Содержание к диссертации
ВВЭДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1. Основные сведения о Т-, В- и О-лимфоцитах животных и человека 12
2. Методы идентификации Т- и В-лимфоцитов 17
3. Количественные соотношения Т- и В-лимфо-вдтов здоровых и больных хроническим лимфолейкозом коров 26
4. Морфофункциональные исследования лимфоцитов животных и человека 29
5. Исследование функциональной активности Т- и В-лимфоцитов крупного рогатого скота в норме и при лейкозе 33
6. Особенности обмена нуклеиновых кислот в нормальных и лейкозных клерках 1 35
6.1. Синтез ДНК и пролиферативная лимфоцитов крупного рогатого скота и
человека в норме и при хроническом лимфолейкозе 36
6.2. Синтез РНК в лимфоцитах крупного рогатого скота и человека в норме и при
хроническом лимфолейкозе 41
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
1. Объем проведенных исследований 46
2. Характеристика подопытных животных 46
3. Лимфоидных клеток крупного рогатого скота
З 3.1. Выделение лимфоцитов из периферической
крови 48
3.2. Выделение лимфоцитов из лимфоузлов и тимуса 48
4. Идентификация Т- и В-лимфоцитов 49
4.1. Постановка спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана 49
4.2. Постановка комплементарного розеткообразования 49
5. Авторадиографическое исследование нуклеиновых кислот в лимфоцитах 51
6. Окрашивание цитологических препаратов 53
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 54
1. Результаты исследования Т-лимфоцитов
здорового и больного хроническим лимфо лейкозом крупного рогатого скота 54
1.1. Количество Т-лимфоцитов в крови и лимфоид ных органах 54
1.2. Соотношение Т-лимфоцитов различных размеров 55
1.3. Соотношение Т-лимфоцитов с разными типами
ядрышек 57
2. Результаты исследования В-лимфоцитов здорового и больного хроническим лимфолейкозом
крупного рогатого скота 63
2.1. Соотношение В-лимфоцитов различных размеров 63
2.2. Соотношение В-лимфоцитов с разными типами ядрышек 65
3. Синтез ДНК разными популяциями лтфэцитов
здорового и больного хроническим лимфолейкозом
крупного рогатого скота - 4 3.1. Количество ДНК-синтезирзаоших Т-лимфоцитов различных размеров 72
3.2. Количество ДЖ-сіштезируощих В-лимфоцитов различных размеров 74
3.3. Интенсивность мечения ТІ-тимидином Т- и В-лшлфоцитов в периферической крови 75
4. Синтез РНК различными популяциями лимфоцитов здорового и больного хроническим
лимфолейкозом крупного рогатого скота 78
4.1. Соотношение РШ-синтезирущих лимфоцитов с разными типами ядрышек в периферической крови и лимфоидных органах 81
4.2. Соотношение РНК-синтезирующих Т-лимфоцитов различных размеров и с разными типами ядрышек 83
4.3. Соотношение РНК-синтезирующих В-лимфоцитов различных размеров и с разными типажі ядрышек 87
4.4. Интенсивность мечения Н-уридином Т-иВ-лимфоцитов в периферической крови 89
5. Течение и варианты хронического лимфолейкоза
крупного рогатого скота 92
ОБСУЖДЕНИЕ ПОДУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 96
ВЫВОДЫ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЕ 146
Введение к работе
В последние годы получила признание концепция о функциональной гетерогенности популяций лимфоцитов, участвующих в иммунологических реакциях организма. Однако, цитологические свойства Т- и В-лимфоцитов, синтез нуклеиновых кислот в них в норме и при лейкозах изучены недостаточно.
Системные заболевания клеток крови, опухолевая природа которых в настоящее время не вызывает сомнений, по частоте возникновения и прогрессирующему их распространению представляют одну из важнейших научных и практических проблем, решение её является первоочередной задачей (Шишков В.П., 1977, Бергольц В.М., Еремеев B.C., 1977).
Одним из центральных вопросов в изучении цитологии лейкозов является исследование механизмов возникновения лейкозной трансформации клеток. Известно, что данный процесс тесно связан с нарушением механизма регуляции клеточной пролиферации и дифференциации. Это находит свое отражение в изменении морфологических, метаболических и $гакциональных особенностей лимфоцитов, вовлекаемых в патологический процесс.
Спонтанное возникновение хронического лимфолейкоза (ХМ) крупного рогатого скота (КРС), развитие процесса в отсутствии лечения является удобной моделью для исследования различных вопросов диагностики и патогенеза лейкозов. В настоящее время достаточно хорошо известны гематологические признаки, патологоана-томические изменения при ХЛЛ, однако, до сих пор данные показатели не полностью сопоставлены с определенными морфологическими, пролиферативными особенностями лимфоцитов. Кроме того, исследования механизма патогенеза ХМ крупного рогатого скота чаще все.
Проводились вне связи функциональных и морфологических особенностей лимфоцитов и их принадлежности к определенной популяции иммунокомпетентных клеток. Отсутствие таких данных ограничивает возможность постановки точного диагноза, особенно на ранней стадии и затрудняет прогнозирование исхода болезни.
