Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы
1.1. Таксономическая структура семейства Asteraceae 6
1.2. Строение спородермы семенных растений 6
1.3. Строение спородермы представителей семейства Asteraceae 9
1.4. Морфогенез спородермы семенных растений 13
1.5. Основные особенности развития спородермы у представителей семейства Asteraceae 22
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Световая микроскопия 25
2.2. Сканирующая электронная микроскопия 26
2.3. Трансмиссионная электронная микроскопия
2.3.1. Методика исследования зрелых пыльцевых зерен 26
2.3.2. Методика исследования развивающихся пыльцевых зерен 27 А
Список сокращений, принятых в тексте 30
Список сокращений к микрографиям 30
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Строение оболочки пыльцевых зерен исследованных представителей семейства Asteraceae 32
3.2. Основные стадии развития спородермы у представителей семейства Asteraceae 57
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Строение спородермы зрелых пыльцевых зерен исследованных А видов 178
4.2. Развитие спородермы представителей семейства Asteraceae 180
4.2.1. Формирование и развитие примэкзинового матрикса и примэкзины 181
4.2.2. Формирование основных элементов оболочки пыльцевого зерна (эктэкзины, эндэкзины и интины) 184
4.2.3. Формирование апертур 186
4.3. Эволюционный статус ламеллятной эндэкзины 187
4.4. Формирование признаков разного таксономического уровня 188
4.5. Возможность периодизации процесса развития спородермы 189
Заключение 191
Выводы 193
Литература 195
- Строение спородермы представителей семейства Asteraceae
- Методика исследования зрелых пыльцевых зерен
- Основные стадии развития спородермы у представителей семейства Asteraceae
- Формирование основных элементов оболочки пыльцевого зерна (эктэкзины, эндэкзины и интины)
Введение к работе
Внутренняя структура спородермы - оболочки пыльцевых зерен - а также скульптура их поверхности весьма специфичны для порядков, семейств, а нередко для родов и даже видов (Van Campo, 1976). Поэтому палинологические данные незаменимы при решении широкого круга теоретических и прикладных вопросов не только биологии, но и геологии, медицины и др. Они важны для систематики растений, поскольку строение пыльцевых зерен зачастую позволяет точнее, чем иные признаки выявить филогенетические связи разных таксонов, в особенности ископаемых. Не менее значимы данные палинологии в стратиграфии, без которой невозможны геоморфология, геохронология и геологическая разведка ресурсов (Палинология в стратиграфии, 1994). Детальное знание организации спородермы весьма актуально для биоиндикации окружающей среды (Дзюба, 1999), некоторых направлений медицины - в первую очередь аллергологии (Емельянов, Дзюба, 2005), а также находит применение в криминалистике (Токарев и др., 2005).
Однако изучение только зрелых пыльцевых зерен не всегда дает возможность получить исчерпывающую и адекватную информацию о строении спородермы. В ряде случаев оно приводит к грубым ошибкам в интерпретации данных, т.к. в сформированной оболочке некоторые слои часто бывают плохо или совсем неразличимыми (Габараева, 19876), иногда в процессе развития резко меняются их размерные соотношения (толщина), а о способе заложения тех или иных структур остается только догадываться. Следует также отметить, что в ходе исследований зрелые пыльцевые зерна обычно подвергают достаточно жесткой обработке (ацетолиз, длительное воздействие 96, 100 спиртов, перманганата калия, щелочей), в результате которой могут возникать артефакты. В частности, иногда становится проблематичным разграничение отдельных слоев оболочки (например, эндэкзины и подстилающего слоя эктэкзины), а в некоторых случаях, например при ацетолизе, полностью исчезают интина и трифина. Поэтому
наряду с изучением морфологии сформировавшихся пыльцевых зерен необходимо проводить исследования по развитию пыльцевых зерен в разных таксономических группах. Это позволяет установить последовательность и способ отложения всех слоев оболочки (Мейер, 1971) и тем самым получить важную информацию для правильной гомологизации структур спородермы, без которой невозможно проследить вероятные пути эволюции оболочки пыльцевого зерна (Мейер, 1980; Мейер-Меликян, 1998, 1999, 2000; Мейер-Меликян, Полевова, 2001; Тельнова, Мейер-Меликян, 2002; Erdtman, 1960; Meyer-Mel ikyan, 1998, 1999, 2000). Изучение генезиса спородермы показывает роль в этом процессе органелл протопластов микроспор, пыльцевых зерен и тапетальных клеток, что важно для понимания закономерностей функционирования отдельных клеток и их взаимодействующих ансамблей в морфогенезе растительного организма, в том числе участие в этом процессе спорофита и гаметофита. Четкую и полную палиноморфологическую терминологию также можно разработать только с учетом сведений о развитии оболочек пыльцевого зерна.
