Введение к работе
; I.
Актуальность работы. В связи с концентрацией поголовья, большой плотностью размещения скота на единицу площади, постоянным притоком животных извне, погрешностями в кормлении и содержании создаются специфические условия, предрасполагающие к появлению и распространенно желудочно-кишечных болезней новорожденных телят, среди которых видное место занимает нєонатальная диарея; За последние годы накоплены данные об этиологической структуре диарей. Современная специальная литература свидетельствует о том, что диарея у телят может вызываться различными вирусами, среди которых важное значение имеют ротавирусн.
В 1969 году МеЪиз С.А. и др. установили роль ротавируса в возникновении диарей новорожденных телят. В большинстве случаев при высокой заболеваемости (до 100%), летальность колеблется от 15 до 80. За последние 10-15 лет зарегистрированы случаи обнаружения ротавирусов, вызывающих диарею у новорожденных телят во многих странах Западной Европы и других регионах планеты, в том числе и в нашей стране. Ротавирусный энтерит телят наносит животноводству большой экономический ущерб, обусловленный отходом телят, снижением привесов молодняка, затратами на лечение больных и проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.
Поэтому разработка эффективных мер специфической профилактики ротавирусных энтеритов является насущным вопросом настоящего времени. Однако без глубокого знания антигенных свойств возбудителя этой болезни указанную проблему решить невозможно.
Цель работы. Изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства штаммов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных из хозяйств различных регионов страны.
-г -
Задачи исследований:
выделить штаммы ротавируса от телят с клиническим проявлением диарей i: j хозяйств разных регионов страны;
получить на лабораторных животных гиперишунные сыворотки к выделении штаммам ротавируса;
изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства выделенных штаммов ротавируса;
- определить степень антигенного родства, доминантность
и различия выделенных штаммов.
Научная новизна. Изучены некоторые биологические свойства ротавируса крупного рогатого скота, выделенного в различных регионах страны, динамика накопления его в различных культурах клеток. Проведен электрофорезическии анализ РНК штаммов ротавируса .крупного рогатого икота. Дана сравнительная оценка чувствительности реакции нейтрализации, диффузионной преципитации в аг іе, метода иммуноферментного анализа и метода выделения вируса в культуре клеток при диагностике рогавирусных энтеритов телят. Впервые изучены антигенное родство, различия и доминантность штаммов ротавируса крупного рогатого скота, циркулирующего среди поголовья телят в различных регионах страны. Полученные экспериментальные данные создают научную основу для разработки эффективных средств специфической профилактики с использо'"здием доминирующих штаммов ротавируса.
Практическая ценность работы. Показана широта распространения ротавирусной инфекции среда поголовья телят в различных регионах страны. Рекомендован метод определения антигенного родства, различий и доминантности штаммов ротавируса крупного рогатого скота, даны критерии их оценки. Результаты диссертационной работы вошли в "Методические рекомендаций по определению антигенного родства, различий и дойинантноети штаммов и иэолятов ротавируса крупного рогатого скота методом ишуноферментного анализа",
- J -
которые одобрены Ученш советом ВИЭВ.
Апробация работы. Материалы диссертационной' работы доложены -и получили положительную оценку на научной конференции ВИЭВ "Проблемы иммунологии, физико-химической биологии и биотехнологии в инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (1986); научной конференции молодых ученых ВИЭВ "Проблемы ветеринарной биотехнологии и инфекционной патологии животных" (1987); заседании Ученого совета ВИЭВ (1987); научной конференции КазШВИ ВО ВАСХНИЛ "Вклад молодых ученых Казахстана в решение продовольственной программы страны", посвященной 118-ой годовщине со дня рождения В.Л.Ленина (Алма-Ата, 1988); научной конференции молодых ученых КазНЙВИ ВО- ВАСХНИЛ, посвященной 119-ой годовщине со дня рождения В.И.Ленина (Алма-Ата, 1989); научной конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Казахской ССР, посвященной 119-летию со дня ровдения В.И.Ленина (Алма-Ата, 1989), межлабораторном совещании ВИЭВ (1989).
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 4-х научннх работах.
Объем работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов^ выводов. Материалы диссертации иллюстрированы 17 таблицами, 6 рисунками. Список использованной литературы содержит 52 работы отечественных и 139 иностранных авторов.
*' 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и
профилактики вирусных желудочно-кишечных болезней крупного рога
того скота" ВИЭВ, в виварии лаборатории и на опытной базе
института о.Лисий Вышневолоцкого района Калининской области в
период І984-Г987 гг.
