Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы» основные итоги и перспективы изучения грибов рода trichodeema er ..' 6
Экспериментальная часть
Глава II . Материалы и методы 22
Глава III . Результаты изучения культурально-морфологической изменчивости штаммов t.viride и t.haeziattom 22
Глава ІV. Результаты сравнительного изучения онтогенеза представителей рода trichodeema в различных условиях культивирования 45
Глава V . Обсуждение полученных результатов 90
Выводы 106
Список литературы WV-.' 109
- Обзор литературы» основные итоги и перспективы изучения грибов рода trichodeema er
- . Материалы и методы
- . Результаты изучения культурально-морфологической изменчивости штаммов t.viride и t.haeziattom
- Результаты сравнительного изучения онтогенеза представителей рода trichodeema в различных условиях культивирования
Введение к работе
Выбор темы настоящего исследования продиктован ведущейся в СССР разработкой технологии промышленного производства препарата "триходермин", предназначенного для биологической борьбы с болезнями растений. Основу его составляют пропагулы дейтеро-мицетов рода Trichoderma Fr,, известных антагонистической и гиперпаразитической активностью. Исследования по этой проблеме включены в координационную программу стран-членов СЭВ по разработке технологии производства микробиологических средств борьбы с болезнями растений. Постановление ЦК КПСС и Совета Министров СССР от 25 мая 1978 г. "О дальнейшем развитии кормовых добавок, средств защиты растений и другой продукции микробиологической промышленности в 1978-1985 годах", материалы ХХУТ съезда партии и Майского (1982 г.).Пленума ЦК КПСС подчеркивают актуальность работ в этой области. В этих документах поставлена задача значительного увеличения производства эффективных микробиологических средств защиты растений на основе прогрессивных технологий и указано, что ее успешное решение имеет важное народнохозяйственное значение для реализации Продовольственной программы СССР. Показана необходимость осуществления комплекса мер с целью выпуска препаратов высокого качества и обеспечения их эффективного применения. При этом отмечено, что решение поставленных задач требует объединенных усилий специалистов разных областей, и одним из главных направлений такого сотрудничества должно быть глубокое изучение продуцентов, имеющихся в распоряжении микробиологической промышленности (Рычков, 1981). Актуальность проблемы исследования микроорганизмов в связи с их использованием в микробиологической промышленности нашла свое отражение также в Постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР от 24 июня 1981 г. "О дальнейшем развитии физико-химической биологии и биотехноло- гии и использовании их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности". Несмотря на значительные масштабы изучения микромицетов рода Trichoderma, проводимого во многих странах . вследствие их широкого распространения и благодаря ряду важных в практическом отношении свойств, сведения об онтогенезе этих грибов и их цитологии очень ограничены. Вместе с тем появление задач промышленного культивирования дейтеромицетов рода Tricho-derma потребовало интенсификации исследований по биологии их развития и активизации цитологического направления изучения. В литературе указано на результативность такого подхода к изучению грибов в связи с их использованием в биотехнологической промышленности (Беккер, 1977). Таковы предпосылки, послужившие основанием для предпринятого исследования.
Поставленная на основании вышеизложенного цель работы заключалась в изучении биологии развития и цитологии дейтеромицетов рода (Trichodexma в связи с их использованием для промышленного получения препарата "триходермин". В соответствии с этим в задачи исследования входило: I) выявление культурально-морфоло-гической изменчивости имеющихся штаммов и возможности стабилизации их свойств; 2) сравнительное изучение форм роста, циклов развития, структурной дифференциации и функциональной гетерогенности онтогенетических форм гриба, процессов конидиогенеза и особенностей спор при погруженном и поверхностном выращивании культур; 3) выяснение возможностей функционально-диагностической оценки состояния культур и полученных спор гриба.
Для решения поставленных задач использованы в основном цитологические методы, в ряде случаев дополненные биохимическими процедурами. Экспериментальная часть исследования выполнена на Кафедре низших растений биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова, а также на базе ВНИИ микробиологических средств зашиты растений и бактериальных препаратов (ВНИИбакпрепарат).
В ходе решения поставленных задач впервые проведено сравнительное изучение характеристик культур ряда штаммов грибов рода Trichoderma различного географического происхождения при их поверхностном и погруженном выращивании. При этом выявлены закономерности процессов развития микромицетов этого рода и особенности их онтогенеза в зависимости от условий культивирования. Выявлены причины гетерогенности штаммов дейтеромицетов из рода Tri-choderma и показаны тенденции ее изменений. Установлены пути стабилизации свойств штаммов и даны рекомендации для селекционной работы с грибом. Показана возможность контроля за ходом процессов развития культур и оценки их функционального состояния на протяжении технологического цикла и во время хранения на основании предложенных автором для этой цели методов. Результаты проведенных исследований позволяют применить полученные сведения на всех этапах работы с микромицетами рода Triehoderma как продуцентами препарата "триходермин", что важно в практическом отношении в связи с перспективой его промышленного выпуска. Предложена принципиальная схема безотходной технологии культивирования грибов рода Ttichoderma с целью их комплексного использования в биотехнологической промышленности.