Возможности морфогенетических исследований спородермы были
чрезвычайно расширены благодаря появлению и использованию в
палинологии электронных микроскопов (сканирующего и
трансмиссионного). Поскольку произошло это сравнительно недавно (в начале 1960-х г.г.), палинология оказалась на этапе накопления фактической информации, когда данные по многим важным группам семенных растений фрагментарны или отсутствуют совсем. Такое положение вещей осложняет решение некоторых проблем самой палинологии и ограничивает область применения ее результатов в других дисциплинах и практике.
Вследствие этого перед палинологами стоит насущная задача детального изучения развития оболочек пыльцевых зерен в разных таксонах цветковых растений, в первую очередь тех, которым свойственно высокое палиноморфологическое разнообразие. Среди таких таксонов особый интерес представляет семейство Asteraceae благодаря значительному
разнообразию и большой сложности строения спородермы у его представителей. Хотя сложноцветные не раз становились объектом исследования палинологов, морфогенез спородермы изучен лишь у ничтожно малой части этого огромного таксона, причем начальные этапы формирования некоторых элементов спородермы до сих пор по существу не выявлены.
Цель данной работы - изучение развития пыльцевых зерен Asteraceae на модельных объектах, принадлежащих к разным трибам и имеющим разные ультраструктурные типы строения оболочки.
Задачи исследования:
Изучение ультраструктуры и ультраскульптуры зрелых пыльцевых зерен с помощью сканирующего и трансмиссионного электронных микроскопов.
Исследование развития оболочек микроспор и пыльцевых зерен с разными типами ультраструктуры и ультраскульптуры.
Уточнение роли клеточных органелл в формировании спородермы в целом и ее отдельных элементов.
Выявление общих закономерностей развития спородермы у астровых и составление базовой схемы этого процесса для Asteraceae.
Строение спородермы представителей семейства Asteraceae
Пыльцевые зерна всех сложноцветных относят к трех-бороздно-оровому апертурному типу, т.е. для них характерны сложные апертуры. Поверхность пыльцевых зерен может быть эхинатной (шиповатой), эхинолофатной (с шипами и лакунами), а иногда просто лофатной (лакуны без шипов) (Wodhouse, 1926, 1935). Шиповатая скульптура характерна для большинства представителей подсемейства Asteroideae (Чигуряева, Терешкова, 1984; Бовина, Полевова, 1998; Мейер-Меликян и др., 2004; Bovina et al., 2000; Keeley, Jones, 1979; Skvarla, Larson, 1965) и некоторых Cichorioideae (Hansen, 1991).
