Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1. 1. История систематики рода Galeopsis L 7
1. 1. 1. Значение работ Miintzing для систематики рода Galeopsis 14
1. 2. Химический состав и полезные свойства видов рода Galeopsis 20
1. 2. 1. Фенольные соединения 20
1. 2. 2. Иридоиды 29
1. 2. 3. Терпеноиды 33
1. 2, 4. Полезные свойства видов рода Galeopsis 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 41
ГЛАВА 3. Морфологический анализ видов рода Galeopsis .43
ГЛАВА 4. Спорные вопросы систематики рода Galeopsis..M
4. 1. Таксономические границы рода Galeopsis 61
4. 2. Отношения G. tetrakitnG. bifida 66
4. 3. Что такое G. pernhqfferil 74
ГЛАВА 5. Конспект рода Galeopsis 78
ГЛАВА 6. Фотохимический анализ некоторых видов рода Galeopsis флоры России 109
6. 1. Применение метода газовой хроматографии в анализе спиртовых экстрактов растений 109
6. 2. Особенности метода предколоночного силилирования 110
6. 3. Компонентный анализ экстрактов видов рода Galeopsis 113
ГЛАВА 7. Особенности биологии некоторых видов рода Galeopsis 122
7. 1. Биология прорастания эремов видов рода Galeopsis 122
7. 2. Сезонный ритм развития 130
7. 2. 1. Семенная продуктивность 137
ГЛАВА 8. Пути использования видов рода galeopsis 142
Выводы 145
Литература 147
- Значение работ Miintzing для систематики рода Galeopsis
- Таксономические границы рода Galeopsis
- метода газовой хроматографии в анализе спиртовых экстрактов растений
- Биология прорастания эремов видов рода Galeopsis
Введение к работе
Актуальность темы. Род Galeopsis L. - пикульник, является небольшим, но сравнительно сложным в таксономическом и номенклатурном отношении родом типового подсемейства сем. Lamiaceae. По современным представлениям он содержит 10 видов, распространенных на большей части Евразии (Harley et al., 2004). В России встречается 6 видов этого рода. Занимая достаточно широкий ареал, этот род вошел в большинство крупных флористических сводок, однако до сих пор нет единого мнения в отношении таксономических границ как рода в целом, так и надвидовых и видовых таксонов. Сложность систематики этого рода во многом определяется активными процессами межвидовой гибридизации, затрудняющими понимание границ видов и подродов.
Последняя монография рода в мировом масштабе была выполнена S, Briquet в 1893 году, со времени которой накоплен значительный фактический материал частично подтверждающий, а частично опровергающий точку зрения монографа. Виды рода для территории России обрабатывались во "Флоре СССР" С. Юзепчуком в 1954 году, а позднее - во многих региональных флорах (Клоков, 1960; Козловская, 1967; Чернева, 1970; Гладкова, 1972; Пробатова, 1995; Доронькин и др., 1997 и др.).
Одной из важных особенностей рода Galeopsis по сравнению с другими родами Lamiaceae является своеобразие процессов вторичного метаболизма, заключающегося в том, что его виды практически не накапливают эфирных масел, но богаты такими биологически активными и таксономически значимыми соединениями, как, дитерпеноиды и иридоиды. В тоже время, хемотаксономические признаки фрагментарно использовались для решения спорных вопросов систематики рода. Вопросы биологии видов Galeopsis, которые являются
в большинстве своем сорными растениями с высокой степенью плодовитости, также ранее подробно не исследовались.
Многие виды данного рода имеют практическое значение. Разные виды пикульника находят применение в народной медицине, обладая ранозаживляющими, отхаркивающими, противовоспалительными и другими свойствами и используются при заболеваниях дыхательной системы, болезнях органов пищеварения, кожных и других заболеваниях (Растительные..., 1991; Дикорастущие..., 2001). В практической медицине Центральной Европы применяется надземная часть G. segetum Neck, при хроническом бронхите, эмфиземе легких, а также в гомеопатии при болезнях мочевого пузыря и почек (Палов, 1998).