Изложение материалов в работе проведено по главам, начинающимся после введения. Глава I представляет собой обзор литературы, показывающий современное состояние,проблемы и перспективы изучения микромицетов рода Trichoderma и их практического использования. Глава П отражает основные методические стороны экспериментальной работы. Две последующие главы посвящены результатам собственных исследований и включают таблицы, рисунки, схемы и фотографии. Обсуждение полученных данных проведено в главе У. Выводы помещены в специальном разделе, предшествующем списку использованной литературы.
Обзор литературы» основные итоги и перспективы изучения грибов рода trichodeema er
Начало изучения микромицетов рода Trichoderma относится к 1794 г., когда, по свидетельству Рифаи (Eifai, 1969), Пирсон сделал первые описания четырех видов грибов, отнесенных впоследствии к разным родам. В 1871 г. Харз выделил собственно род Tri-choderma, однако до настоящего времени иногда смещаются границы между родами Trichoderma Fr., Grliocladium Cda,, Verticillium Wallr. и некоторыми другими, что вслед за Рифаи отмечено рядом авторов (Dennis, Webster, 1971; Опт, Munneeke,1974). Исторические экскурсы, осуществленные Т.Н.Шкляр (1957) и Рифаи (1969), показали, что еще в I860 г. Тюлян описал характерные для Iricho-derma родовые признаки и высказал предположение о связи данной конидиальной стадии с пиреномицетом Hypoorea rufa Fr»; их генетическую общность подтвердили в 1865 г. братья Тюлян, а несколько позже - Брефельд и ван Тавель, однако установление такой связи не повлекло дальнейшего нахождения видового соответствия между родами Irichoderma.n Hypocrea Fr, Исправив ошибку Фриза, поместившего в 1829 г. род Trichoderma среди гастеромицетов, Тюлян отнес его в I860 г. к несовершенным грибам, где он пребывает до настоящего времени, будучи традиционно приписанным к порядку Uyphomycetales» Следует учитывать также возможности изменения его положения в системе дейтеромицетов в соответствии с предложенными для них новыми таксономическими схемами, рассмотренными И.И.Сидоровой и К.Л.Тарасовым (1980).
Основная часть дискуссионных вопросов касается внутриродовой системы Trichoderma. Анализ истории вопроса и имеющихся концепций проведен Т.Н.Шкляр (1957), Г.Ш.Сейкетовым и М.К.Исабаевой (1962), и в наиболее полном объеме - Рифаи (1969), показавшими, что, по мнению разных авторов, этот род насчитывает от 1-3 до 19 видов. Крайняя точка зрения о монотипном роде с.одним полиморфным видом T.viride Pers: Рг« высказана в 1939 г. американским микологом Бисби (Bisby, 1939) и нашла поддержку последователей. Наряду с этим подобный взгляд неоднократно встречал возражения. Напомнив, что Ваксман, Эббот и Ниетаммер различали 2 - 3, а Рабенхорст и Ячевский - и более видов, Т.Н.Шкляр (1957) отстаивала по меньшей мере два из них: !D#lignorum (Eode: Harz и T.koningii Oud# Как отмечено позднее (Сейкетов, Исабаева, 1962), такой подход поддержан в 1961 г. В.И.Билай и Н.М.Пидопличко и соответствует представлениям Саккардо, выделившим среди 19 перечисленных им видов Trichoderma именно эти как безусловно разграниченные. К числу наиболее значительных интерпретаций внутриродовой системы следует отнести также таксономические построения Эббота и Іильмана ( Gilman, 1957) и М.А.Литвинова(1967),подразделивших род Trichoderma соответственно на 4 и 6 видов.