Своеобразно скульптурированные эхинолофатные пыльцевые зерна характерны в основном для подсемейства Cichorioideae (Feuer, Tomb, 1977). Они развиваются у представителей триб Lactuceae, Cardueae, Liabeae (Blackmore 1981, 1982a,b; Javeid, 1991; Robinson, Marticorena, 1986; Tomb, 1975; Tomb et al., 1974; Saad, 1961; Vasanthy et al., 1993). Эхинолофатное строение экзины обуславливает правильную геометрическую форму пыльцевого зерна в целом. Число и форма лакун стабильны в группах родов. Все это позволило разработать детальную систему описания морфологии пыльцевых зерен цикориевых, где каждая лакуна имеет свое название (Аскерова, 1970; 1973). Обычно выделяют (Мейер-Меликян и др., 2004) апертурные лакуны - лакуны содержащие апертуры, надапертурные (по Л.А. Куприяновой (1972), неапертурные, или абапертурные) - лакуны, расположенные над ними, и околоапертурные (по Л.А. Куприяновой (1972), приапертурные, или параапертурные) - лакуны, лежащие между апертурными. Дополнительные признаки дает изучение деталей скульптуры гребней и полярных утолщений (Пыльца и споры..., 1972), которые могут быть треугольными и шестиугольными. На гребнях, как правило, располагаются шипы, идущие в один или несколько рядов (Мейер-Меликян и др., 2004)
Пыльца видов из подсемейства Barnadesioideae (Zhao et al., 2000) часто бывает с мелкошипиковои поверхностью, а у некоторых представителей на пыльцевых зернах формируются депрессии, вполне гомологичные лакунам цикориевых.
Однако более интересно внутреннее строение спородермы представителей семейства Asteraceae. В настоящее время разными авторами выделено несколько групп с различными структурными типами оболочки пыльцевых зерен сложноцветных.
Детальное изучение спородермы большого числа видов Asteraceae, впервые было предпринято Е. Stix (1960). Используя ультрафиолетовую световую микроскопию, она подробно описала внутреннее строение пыльцевых зерен представителей 13 триб и показала, что многие из них, имея сходную скульптуру, различаются по ультраструктуре. На основании признаков внутреннего строения спородермы Е. Stix выделила 42 морфологических типа пыльцевых зерен.
В работе Л.А. Куприяновой и Л.А. Алешиной (1972), также выполненной на световом уровне, палиноморфология сложноцветных рассмотрена с таксономической точки зрения. Обнаруженные у представителей трибы латуковых (цикориевых) эхинолофатные пыльцевые зерна позволили авторам рассматривать эту группу как самостоятельное семейство. Пыльца сложноцветных в узком смысле была поделена ими на две большие группы: пыльцевые зерна, имеющие просвет между подстилающим и нижележащими слоями и не имеющие такого просвета. В пределах первой группы, в свою очередь, они выделили еще два типа. Вторую группу авторы аналогично Е. Stix разделили на подтипы по тонкому строению спородермы: отсутствию или наличию второго столбикового слоя (столбики названы в данной работе «стерженьками», а сам слой, соответственно, «стерженьковым»), степени развития столбиков (форме, высоте), а также по размеру и выраженности шипов. У представителей семейства Cichoriaceae Л.А. Куприянова и Л.А. Алешина отметили гораздо меньшее разнообразие экзины и выделили только два типа Cichorium и Tragopogon, различающиеся по внутреннему строению шипов и размерам и расположению «стерженьков».
Более поздние работы J.J. Skvarla с соавторами (1966, 1977) и M.R. Bolick (1978) основаны на данных трансмиссионной электронной микроскопии. Исследователями были описаны основные типы ультраструктуры спородермы сложноцветных, различающиеся деталями строения эктэкзины.
J.J. Skvarla с соавторами (Skvarla et al., 1977) выделяет 4 основных морфологических типа пыльцевых зерен у Asteraceae: Anthemoid-, Helianthoid-, Senecioid- и Arctotoid-тип.
Для всех этих типов характерно наличие покрова, столбиков и подстилающего слоя.
Anthemoid-тип характеризуется отсутствием полости в экзине. Это пыльцевые зерна с т.н. некаватной (от слова cavus - полость) экзиной. Также для Anthemoid-типа характерно наличие двух рядов столбиков и внутреннего покрова, сформированного разветвлениями внутренних столбиков, которые бывают обычно толстыми и длинными, и могут ветвиться. Наружные столбики более короткие. Этот тип встречается у представителей триб Cynareae (рассматриваются у К. Bremer в составе трибы Cardueae), Anthemideae, у некоторых Mutisieae.