Изучение вопросов морфологии, систематики и геогафии видов данного рода приобретают особую актуальность, так как делает возможным точную диагностику и способствует направленному поиску полезных свойств изучаемых видов. Применение же в аналитической практике современных методов хроматографии (ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ и др.) позволяет определить строение целого ряда соединений и выделить из видов этого рода ранее не указываемые для них соединения.
Все вышеперечисленное свидетельствует о необходимости комплексного систематического, биологического и фитохимического изучения видов рода Galeopsis на основе доступного фактического материала и современных методик.
Цели и задачи исследования. Основной целью данного исследования было изучение систематики рода Galeopsis в мировом масштабе, уточнение географического распространения, экологии, исследование особенностей биологии развития и компонентного состава основных биологически активных соединений его видов флоры России.
Основные задачи; 1. На основе изучения гербарных коллекций, личных сборов и наблюдений, провести таксономическую ревизию видов рода Galeopsis
флоры России с решением ряда спорных вопросов систематики этого рода и оценкой признаков, в том числе и химических, имеющих таксономическую значимость.
Составить оригинальный конспект рода, включающий все необходимые для подобных конспектов разделы.
Провести анализ географического распространения видов, обращая внимание на границы их ареалов на территории России.
Изучить особенности онтогенеза, в том числе - семенной продуктивности, ритмики сезонного развития видов флоры России.
Разработать метод предколоночного силилирования на основе газовой хроматографии и применить его для изучения компонентного состава растительных экстрактов видов рода Galeopsis.
Научная новизна. В результате таксономической обработки уточнен видовой состав рода во флоре России; пересмотрено положение 2 видов. Уточнены синонимика, номенклатура, а также сведения об экологической приуроченности и географическом распространении представителей рода во флоре России. Составлен ключ для определения, а также построены ареалы видов точечным и контурным способами. На основе газовой хроматографии был разработан метод предколоночного силилирования, который сочетает в себе относительную простоту реализации и большую широту применимости. Данный метод показал высокую эффективность разделения экстрактов, специфичность и воспроизводимость результатов. Проведена предварительная фитохимическая оценка трех видов рода Galeopsis, произрастающих на территории России. Одновременно были разделены и идентифицированы более 50 соединений из группы углеводов, органических, жирных и фенольных кислот, дитерпенов, фитостероидов и иридоидов.
Практическое значение. Материалы диссертации могут быть использованы для региональных флористических сводок и
"Определителей", в ресурсоведческих исследованиях. Разработанный метод предколоночного силилирования может быть использован без предварительного фракционирования для контроля качества сырья и анализов водно-спиртовых растительных экстрактов и настоек.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004), на научно-практической конференции "Теоретические и прикладные исследования в ботанике" (Белгород, 2005), III Международной конференции "Проблемы изучения растительного покрова Сибири" (Томск, 2005) и IX Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав и выводов. Основной текст изложен на 159 страницах, иллюстрирован 10 таблицами, 38 рисунками и фотографиями; даны ареалы видов в мировом масштабе. Список литературы включает 159 названий (61 - отечественных и 98 - зарубежных авторов).
Значение работ Miintzing для систематики рода Galeopsis
Большое значение для систематики рода Galeopsis оказали классические работы, проведенные A. Miintzing с 1927 по 1938 годы ((Miintzing, 1927, 1930, 1932, 1938). Работая практически со всеми видами этого рода, он, на основании морфологических, цитологических и генетических исследований установил, что виды рода Galeopsis образуют 3 различных, непересекающихся естественных группы к (coenospecies): группа Ladanum (G. reuteri, G. ladanum, G. pyrenaica, G. segetum и G.angustifolia); группа G. pubescens-G. speciosa и G. tetrahit-G. bifida (табл. 1). Каждая группа образует различные эковиды, которые гибридизируют в природе. Видообразование регулируется естественным отбором, особенно выраженным в группе G. tetrahit-G. bifida.