Расходясь во мнениях относительно видовой структуры рода, многие авторы подчеркивали большое разнообразие форі гриба. Оно нашло отражение в описании разновидностей известных видов (Пидо-пличко, 1953; Крапивина и др., 1975), внутривидовой изменчивости (Камышко, 1961) и неоднородности популяций (Лихачев, 1978). Указана безрезультативность попыток видовой идентификации некоторых изолятов Trichoderma врр.(Сейкетов, Исабаева, 1962; Dreyfuss et al«t 1976; Gindrat, 1977). Подобная возможность неполного совпадения диагноза вида с признаками конкретных изолятов, расплывчатость видовых границ и поставленная еще Бисби (1939) проблема изменчивости микромицетов рода Trichoderma обусловили выдвинутую Рифаи в 1969 г. концепцию не отдельных видов, а их агре - 8 гатов. Проведя таксономическую ревизию рода, автор предложил 9 таких групп, включив в них как классические, так и новые виды: T.piluliferum Webster et Rifai aggr., OJ.polysporum (Links Pers,) Eifai aggr,, T.hamatum (Bon») Bainier aggr., T.koningii Oud, aggr., I.aureoviride Rifai aggr,, T.harzianum Rifai aggr., T,longibra-chiatum Rifai aggr., T,pseudokoningii Rifai aggr., Ttviride Pers, s,P,Gray aggr. Рифаи (1969) провел скрупулезный анализ синонимики и показал неодинаковое понимание исследователями объема видов. Так, например, по его мнению, T.koningii у Г.Ш.Сейкетова и М.К.Исабаевой (1962) включает в себя T#hamatum. К этому следует добавить, что несогласованность во взглядах на виды рода Trichoderma, пожалуй, в наибольшей мере затрагивает T.lignorum и T,viride. Очерченные Рифаи (1969) видовые границы T.viride гораздо уже таковых в старом понимании их последователями Бисби (1939). В силу сказанного использование данного видового эпитета без соответствующего комментария (что, к сожалению, не редкость в прикладных исследованиях) часто не позволяет представить, сколь широка использованная видовая концепция. До настоящего времени не выработано общепринятой позиции относительно реальности таксона OMignorum, Рифаи (1969) привел убедительные доказательства неправомерности данного видового названия ввиду нарушения правил номенклатуры при его использовании; в то же время, этот вид продолжает фигурировать как в периодической печати, так и в справочной ( Stevens, 1974) и монографической (Сейкетов, 1982) литературе. Подобные различия приводят к тому, что анализ работ по определенной проблеме вынужденно проходит в условиях, когда видовые характеристики представителей рода соответствуют разным таксономическим системам (Горленко, 1979; Каверзнева, Егураздова, 1979; Сидорова, 1980). Имеющиеся несоответствия, различия в трактовке и некоторая неуверенность в понимании видов Trichoderma затрудняют полноценный анализ литературы и нередко позволяют представить объект изучения лишь на уровне рода. Этим, в частности, обусловлено частое употребление в настоящем обзоре только родового названия гриба во избежание путаницы. Вместе с тем показателен пример, в котором авторы ( ohr, Munnecke,I974) идентифицировали изоляты, первоначально каталогизированные как !T#lig-. norum, в соответствии с таксонами системы Рифаи (1969), которой отдали предпочтение. Анализ публикаций последних лет показывает, что концепция Рифаи (1969), не принятая, по-сушеству, лишь Г.Ш.Сейкетовым (1982), стала едва ли не наиболее популярной среди предложенных для Trichoderma внутриродовых таксономических построений. При этом сам автор (Rifai, 1969), призывая к дальнейшему совершенствованию системы рода (необходимость чего очевидна и для его оппонента Г.Ш.Сейкетова (1982), предвидел выделение новых видов, что вскоре подтвердилось описанием ш.ваurnisporum Hamill ( Hamill , 1970) и вычленением в 1977 году T.reesei Simmons (Vaheri et aU, 1979).
При дискуссии о критериях вида у Trichoderma был поднят вопрос о надежности диагностических признаков. Рифаи (1969), опираясь также на выводы Бисби (1939), подверг сомнению ценность фи-зиолого-биохимических характеристик для таксономии этого рода, подчеркнув, что еще в 1871 г. Харз придавал решающее значение микроморфологическим критериям. Приоритет последних признан в настоящее время всеми авторами; вместе с тем многие из них (Ка-мышко, 1961; Rifai, 1969; Dreyfuss et al.f 1976; и др.), неизменно отмечая большую пластичность различных физиологических свойств, все же использовали их в качестве дополнительных таксономических критериев. Примеров применения иных концептуальных основ для подхода к решению вопроса о критериях вида рода Tricho-derma в литературе найти не удалось. И.Г.Крапивина и соавторыС1973) показали различия в надежности диагностических признаков, выявив при этом превалирующую роль морфологии спор; это согласуется с выводами других исследователей (Камышко, 1961; Сейке-тов, Исабаева, 1962; Bifai, 1969; Hamill, 1970). Не умаляя таксономической значимости многих элементов морфологии гриба, Рифаи С1969) вслед за Н.М.Пидопличко (1953) придал большое значение наличию орнаментации клеточной стенки конидий, разграничив виды с гладкими и шероховатыми спорами. Год спустя Уолш (Walsh, 1970) изучил контур конидий разных видов Trichoderma с помощью просвечивающего электронного микроскопа и выявил наличие орнамента у спор, кажущихся под светооптическим микроскопом гладкими. Однако целый ряд спорных в методическом отношении моментов заставляет критически взглянуть на выводы Уолша, к которым мы вернемся в главе 5. В связи с изложенным нельзя не отметить, что при решении вопросов таксономии рода Trichodexma не реализованы полностью методические возможности растровой электронной микроскопии, неоднократно показанные, как это видно из специального обзора ( Сагг, 1971), при ее использовании для морфолого-систематическо-го изучения грибов. Имеются лишь единичные данные ( Hashioka, 1973) о строении спор некоторых представителей рода Trichoderma, полученные при их стереосканировании.