Для следующего Helianthoid-типа характерно наличие полости в экзине (каватные пыльцевые зерна) и внутренних отверстий в покрове и столбиках. На электронном уровне хорошо заметно, что полость развивается не «между подстилающим и нижележащими слоями» (Пыльца и споры..., 1972), а над подстилающим слоем, отделяя его таким образом от оснований столбиков столбикового слоя. Этот тип экзины наблюдается у представителей триб Heliantheae, Eupatorineae, Astereae, Helenieae и Calenduleae, также некоторых Inuleae, Senecioneae и значительно реже у представителей Anthemideae.
Senecioid-тип отличается от предыдущего отсутствием внутренних отверстий. Этот тип обнаружен у большинства видов триб Senecioneae и Ambrosieae (представителей которой К. Bremer относит к трибе Heliantheae), у многих Inuleae и некоторых Mutisieae и Arctotideae. Senecioid-тип, возможно, является производным Helianthoid-типа, поскольку ультратонкие исследования при помощи трансмиссионного электронного микроскопа позволили выявить очень мелкие отверстия в покрове и столбиках (виды рода Senecio) и часто не рассматривается другими авторами в качестве отдельного морфологического типа.
Четвертый, Arctotoid-тип, по данным J.J. Skvarla с соавторами, представляет модификацию Senecioid-типа. Он отличается тем, что слой внутреннего покрова делит столбики на две почти равные части, основания столбиков раздвоены, в шипах хорошо выражен центральный канал, который оформлен основаниями столбиков. Однако основания столбиков могут свободно свешиваться в полость или соединяться с подстилающим слоем. Arctotoid-тип отмечен у родов Arctotis, Cymbonotus, Arctotheca, Haplocarpa.
Вышеперечисленные ультраструктурные типы характеризуют, в основном, эхинатные пыльцевые зерна.
Методика исследования зрелых пыльцевых зерен
Для изучения ультраскульптуры зрелой пыльцы из сухого материала отбирали отдельные пыльцевые зерна и без специальной обработки наклеивали при помощи лака на металлические столики. Столики с образцами напыляли сплавом платины и палладия в ионно-распылительной установке (Eiko IB-3 ION COATER). Пыльцевые зерна изучали и фотографировали под сканирующими электронными микроскопами Hitachi S-405 А и Camscan S-2 в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета МГУ при увеличениях ЮООх -ЗОООхипри ЮОООх.
2.3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ)
2.3.1. Методика исследования зрелых пыльцевых зерен.
Для изучения ультраструктуры оболочек сформировавшихся пыльцевых зерен сухой материал размачивали в дистиллированной воде и выделенные зерна фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия (ОБОД через серию спиртов доводили до 70 спирта, затем контрастировали насыщенным раствором уранилацетата (U02(CH3COO)2) в 70 спирте, переводили в абсолютный спирт, затем в ацетон. После этого отдельные пыльцевые зерна заключали в смесь эпонов следующего состава: 13 частей Ероп 812, 8 частей DDSA, 7 частей MNA и 1 часть катализатора, ускоряющего процесс полимеризации (Уикли, 1975). Материал для полимеризации оставляли на 2 суток в термостате при температуре 60С.
Изготовленные на ультратоме LKB Ultratome V и смонтированные на медных сеточках ультратонкие срезы, контрастировали свинцом по Рейнолдсу (Гайер, 1974). Образцы исследовали с помощью электронного трансмиссионного микроскопа Jeol 100 В в лаборатории электронной микроскопии при увеличения от 3000 до 80000 крат и фотографировали срезы оболочек микроспор и пыльцевых зерен в области апертур и в безапертурных районах.
2.3.2. Методика исследования развивающихся пыльцевых зерен.