Наша работа входит во Всесоюзную научно-техническую программу 0.69.05. "Разработать и внедрить в практику патогенетические методы и средства профилактики и лечения лейкоза человека, сельскохозяйственных животных и птиц" и является частью плановых тем Ин-та биохимии АН ЛитССР: "Изучение цитологической характеристики и иммунологических реакций организма при лейкозах" .№ Гос. регистрации 79022998, "Изучение реакций клеточного иммунитета и антигенной стиікуляции лимфоцитов клеток при лейкозе" Ш Гос. регистрации 81007776.
Цель работы: установление соотношения Т- и В-лимфоцитов у здорового и больного КРС на разных стадиях ХЛЛ", определение их морфологической структуры и синтезирующей активности нуклеиновых кислот, выявление возможных вариантов ХЯЛ крупного рогатого скота.
Задачи:
1) установить абсолютное и относительное количество Т- и В-клеток у здоровых и больных коров на разных стадиях лейкозно-го процесса;
2) определить размеры Т- и В-лимфоцитов и тип ядрышек в них;
3) установить количественное соотношение РНК- и ДНК-синте-зирутощих Т- и В-лимфоцитов и определить их морфологию;
4) на основе выявления количественного соотношения разных морфофункциональных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов определить возможные варианты ХЛЛ крупного рогатого скота, которые можно
-9 было бы использовать в диагностике и прогнозировании XII.
В данной работе впервые установлено измененное соотношение количества Т- и В-лимфоцитов на разных стадиях XII крупного рогатого скота, проявляющееся уменьшением числа Т- и зшеличением В-клеток. Степень данных изменений указывает на поражение иммунной системы и отражает тяжесть процесса. Осуществлено морфо-функциональное исследоваїше Т- и В-лимфоцитов на разных стадиях XII. Обнаружено, что популяции Т- и В-лимфоцитов в зависимости от размеров клетки представлены 4 субпопуляциями: малыми, средними, большими и бластными. По структуре нуклеолярного аппарата им характерно наличие двух типов ядрышек: гомогенных или кольцевидных. В ходе развития ХМ изменяется соотношение количества Т- и В-лимфоцитов разных размеров и с разными типами ядрышек: уменьшается число малых, частично средних с кольцевидными ядрышками и увеличивается количество больших и бластных клеток с гомогенными ядрышками. Впервые прослежена взаимосвязь цитологической структуры и активности синтеза нуклеиновых кислот в Т- и В-лшлфоцитах КРС. Количество клеток с гомогенными ядрышками меченными -уридином и °1і-тимидином было больше, чем клеток с кольцевидными ядрышками. Интенсивность мечения Т- и В-лимфоцитов с гомогенными ядрышками оказалась выше по сравнению с кольцевидными.
Впервые показано, что пролиферативная активность Т- и В-лимфоцитов на определенных стадиях меняется: в начальной и развернутой стадиях количество ДНК-синтезирующих Т- и В-клеток почти одинаковое, а в терминальной стадии доминируют В-клетки. Впервые показано, что XII крупного рогатого скота является неоднородным заболеванием, которое проявляется в разных вариантах: наиболее часто встречается В-клеточный вариант, реже - Т-клеточный и тимома.
Выявленное соотношение Т- и В-лимфоцитов, их морфологические особенности и функциональная активность на разных стадиях ХМ позволяют уточнять диагноз и прогнозировать данное заболевание.
На основе полученных данных разработаны методические рекомендации: "Исследование метаболизма нуклеиновых кислот в Т- и В-лимфоцитах при хроническом лимфолеикозе крупного рогатого скота" , вошедшие в сборник ВАСХНИЛа "Проведение цитологических, химических и иммунологических исследований лимфоцитов и их мембран у крупного рогатого скота" М., 1982. Изложенные в них методы применяются для оценки функционального состояния Т- и В-лимфоцитов и используются при изучении патогенеза и совершенствовании методов диагностики лейкозов животных, в Институте микробиологии им. Августа Кирхенштейна АН ЛатССР, в Белорусском НИИ экспериментальной ветеринарии юл. С,Н. Вышелесского, в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте MS СССР.
На защиту выносятся следующие основные положения:
- популяции Т- и В-лимфоцитов здоровых и больных ХМ животных являются гетерогенными и состоят из субпопуляций с разными размерами клеток и типом ядрышек в них;
- при развитии ХМ изменяется количественное соотношение Т-и В-клеточных популяций и их субпопуляций, степень изменения которого отражает определенную стадию заболевания;
- Т- и В-лимфоциты здорового КРС по размерам и по наличию в них определенного типа ядрышек не отличаются друг от друга, а также от клеток с аналогичными рецепторами больных ХМ животных;
- активность синтеза ДНК и РНК Т- и В-лимфоцитами связана с размерами их ядер и типом ядрышек в них;
- в ходе развития ХМ уменьшается количество ДНК- и РНК -II синтезируїощих Т-лшфопитов и увеличивается число В-лижІюцитов;
- хронический лимфолейкоз КРС является стадийным заболеванием и состоит из В-, Т-клеточного вариантов и тимомы;
- учет количественного соотношения Т- и В-клеточных популяций и их субпопуляций, а также числа ДЕК- и РНК-синтезирующих Т- и Б-клеток является дополнительными критериями при постановке диагноза и прогнозировании ХЛл.