Miintzing изучил гибриды видов подрода Ladanum до второго и третьего поколения. Бесплодие у этих гибридов выборочно и, чаще всего, причины его заключаются в том, что при скрещивании идет образование гамет с различным количеством хромосом, и многие их сочетания нежизнеспособны (Miintzing, 1927, 1930, 1932). Виды подрода Galeopsis являются полиморфными, а сильно выраженная внутривидовая изменчивость связана со спорадически встречающейся гибридизацией, причем, промежуточные комбинации признаков в большинстве своем эллиминируются естественным отбором (Miintzing, 1938). Для большинства видов рода Galeopsis характерно сочетание самоопыления с перекрестным опылением: низкий уровень перекрестного опыления у них компенсируется спонтанным самоопылением, т. е. они являются алло- и автогамными растениями. Исключения составляют G. segetum, G. speciosa, G. tetrahit и G. bifida. Первые два вида являются аллогамными, т.е. перекрестно опыляемыми растениями. В условиях изоляции они образуют очень мало эремов, поскольку естественное самоопыление у них подавлено, но после искусственного самоопыления они образуют достаточное количество жизнеспособных плодов.
G. tetrahit и G. bifida, напротив, в значительной степени являются автогамными видами и формообразование у них основано на процессах самоопыления.
При скрещивании диплоидных (G. speciosa, G. pubescens, 2п=16) и тетраплоидных (G. bifida, G. tetrahit, 2n=32) видов идет образование плодов, но они всегда нежизнеспособны. Напротив, G. tetrahit и G. bifida имеют гибридное происхождение, родительскими видами которых являются G. speciosa и G. pubescens или близкие к ним растения, что было показано Muntzing экспериментально (табл. 2).
Для доказательства этого, A. Muntzing (1930, 1932) проводил опыты по скрещиванию, вовлекая 26 чистых линий G. pubescens Bess. (2п=16) и G. spesiosa Mill. (2n=16). Среди потомства в первом поколении были гибриды (2n = 16) с незначительной фертильностью пыльцы; при самоопылении гибридов F], было получено 197 растений второго поколения. Гибриды F2 были диплоидны (2п = 16) и триплоидны (2п = 24), у последних среди многочисленной стерильной пыльцы был незначительный процент фертильной пыльцы, а также триплоиды имели мелкие цветки и по этому признаку очень походили на природный G. tetrahit, поэтому были названы Muntzing G. pseudotetrahit. При обратном скрещивании G. pseudotetrahit с G. pubescens были получены тетраплоидные экземпляры (2п=32), которые оказались идентичными природному G. tetrahit по морфологическим признакам. Более того, они не скрещивались с родительскими видами, но скрещивались с произрастающими в естественных условиях G. tetrahit.
Таким образом, полученный G. tetrahit представляет собой искусственный аллотетраплоид, образование которого проходило в 2 этапа. На первом этапе произошло образование Зп-зиготы в результате слияния 2п- и п-гамет, а на втором - слияние нередуцированной Зп-гаметы с нормальной п-гаметой.
По мнению A. Muntzing (1932), G. bifida, также как и G. tetrahit, имеет гибридогенное происхождение, только если G. tetrahit возник в результате скрещивания гибрида G. pubescens х G. speciosa с G. pubescens, то G. bifida теоретически мог возникнуть от скрещивания G. pubescens х G. speciosa с G. speciosa. Действительно, G. bifida, как и G. tetrahit, является тетраплоидом, а скрещивание G. bifida с диплоидными видами подрода Galeopsis не дает жизнеспособного потомства.
Таксономические границы рода Galeopsis
В 1891 году О. Kuntze установил род Ladanum О. Kuntze, в который включил 2 вида Galeopsis, описанные Линнеем в 1753 году, и сделал соответствующие комбинации - Ladanum dubium О. Kuntze (=G. ladanum L.), Ladanum tetrahit O. Kuntze (=G. tetrahit L.). Род Ladanum обнародован Kuntze посредством ссылки на работу Линнея 1735 года (Linnaeus, 1735), в которой имеется ссылка на работу J. Dillenius (1719), где дано краткое описание Ladanum. Однако, Ladanum оказалось незаконным названием (более поздним омонимом по отношению к названию Ladanum Rafin. (Rafinesque, 1838), поэтому использовать его нельзя. Заметим, что тип Ladanum ко времени его обнародования не был обозначен, так же, как и для рода Galeopsis.
Лектотип рода - G. tetrahit L. - был выбран в 1913 году N. Britton и A. Brown (Britton, Brown, 1913).