Для изучения ультраструктуры развивающейся спородермы кусочки пыльников из свежих бутонов помещали в 2,5% раствор глутаральдегида (С3Н6(СНО)2) на 0,15М фосфатном буфере (рН 7,3) с добавлением сахарозы (15,0 мг/мл) и последующей постфиксацией в 1% растворе OsC 4. Материал через серию спиртов доводили до 70 спирта, затем контрастировали насыщенным раствором уранилацетата в 70 спирте. Далее пыльники обезвоживали путем постепенного перевода в абсолютный спирт, последовательно помещали в разные смеси ацетона и абсолютного спирта (1:3, 1:1 и 3:1 соответственно) и, наконец, в чистый ацетон. После этого пыльники заключали в смесь эпонов указанного выше состава: 13 частей Ероп 812, 8 частей DDSA, 7 частей MNA и 1 часть катализатора, ускоряющего процесс полимеризации (Уикли, 1975). Далее образцы обрабатывали и исследовали по той же схеме, что и зрелые пыльцевые зерна, фотографируя также тапетум на некоторых стадиях развития.
П.з. 3-4-бороздно-оровые, сфероидальные, слегка сплюснутые с полюсов. Очертания в полярном положении округло-треугольные, в экваториальном -округлые. Полярная ось 39,5 (33,5-40,7) мкм, экваториальный диаметр 42,5 (40,7-42,9) мкм, Р/Е=0,95.
Борозды длинные, узкие, неглубоко погруженные, края борозд нечеткие, концы борозд острые. Длина борозд 28,4 (27,8-30,1) мкм, ширина - менее 2,0 мкм. Оры вытянуты по меридиану, меридиональный диаметр ор 8,1 (6,8-8,5) мкм, экваториальный диаметр ор - 4,3 (3,0-5,1) мкм.
Контур п.з. острозубчатый.
Экзина покровная, двухслойная, ее толщина вместе с шипами составляет 12,1-12,5 мкм, полость в области мезокольпиумов хорошо заметна. СЭМ
Поверхность п.з. крупношиповатая, пронизана перфорациями, наиболее хорошо заметными в основании шипов, между шипами видны также бугорки. Шипы узкоконические, с расширенными основаниями, высота шипов 5,5 (4,5-6,0) мкм, вершины их заостренные, часто слегка загнутые. Расстояние между вершинами шипов составляет 6,5 (5,3-6,8) мкм. Мембрана борозд мелкогранулярная. Мембрана ор гладкая.
В спородерме четко различимы эктэкзина, эндэкзина, интина и трифина. Эктэкзина состоит из покрова, столбиков и подстилающего слоя. Тонкий покров пронизан перфорациями, соединяющими внутреннее пространство эктэкзины с внешней поверхностью пыльцевого зерна. Столбики располагаются параллельно друг другу, сливаются редко. Ближе к подстилающему слою они, напротив, соединены многочисленными анастомозами, искривлены, пронизаны мелкими камерами округлой или иногда удлиненной формы. В основаниях столбиков такие камеры, как правило, отсутствуют (если есть, то очень мелкие, округлые). В основании шипов столбики превращаются в рыхлую сеть. В шипе есть внутренняя камера. Под основаниями столбиков развивается узкопросветная полость. Свод полости неровный, изрезанный, основания столбиков свешиваются в полость и иногда соприкасаются с подстилающим слоем, но никогда не сливаются с ним. Подстилающий слой тонкий (толщина его на поперечных срезах, как правило, меньше толщины покрова), прерывистый, на поперечных срезах п.з. виден в качестве отдельных «глобул» спорополленина.
Большая часть внутреннего пространства эктэкзины заполнена электронно-плотным содержимым трифины.
Основные стадии развития спородермы у представителей семейства Asteraceae
Формирование тетрад микроспор подробно изучено только у этого вида.
Перед началом формирования тетрад стенка микроспорангия представлена четырьмя слоями клеток. Следуя в радиальном направлении снаружи к центру гнезда пыльника, можно выделить экзотеций (эпидермис), эндотеций, средний слой и тапетум. Тапетальные клетки плотно прижаты друг к другу и соприкасаются с каллозной оболочкой, формирующейся вокруг материнских клеток микроспор. Протопласт клеток тапетума содержит густую цитоплазму, как правило, два ядра (реже одно), множество мелких вакуолей, митохондрий, элементы эндоплазматического ретикулума, диктиосомы еще мало активны.
