ связано, по-видимому, с их способностью в низких концентрациях индуцировать в мышечной ткани развитие продромической фазы парабиоза-паранекроза, для которой характерна нативация клеточных белков и их комплексов (Насонов, Александров, 1940; Ушаков, 19596; Насонов, 1962; Суздальская, 1968; Александров, 1975, 1985,1995). Чему может соответствовать "нативация" клеточных структур по сегодняшним представлениям? В более поздних работах (Браун, Моженок, 1987) подчеркивается особая роль актина в этих реакциях, его полимеризации и вторичных взаимодействий. Основываясь на том факте, что актин обнаружен практически во всех не мышечных клетках, авторы считают, что "условия, возникающие в клетке при адаптационном синдроме, способны провоцировать изменения структуры Г-актина, инициирующие переход его в Ф-форму, и вторичные реакции с актин-связывающими белками. Такими условиями являются, во-первых, увеличение концентрации одно- и двухвалентных катионов, и, во-вторых, освобождение из связи с РНК и белками полиаминов - специфических триггеров процесса полимеризации актина" (Браун, Моженок, 1987, с. 166).
Значение исследования статистических параметров ответа клеток на повреждающее воздействие
Первая фаза изменения устойчивости изолированной ткани отдельных особей в популяции в ответ на кратковременное предварительное воздействие химических веществ в деталях совпадает с хорошо изученным изменением ТУ популяции организмов в ответ на повышение температуры среды. Обратная зависимость между исходной ТУ организма и реактивным сдвигом ТУ при повышении температуры среды является физиологическим механизмом, обеспечивающим гомеостаз популяции, то есть ее нормальное функционирование. Основная роль в осуществлении регулирования реактивного сдвига ТУ, по мнению Б.П. Ушакова, принадлежит индивидуальному, генетически детерми- нированному уровню исходной ТУ организма (Ushakov, Bugayeva, 1975; Usha-kov et al., 1977a, 1977b; Ушаков, 1982). Из представленных данных следует, что сходный по сути физиологический механизм регулирует и реакцию изолированной ткани на непосредственное воздействие агента. В основе его лежит свойство нормально функционирующей жизнеспособной ткани регулировать исходным индивидуальным уровнем устойчивости к повреждению внешними факторами изменение этого уровня. Нарастание интенсивности воздействия приводит к нарушению работы этого механизма (вторая фаза реакции), что является, по нашему убеждению, более чувствительным показателем ухудшения функционального состояния или повреждения клеток ткани, чем изменение среднего уровня ее устойчивости. Так же, как и при исследовании влияния повышения температуры среды на популяции организмов, при работе с изолированными тканями опыты ставятся на животных, находящихся длительное время в стабильных и оптимальных для вида условиях, и на одинаковых стадиях онтогенеза. Считается, что тогда уровень ТУ ткани обусловлен генотипом особи (Амосова, 1967; Алтухов, Ратькин, 1968; Пашкова, 1978; Чернокожева, 1985). В этих работах показана высокая наследуемость уровня ТУ изолированной ткани. В частности, в опытах Ю.П. Алтухова и Э.В. Ратькина (1968), выполненных на мышечной ткани тутового шелкопряда, установлено, что на долю наследственных различий в ТУ мышечной ткани приходится более 50-60% от индивидуальной изменчивости этого признака для популяции в целом. И.С. Амосова (1967) показала эффективность искусственного отбора личинок мух, проводимого методом сибселекции по признаку ТУ мышечной ткани. Что касается наследственной природы устойчивости клеток к химическим агентам, то это было показано на одноклеточных организмах (см. обзоры: Сопина, 1963, 1968; Сопина, Юдин, 1965; Юдин, 1980,1982).