Z. Slavikova (1963) предложила разделить род Galeopsis L. на 2 самостоятельных рода: Galeopsis и Ladanum. В состав первого вошли уже законно опубликованные комбинации: G. tetrahit L., G. speciosa Mill., G. pubescens Bess., G. bifida Boenn. Для остальных видов Slavikova предложила новые комбинации: Ladanum intermedium (Vill.) Slavikova (= G. ladanum), Ladanum angustifolium (Ehrh. ex Hoffm.) Slavikova (= G. angustifolia) и Ladanum ochroleucum (Lam.) Slavikova (= G. segetum). Типом вновь описанного рода был предложен Ladanum intermedium (Vill.) Slavikova.
J. Dostal (1984) предложил для рода Ladanum 0. Kuntze заменяющее название - Dalanum Dostal nomen novum. Приведя описание рода Dalanum. он не указал его типа, поскольку nomen novum, согласно "Международному кодексу ботанической номенклатуры" (Международный..., 2001) (МКБН) типифицируется типом незаконного названия. Z. Pouzar и Z. Slavikova (Pouzar, Slavikova, 2000) справедливо указали, что род Ladanum О. Kuntze таксономически идентичен роду Galeopsis L. и поэтому название Ladanum должно быть типифицировано видом L. tetrahit (L.) О. Kuntze. Pouzar и Slavikova назвали род Ladanum изонимом, однако его нельзя считать изонимом в смысле МКБН. Родовое название Ladanum О. Kuntze является незаконным не только как более поздний омоним, но и как название, излишнее в номенклатурном отношении, в соответствии со статьей МКБН (статья 63.1: "...название является незаконным и должно быть отвергнуто, если в номенклатурном отношении оно было излишним при обнародовании, т. е. если таксон, для которого оно было применено, в тех границах, которые были даны ему его автором, включал тип какого-то названия или эпитета, которые должны были быть приняты согласно настоящим правилам..."). Род Ladanum включает оба вида рода Galeopsis L. в его первоначальном объеме (Linnaeus, 1753), пригодных в качестве типа, т.е. G. ladanum и G. tetrahit. Как было отмечено выше, 2 других вида, включенных Линнеем в род Galeopsis, не пригодны в качестве типа Galeopsis, так как один из них принадлежит к роду Stachys L. (Stachys ocymastrum (L.) Briq. Lab. Alp. Mark. 252 (1893) (= S. hirta L. Galeopsis hirsuta L.)), другой - в 1763 году выделен в самостоятельный род Galeobdolon Adans. (Adanson, 1763). Согласно статье 7.5(11) МКБН, "...названия или эпитеты, бывшие в номенклатурном отношении излишними при обнародовании, автоматически типифицируются типами тех названий или эпитетов, которые должны были быть приняты согласно правилам, если только авторами этих излишних названий или эпитетов не были указаны определенные типы...". В данном случае, излишнее название Ladanum должно быть типифицировано типом приоритетного названия Galeopsis L. - G. tetrahit L. Следовательно, и типом названия Dalanum Dostal nom.
nov. является также G. tetrahit L. В связи с этим, название Dalanum становится номенклатурным синонимом названия Galeopsis, т. к. оба названия основаны на одном и том же типе (Тюнникова, 2006).
Таким образом, название Dalanum Dostal не может употребляться вместо Ladanum О. Kuntze. Правильным названием для Ladanum s. str. (т. е. исключая G. tetrahit), является родовое название Ladanella Pouzar et Slavikova (Pouzar, Slavikova, 2000) как genus novum, снабженное латинским описанием и указанием типа - G. ladanum L., хотя точным обозначением типа было бы - Ladanella ladanum (L.) Pouzar et Slavikova (=G. ladanum L.). В род Ladanella авторы включили 3 вида: Ladanella ladanum (L.) Pouzar et Slavikova, L. angustifolia (Ehrh. ex Hoffrn.) Pouzar et Slavikova и L. segetum (Necker) Pouzar et Slavikova.
Основными диагностическими признаками рода Ladanella являются более короткие по сравнению с видами Galeopsis стебли, отсутствие утолщений под узлами побегов, отсутствие в опушении щетинковидных волосков, более узкие листья, значительно более короткие (по сравнению с центральной долей) боковые доли нижней губы венчика (Slavikova, 1963; Slavikova, 2000; Pouzar, Slavikova, 2000).