Сформировавшиеся материнские клетки микроспор округлой формы, окружены каллозной оболочкой, до начала развития тетрад она довольно тонкая. Материнские клетки делятся с образованием 4 ядер, заключенных в общую цитоплазму. Одновременно с этим клетки продолжают откладывать каллозную оболочку, ее толщина увеличивается, но неравномерно. На некоторых участках (но не по всему периметру клетки одновременно) к плазмалемме из цитоплазмы подходят небольшие округлые пузырьки. Они выходят на внешнюю поверхность плазмалеммы (за ее пределы), накапливаются и сливаются, образуя более крупные продолговатые пузыри. Последние разрушаются и изливают свое содержимое на поверхность клетки, увеличивая толщину каллозной оболочки. Одновременно с этим наблюдается скопление мембранных структур в периферической части цитоплазмы, чаще всего это элементы эндоплазматического ретикулума. Между поделившимися клетками по направлению от периферии к центру будущей тетрады начинают вклиниваться увеличивающиеся массивы каллозы, отделяя формирующиеся микроспоры друг от друга. Местами на поверхности каллозной оболочки откладываются капли электронно-плотного вещества, выделяемые тапетальными клетками.
Тетрадный период (Табл. 3.1.2-3.1.5)
В начале этого периода стенка микроспорангия не претерпевает заметных изменений. Все ее четыре слоя клеток хорошо заметны и сохраняют первоначальное строение.
Микроспоры имеют округлую форму и заключены в каллозную оболочку. На нее из полости пыльника происходит осаждение веществ, часть из которых затем поступает в микроспоры. Протопласт микроспоры представлен густой зернистой цитоплазмой, в которой видны многочисленные свободные рибосомы, митохондрии, мелкие вакуоли, элементы эндоплазматического ретикулума, диктиосомы, состоящие из небольшого (4-7) числа цистерн. Центральную часть микроспоры занимает ядро с ядрышком. В поверхностном слое цитоплазмы концентрируется множество мелких везикул с электронно-плотной сердцевиной. Плазмалемма микроспор изначально ровная, постепенно приобретает извилистый (на срезах, ориентированных перпендикулярно к поверхности клетки) профиль. Везикулярные единицы выходят за пределы клетки и откладываются на ее поверхности, сначала в один слой, позднее число слоев увеличивается. Таким образом формируется гликокаликс - примэкзиновый матрикс, представляющий собой каркас для будущей примэкзины (первичной экзины).
В середине тетрадного периода клетки среднего слоя стенки пыльника сильно сплющиваются в радиальном направлении, состояние тапетальных клеток сходно с ранней тетрадной стадией, но они приобретают более округлые очертания и уже не так плотно примыкают друг к другу. Между ними и каллозной оболочкой микроспор образуется свободное пространство.
В протопласте микроспор много мелких вакуолей с электронно-прозрачным содержимым. Структура примэкзины становится уже хорошо заметной. Это происходит вследствие отложения на поверхности везикулярных единиц аморфного вещества средней электронной плотности. На срезах, ориентированных перпендикулярно к поверхности микроспоры, видно, что это вещество располагается в виде радиально направленных тяжей между группами везикулярных единиц примэкзинового матрикса. На поверхности внешнего ряда везикулярных единиц аморфное вещество откладывается сплошным слоем. Поэтому на тангенциальных срезах везикулярные единицы примэкзинового матрикса выглядят лежащими в ячеях сетки, сформированной этим аморфным веществом. В течение средней тетрадной стадии примэкзина увеличивается в толщину и проявляется более четко. В это время намечаются области будущих апертур. На срезах они выглядят как ровные участки плазмалеммы. По краям апертурных областей везикулярные единицы располагаются в 1-2 слоя. Непосредственно на поверхности будущих апертур везикулярные единицы не откладываются и примэкзиновый матрикс здесь не формируется. Иногда над апертурными областями видны электронно-прозрачные образования, сохраняющиеся вплоть до растворения каллозы. В этот период на межапертурных участках примэкзины начинают формироваться округлые предшипы, также имеющие везикулярную структуру.