З опитах били использованы: референтный штамм ротавируса обезьян " sa И", штампы ротавируса крупного рогатого скота -референтна штамм " М? " (штамм Тиверваль, Франция), отечественный шташ "ВІ", выделенный из фекалий больного диареей теленка совхоза "Марьинский" Загорского района Московской области, а также семь полевых рої-авирусньк изслятов, выделенных из фекалий больных диареей телят из разкьк регионов страны {Амурской, Новосибирской, Ярославской областей РйЮР; Киргизии, Казахстана, Молдавии, Таджикистана).
Для поддержания штаммов и выделения ротавируса крупного рогатого скота использовали первично трипсиниоированные культуры клеток почки эмбриона коров (ПЭК), почки телят (ПТ) и их субкультуры, перевиваемые линии клеток: почек коров (МДБК), обезьяны макаки-резус MA-I04, зеленых мартышек (линия 4647), эмбриона свиньи (СиЭБ); легкого эмбриона коровы (ЛЭЮ, гибридная культура клеток - КД5-У (ШЭ+КЗЛ - клеток из килечника эмбрионов коров).
Культуры клеток выращивали по общепринятой методике. Перевивку культур проводили Cos центрифужным методом (Сергеев В.А,, 1963; Осидзе Н.Г., Сергее ІІ.А. и Суяков а.В., 1964). ііервично-трипсинизировашші культуон клеток \Ш, нТ и- их субкультуры, а также диплоидную культуру (ЛЭК) и перевиваемые лиши клеток СП8В получали в лаборатории технологии клеточных культур и питательных сред ВЯЭВ; гибридную культуру леток КДЬ-У любезно предоставила Майдки Е.В., аспирантка названной лаборатории. Культуры клеток МДШ и ЙА.-І04 культивировали сами в лабораторных условиях. Перевиваемая линия клеток почек зеленых мартышек (464?), бі„із получена из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (любезно предоставил канд.мед.наук Хаус-тов В.И.). Вируссодержащие положительные в РД[1 или Шк пробы (суспензии фекалий и кусочков тонкого отдела киаечнюсив). перед заражышеи культуры клеток фильтровали через фильтры "Миллипор"
с диаметром nop 0,45'Н . Использовали различные варианты обработки испытуемого материала и различные концентрации трипсина (от 15 до ЗСО нг/мл). Размножение вируса в культурах устанавливали по проявлений цитопатогенного действия (4W). а также титрованием полученного мегериала методом Шк, РН.
Концентрирование и очистку рогавируса проводили методом ультрацентрифугирования в линейном градиенте плотности сахарозы (совместно со старшим научны* сотрудником лаборатории биофизики Г.А.Надточим); комбинированным методом (полиэтиленгликоль+сульфат аммония); фреоном ИЗ по общепринятой методике.
Гипериммунныа антиротавирусные сыворотки к ротавирусным антигенам получали на кроликах по разработанным в" лаборатории схемам. Гипериммунизацига проводили с интервалом 21 день.
Для у ;ентифлкации и количественного определения ротавирус-ного антигена, а также специфических антител к нему применяли реакцию диффузионной преципитации (РД1), метод иммуноферментного анализа (ИФА), для определения их инфекционных титров - титрование вируса в культуре клеток, для выявления составных сегментов двухнитевой (дн) РЖ ротавирусюго генома - электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). Постановку РД1 и Шк осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями, разработанными в лаборатории. 9 в ПААГ ставили совместно с научными "сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и биохимии Артшиным С.К, и Гращук В.Н. по методике Іаешпіі (1970). Для ввделения дн РНК ротавируса очищенные вирусные частицы подвергали депротеннизации. Для этого к очищенному вирусу добавляли додецилсульфат натрия (0,5) и инкубировали в течение 60 мин. при 37С. Экстракцию вирусной РНК проводили стандартным фенольним методом. Профиль миграции сэгментов двухнитевой РНК получали диск - электрофорезом в слое IOfS разделяющегося полиак-. риламидного геля.
- б -
Степень антигенного родства, доминантность и различия между штаммами и изоляташ ротавируеов определяли по результатам РН, РД], ИФА. Дни вычисления степени антигенного родства использовали формулу Архетти и Хорсфалла (1950); доминантность вычисляли по формуле, описанной. Ыореа и соавт. (1971); для определения различий использовали формулу Прискока В.А, (1983).
Всего по серологическим реакциям исследовано с повторностью 253 пробы вируссодерж&щей культуральной жидкости, 375 проб фекалий, 42 пробы кишечников от павших телят, 38 проб сывороток крови телят, Ь7 проб молозива и 103 пробы сывороток крови от коров-матерей из 35 хозяйств 12 регионов страны. В проведенных експериментах использовали 21 кролика, двух телят.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятым методам (Сюрин В.Я., 1966; Лакин Г.Ф., 1930; Лярски 3., 1980).
Похожие диссертации на Антигенные свойства штаммов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных в различных регионах страны