Для оценки значимости приведенных признаков нами были исследованы G. tetrahit, G. speciosa, G. bifida, G. pubescens; и представители рода Ladanella: L. ladanum, L. angustifolia в естественных условиях их обитания (Ленинградская область, Калининградская область, Псковская область) и в гербарных коллекциях.
метода газовой хроматографии в анализе спиртовых экстрактов растений
Обычной практикой анализа многокомпонентных систем является применение современного хроматографического оборудования с использованием разделения смесей на отдельные соединения, для чего, чаще всего, используется масс-спектрометрия. Необходимым дополнением такой аналитической системы являются компьютерные программы для обработки информации, поскольку, например, сопоставление данных для 100-компонентной смеси, с использованием масс-спектрометрической библиотеки из 100000 записей, без помощи вычислительной техники - задача практически невыполнимая.
В настоящее время наибольшее распространение имеют аналитические комплексы на основе комбинации капиллярного газового хроматографа и масс-спектрометра. К сожалению, для анализа природных соединений этот метод имеет ограничения, т. к. необходимым условием является летучесть анализируемых веществ. Существуют аналитические подходы только для анализа эфирных масел (их летучих фракций) с использованием хромато-масс-спектрометрического оборудования и соответствующего программного обеспечения (Adams, 2001). Решение аналогичной задачи для менее летучих природных соединений, которые, как правило, составляют большую часть растительных экстрактов, пока еще затруднительно, главным образом, из-за малой доступности аналитических комплексов класса высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометра. Даже при наличии такой аппаратуры, особенности масс-спектрометрической информации не позволяют использовать уже существующие базы данных для идентификации разделенных компонентов.
Когда методы, основанные на подтверждении присутствия в них компонентов, характерных для каждого вида сырья, неприменимы из-за совпадения химических и хроматографических свойств или взаимомешающего влияния, предлагается прием сравнения хроматографических профилей (Зенкевич и др., 2003). Данный метод, называемый в англоязычной литературе fingerprints - отпечатки пальцев или pattern recognition - распознавание образов, не требует идентификации отдельных компонентов, поскольку если рассматривать хроматограммы многокомпонентных смесей как одну из разновидностей спектральной формации, ТО; применяя метод хроматографических профилей, идентифицируется не отдельные вещества, а образец в целом (Макаров и др., 2000). Этот метод имеет смысл использовать при оценке сходства и различий водно-спиртовых и масляных экстрактов, для контроля качества сырья, а также для определения его подлинности.
Вместе с тем, ограничения метода газовой хромато-масс-спектрометрии, связанные с низкой летучестью большинства природных метаболитов могут быть существенно уменьшены при использовании таких способов подготовки проб в капиллярной газовой хроматографии, как предколоночное силилирование (Blau, Halket, 1993).
Метод предколоночного силилирования позволяет придать большую летучесть соединениям, содержащим гидроксильные, карбоксильные и аминогруппы, посредством существенного понижения их полярности, тем самым делалая доступными их для анализа методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Получение силильных производных, например, для случая донора триметилсилильной (TMS) группы, может быть представлено схемой, в которой показаны функциональные группы до и после взаимодействия с триметилсилильным агентом:
Для успешного применения подобной предколоночной модификации необходимо добиться полноты реакции силилирования и отсутствия побочных процессов. Показано, что спирты и кислоты достаточно легко и полностью силилируются с образованием простых или сложных эфиров (Sweely et al., 1963). Редкие случаи образования артефактов специально описаны (Little, 1999).