В конце тетрадного периода клетки среднего слоя стенок пыльников практически теряют содержимое, остаются только их оболочки. Тапетальные клетки сохраняют париетальное расположение, но их внутренние тангенциальные стенки начинают разрушаться.
В протопласте микроспор по-прежнему наблюдается множество мелких вакуолей. Примэкзина претерпевает значительные видоизменения. Она постепенно становится все более электронно плотной (тяжи аморфного вещества «темнеют» в радиальном направлении - снаружи внутрь микроспоры). Везикулярные единицы примэкзинового матрикса, напротив, становятся менее различимыми. Прорисовываются элементы будущей эктэкзины: столбики и покров.
В области апертур примэкзина отсутствует. В цитоплазме микроспор большое число свободных рибосом. На границе примэкзины происходит частично разрушение каллозной оболочки и на некоторых участках даже иногда формируются просветы между плазмалеммой микроспороы и каллозой.
Посттетрадный период (Табл. 3.1.5 -3.1.11)
Стенка пыльника в начале этого периода представлена экзотецием, эндотецием, средний слой к данному моменту полностью деградирует, оболочки тапетальных клеток, в первую очередь, радиальные и внутренняя тангенциальная разрушаются, выступы отдельных протопластов начинают проникать в полость пыльника, но основная масса протопластов еще сохраняет свое париетальное положение и очертания. Значительный объем протопластов тапетальных клеток занят элементами гранулярного эндоплазматического ретикулума.
Каллозная оболочка вокруг тетрад разрушается. Пыльцевые зерна увеличиваются в объеме, сохраняя округлую форму. Диктиосомы активизируют свою деятельность и отчленяют пузырьки. В периферической части цитоплазмы происходит скопление митохондрий, пластид и мелких вакуолей с электронно-прозрачным содержимым. В области апертур их число увеличивается.
Формирование основных элементов оболочки пыльцевого зерна (эктэкзины, эндэкзины и интины)
На поздней тетрадной стадии в примэкзине начинают дифференцироваться структуры эктэкзины (покров и столбики), также отчетливо выявляются округлые везикулярные структуры, состоящие из групп везикулярных единиц (по-видимому, они представляют собой основу для будущих шипов), что вполне согласуется с данными других авторов (Homer, Pearson, 1978; El-Ghazaly, 1982).
В конце тетрадного периода формируется так называемый внутренний везикулярный матрикса, на месте которого позднее (в самом конце тетрадного периода и на посттетрадных стадиях) развиваются полость и подстилающий полость слой у представителей Helianthoid-типа и ряд внутренних столбиков у пыльцевых зерен с ультраструктурой Anthemoid-типа.
Подстилающий слой и элементы эндэкзины начинают развиваться уже в посттетрадном периоде. Возможно, что эти два процесса идут практически одновременно, но с разной скоростью. В то время как эндэкзина у исследованных нами видов представлена уже достаточно мощным слоем, состоящим из рыхло лежащих ламелл, подстилающий полость слой еще очень тонок. В литературе часто описывают следующий порядок заложения слоев оболочки - подстилающий слой дифференцируется раньше эндэкзины, сразу же после дифференциации столбиков и покрова (хотя возможны различные варианты). У Н. annum, зрелые пыльцевые зерна которого имеют ультраструктуру, сходную с таковой у С. officinalis, Centaurea jacea и Dimorphotheca aurantiaca (Helianthoid-pattQrn), авторы (Horner, 1977; Horner, Pearson, 1978) отмечают такую последовательность заложения слоев спородермы: сначала формируется эндэкзина, а затем начинает откладываться подстилающий слой, но при этом на ламеллы эндэкзины осаждается материал из полости пыльника.
Можно предположить, что у видов со слабо развитым или даже редуцированным подстилающим слоем, первыми действительно откладываются ламеллы эндэкзны, которые и служат своеобразным фундаментом для построения вышележащего подстилающего слоя.