Следует, по-видимому, обсудить, почему первой реакцией на воздействие является сужение исходного диапазона изменчивости. Это мы наблюдали при действии всех агентов в нашей работе. Аналогичные результаты были получены и раньше на изолированных тканях (Схолль, 1971; Чмшкян, 1972; Ушаков, Амосова, 1972;Кесаманлы, 1974, 1975). Феномен как раз и объясняется тем обстоятельством, что перед опытом мы выдерживали животных при оптимальных и стабильных условиях. А в таких условиях, как было показано при изучении акклимационных изменений ТУ в популяциях пойкилотермных животных, популяция характеризуется максимальной индивидуальной изменчивостью разнообразных физиологических показателей, максимальным коэффициентом наследуемости физиологических признаков, максимальными значениями коэффициентов корреляции между разными признаками особей (Ушаков, Пашкова, 19866), в частности ТУ организма и таким важным показателем его жизнеспособности, как плодовитость (Ушаков и др., 1984), то есть, по терминологии Б.П. Ушакова, популяция животных в оптимальных условиях находится в состоянии экологического покоя (Ушаков, Пашкова, 19866). Более того, сужение диапазона изменчивости физиологических показателей в ответ на отклонение условий среды от оптимальных, вероятно, является неспецифической характеристикой реакции популяции. Так, было показано, что не только влияние, но и само накопление тяжелых металлов (ТМ) в тканях некоторых пресноводных моллюсков из загрязненного биотопа отличается меньшей вариабельностью, чем наблюдаемая вариабельность накопления ТМ у этих же видов животных из чистого биотопа (Коротнева и др., 1996). В ходе обсуждения материала может создастся впечатление, что мы смешиваем реакцию популяции организмов на воздействие и реакцию гетерогенной выборки образцов ткани от разных животных в популяции. На самом деле мы пытаемся показать, насколько близки закономерности реагирования этих двух гетерогенных систем. Опыты на обоих типах систем были выполнены в максимально приближенных условиях. Так, в последнее время практически все основные проблемы акклимационных изменений ТУ в популяции пойкило-термных животных решались с помощью метода сибакклимации. Суть этого метода заключается в том, что определение исходного уровня ТУ и его изменения под влиянием какого-либо фактора проводятся на сибсах - потомках одной и той же родительской пары или на представителях одного и того же клона. Реакция популяции при этом оценивается по генотипам семей или клонов (Ушаков и др., 1971; Дрегольская, 1977 и др.), то есть во всех работах оценивается с максимальным приближением исходная генотипическая компонента изменчивости. То же самое старались делать и мы в своей работе. Ранее мы уже говорили о специфике в действии химических и температурного факторов и о различии в механизмах, лежащих в основе гибели клеток и организмов. Отличается и механизм реализации ответа клеток при действии акклимируещего фактора на организм животных от ответа клеток на его непосредственное воздействие. Однако во всех случаях исследуется изменение одинакового признака - индивидуальной генетически обусловленной резистентности объектов к повреждающему воздействию, выраженной временем их жизни в повреждающих условиях. Это позволяет предполагать существование более глубокого сходства в реакции популяции животных на акклимацию и реакции гетерогенной выборки образцов ткани на непосредственное последовательное воздействие разных интенсивностей какого-либо фактора. При тепловой акклимации в популяциях пойкилотермных животных при анализе изменений ТУ организмов и ТУ их тканей обнаружена взаимосвязь по-пуляционных показателей реакции (среднего уровня устойчивости, его среднего квадратического отклонения, коэффициента корреляции между исходной устойчивостью и ее сдвигом и др.).
Она трактуется как свидетельство того, что популяция организмов реагирует на повышение температуры как единая функциональная система (Ушаков, 1982; Ушаков, Пашкова, 1986а, 19866). Такая же взаимосвязь популяционных показателей реакции обнаружена нами при действии на гетерогенную выборку образцов ткани химических агентов. Ее значение нам пока не вполне ясно. Однако существование такой взаимосвязи еще раз подчеркивает сходство в реакции на воздействие обеих гетерогенных систем. Таким образом, представленный материал позволяет думать, что выявленные закономерности динамики популяционных компонент реакции на воздействие, а также их взаимосвязь характерны для гетерогенной выборки биологических объектов любого уровня организации. По-видимому, они являются закономерностями общего порядка, поскольку в основе их проявления лежит генетически обусловленная неоднородность биологических объектов, с которой мы, как правило, имеем дело при анализе их реакции на любом уровне организации. Следует, однако, обсудить еще одно обстоятельство. Мы сравнивали первую фазу реакции выборки изолированных мышц с реакцией гетерогенной выборки организмов из популяции при их тепловой акклимации. Между ними обнаруживается удивительное сходство. При тепловой акклимации животных обращается внимание на то обстоятельство, что разнонаправленные изменения устойчивости объектов (как организмов, так и их клеток) из одной популяции резко выражено на начальных стадиях теплового воздействия, когда сдвиг функциональных изменений еще не велик, а на более поздних стадиях теплового воздействия изменение уровней устойчивости происходит более или менее однотипно (Ушаков, 1978). Казалось бы, имеется противоречие с нашими данными, когда мы получали при более длительном воздействии даже некоторую положительную корреляцию между исходным уровнем устойчивости и его сдвигом.