Специфика при силилировании углеводов, обусловленная образованием таутомерных форм Сахаров, при растворении исследуемого образца в пиридине, тоже хорошо изучена (Bentley, Botlock, 1967; Yamabe, 1999; Le Barc h et al., 2000). Поскольку углеводы содержат ассимметричные углеродные атомы, мы встречаем большое число стереоизомеров, которые в определенных условиях легко переходят друг в друга (явление таутомерии). Все таутомерные формы углеводов силилируются и выходят на хроматограмме отдельными пиками, например, теоретически возможно наблюдать на хроматограмме в случае глюкозы все 5 форм (2 пиранозные, 2 фуранозные и альдольную форму). Однако, практически в пиридиновом растворе равновесие сдвинуто в сторону образования пиранозных форм и на хроматограмме мы получим только пики иен/шкис-[триметилсилил]глюкопиранозы
Биология прорастания эремов видов рода Galeopsis
По мере хозяйственного освоения территорий и усилившейся урбанизации в промышленно-развитых регионах, роль адвентивных элементов в естественных флорах постоянно растет. Способность к освоению новых, особенно нарушенных территорий, в большей степени характерна для однолетних сорных растений, связанных с природно-хозяйственной деятельностью человека. Одной из отличительных особенностей стратегии, позволяющей большинству сорных однолетников достигнуть максимальной продуктивности, является обильное плодоношение мелкими семенами при относительно небольших размерах вегетативных органов. У некоторых сорняков флоральная часть фактически доминирует в системе надземных частей.
Как известно, к числу типично сорных растений принадлежат виды рода Galeopsis, биология развития которых остается не исследованной, хотя их высокая плодовитость отмечалась многими авторами (Грохольский, 1932; Доброхотов, 1961; Thompson, 1969; Сафиуллин, 1971). В этой связи мы попытались проследить особенности сезонного ритма развития и биологии прорастания плодов пикульников.
Материалом для исследований послужили эремы 6 видов рода Galeopsis, собранные нами в 2004 году в Ленинградской, Псковской, Калининградской областях, а также полученные из Украины (табл. 8).
Проращивание эремов проводили в лабораторных условиях в чашках Петри на увлажненных водой фильтрах по 100 шт. в 3-х кратной повторности при t 0 - 3 С и t 23 С на свету и в темноте. Часть эремов стратифицировали при 10 - 3 С с последующим переносом (через 15 и 30 дней) на t 23 С. Опыт продолжался 60 дней, подсчет проросших эремов проводился ежедневно. Всхожесть оценивали по отношению количества проросших эремов к количеству заложенных на проращивание, выраженному в процентах. ТАБЛИЦА 8.
Сравнение массы 1000 эремов исследуемых видов показало, что она пропорциональна размерам эремов. Так, максимальной массой характеризовались эремы G. speciosa (3.20±0.01 г), минимальной - G. ladanum (1.20±0.02 г) (табл. 8).
Прорастание эремов исследуемых видов рода Galeopsis было непродолжительным (рис. 34). В среднем, независимо от режима проращивания, начало прорастания у G. tetrahit, G, speciosa, G. pubescens и G. bifida отмечено 5-13-е сутки опыта, G. ladanum и G, angustifolia - на 12-23-е сутки. Энергия прорастания врервые 15 дней опыта у исследуемых видов не превышала 16 % от общего числа проросших эремов. Максимальное их количество проросло на 30-45-е сутки опыта, и этот показатель составил от 2.6 до 17 % от общего числа эремов, заложенных в опыте (относительно общего числа проросших плодов этот показатель составил 17-96 %).
Результаты исследований показали, что оптимальной температурой при проращивании эремов пикульников является +23 С на свету (рис. 35). На 60-й день опыта максимальная лабораторная всхожесть при этом режиме была отмечена у G. tetrahit, и в среднем составила 60 %, у G. ladanum этот показатель соответствует 56 %, у G. angustifolia и G. speciosa по 54 %, у остальных видов (G. pubescens и G. bifida) - не превысил 50 %. При данном температурном режиме и освещенности наблюдается и максимальная энергия прорастания практически для всех видов. Так, на 10-е сутки проросло 13 % эремов G. tetrahit. Интенсивным прорастанием характеризуются и другие виды, всхожесть которых достигала 12-14 % на 17-й {G. pubescens), 25-26-й (G. angustifolia, G. speciosa) и 29-й дни опыта (G. bifida). Исключением является G. ladanum, максимальное количество долей плода которых проросло только на 42-е сут опыта и их энергия прорастания была единичной (7%).
При проращивании эремов при температуре + 23 С, но в темноте, процент проросших плодов существенно снизился, не превышая, например, 14 % у G. ladanum, по сравнению с 56 % в условиях освещенности. У G. pubescens произошло снижение с 41 до 18 %; а у G. angustifolia - с 54 до 10 %.