На срезах слой эндэкзины, как правило, выглядит более светлым. В середине или ближе к концу посттетрадного периода часто наблюдается уменьшение осмиофильности эндэкзины. Она хуже контрастируется такими реагентами, как ОБОД И уранилацетат. Это явление отмечали ранее и другие авторы (Flynn, Rowley, 1971). Кроме того, на определенном этапе роста формирующегося пыльцевого зерна уменьшается толщина эндэкзины, происходит ее сдавливание и растяжение из-за увеличения объема протопласта пыльцевых зерен. Растяжение эндэкзины обеспечивается, вероятно, благодаря тому, что ламеллы эндэкзины «разъезжаются» по поверхности плазмалеммы, и слой эндэкзины благодаря этому несколько уменьшается в толщину.
В середине посттетрадного периода у каватных пыльцевых зерен полости в мезокольпиумах уже хорошо развиты, в определенный момент они значительно увеличиваются в объеме. Возможно, такое увеличение полостей выполняет гармомегатную функцию, позволяя расти содержимому пыльцевого зерна. Однако при этом остается неясным, за счет чего происходит увеличение объема некаватных пыльцевых зерен, у которых на месте полостей формируется внутренний слой столбиков, иногда очень массивных.
В посттетрадный период увеличиваются в размерах шипы, в их основании становятся отчетливо видной внутренняя камера, заполненная матриксом. Такая внешняя "надстройка" шипов, возможно, увеличивает уязвимость этой структуры (Габараева, 2001), и позволяет объяснить тот факт, что при нарушении нормального хода развития пыльцевых зерен под влиянием различных факторов, очень часто встречается уменьшение высоты шипов (Глазунова, 1996; Полевова и др., 2001). Таким образом, процессы формирования подстилающего слоя и развитие шипов идут параллельно, и в них принимает участие спорополлениновый материал, поступающий из полости пыльника.
Слой интины развивается на последних стадиях формирования оболочки. При этом происходит активный перенос веществ из протопласта пыльцевого зерна. Плазмалемма приобретает волнистый профиль, хорошо заметный даже при относительно небольших увеличениях (х5000-8000). Вероятно, данный процесс занимает небольшой промежуток времени, поскольку в спородерме зрелых пыльцевых зерен интина некоторых видов {Calendula officinalis, Dimorphotheca aurantiacd) представлена достаточно тонким слоем. Формирование интины может происходить в тот момент, когда развитие вышележащего слоя эндэкзины еще не закончено. 4.2.3. Формирование апертур
Формирование апертур в пыльцевых зернах исследованных видов сходно с таковым у других представителей сложноцветных (Horner, Pearson, 1978; Jordaan, Kruger, 1993 и др.). В тетрадном периоде в апертурных районах не закладывается гликокаликс и не развивается примэкзина.
В посттетрадном периоде, когда начинается развитие эндэкзины, ее первые ламеллы часто видны в апертурных областях. Позднее, когда на других участках оболочки пыльцевого зерна эндэкзина еще очень тонкая, области апертур заполнены ламеллами, которые расположены рыхло в центральных частях апертуры и более компактно по ее краям. Подобная же картина наблюдается в формирующихся пыльцевых зернах других видов сложноцветных (Horner, Pearson, 1978; Jordaan, Kruger, 1993; Varotto et al., 1996). В связи с этим логично предположить, что именно эти участки оболочки являются местами инициации развития эндэкзины. В конце посттетрадного периода в районах апертур развиваются «подушки» интины.
Поскольку эндэкзина принимает непосредственное участие в формировании апертур и этот слой спородермы у сложноцветных хорошо развит, то, возможно, поэтому для них характерны сложные апертуры. Такие апертуры никогда не встречаются у голосеменных, для которых характерна ламеллятная эндэкзина, но, как правило, более тонкая. Ламеллы на фотографиях поперечных срезов некоторых представителей голосеменных выглядят очень длинными (Gabaraeva, Grigorjeva, 2002, 2004) в отличие от более коротких компактных ламелл сложноцветных.