. Материалы и методы
Работа проведена с культурами 4 штаммов дейтеромицетов рода Trichoderma, полученных на основе природных изолятов различного географического происхождения, предоставленными коллекцией живых культур ШИИбакпрепарат, где они были каталогизированы как принадлежащие к виду T.lignorunu Учитывая итоги таксономической ревизии рода (Tricboderma (Rifai, 1969), мы пересмотрели видовую принадлежность полученных культур, идентифицировав штаммы 300-А и Б-10 с видами агрегата T.viride aggr., а штаммы 01 и ЯЮ - с видами агрегата T.harzianum aggr.
Культивирование осуществляли на наборе питательных сред, перечисленных в таблице І» В дальнейшем, в целях более компактного изложения, среды обозначены условными порядковыми номерами, под которыми они приведены в таблице. При использовании сред 1+20 применялись как жидкие, так и плотные (2% агара) их варианты, обозначенным индексом "а".
Полученные штаммы поддерживали путем периодических (3 раза в год) пересевов на средах 5а, 21 и 22. Хранение осуществляли при +4С, причем для ограничения доступа воздуха треть культур каждой партии хранили под пробками, залитыми парафином, а половину оставшейся части - под слоем вазелинового масла (Методы селекции.., 1978).
Во время экспериментальной работы проводили выращивание штаммов в погруженных и поверхностных периодических культурах на указанном наборе природных и синтетических сред. Глубинное культивирование проводили на качалках с реципрокным (180 мин ) и круговым (220 мин""х) типами перемешивания в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержавших обычно 150 мл среды. Для изменения условий аэрации объем среды доводили до 50, 100, 200, 250 и 300 мл на - 23 -основании определенных для указанных объемов сульфитных чисел как показателей доступа кислорода из воздуха. Таблица I Питательные среды, применявшиеся в ходе работы пп! Среда ! Литературный 1 источник прописи I. Райстрика Методы экспер.микол., 1973 2. Ролена-Тбма Беккер, 1963 3. сусло (бБ) Методы экспер.микол., 1973 4. картофельно-глюкозная — w — 5, Чапека — " — Чапека с эквивалентной заменой сахарозы по углероду на: 6. глюкозу 7. лактозу 8, мальтозу 9. маннит 10. арабинозу II. дульцит 12. инозит ІЗ. рамнозу 14. ксилозу 15. сорбит 16. Чапека с 0,5% хлорида кальция 17. Чапека с 0,5% кукурузного экстракта 18, Чапека с 0,5% пептона 19. Р-Ш Воронкова и др., 1981 20. БВК 1% - » 21. Ван-Итерсона Методы селекции,., 1978 22. пшено _ " — 23. голодный агар Методы экспер.микол., 1973 Применяли как одноэтапный метод выращивания, где инокулятом служила суспензия спор гриба, так и двухэтапный по схеме ВНИИбакпрепарат (Воронкова и др., 1981), при котором в качестве - 24 -посевного материала использовали мицелий, выросший на среде 20. Температура инкубации составляла 27+1С, за исключением специальных экспериментов по изучению влияния температуры, во время которых использовали политермостаты. При изучении культурально-морфологической изменчивости описывали колонии исследуемых штаммов на наборе плотных питательных сред 1а 20а на 3, 5, 7, 10 и 15 сутки роста по общепринятой схеме (Методы селекции,, 1978), пользуясь шкалой цветов Бондарце-ва (1954). Культуры штаммов 7-кратно пассировали на каждой среде с интервалами между пересевами 20 суток. По результатам описания колоний каждой генерации составляли таблицы-матрицы характеризующих их культурально-морфологических признаков, которые сравнивали по методу информационно-логического анализа. 0 гетерогенности популяций судили на основании их монокони-диального разложения, включая в каждый анализ 300 моноспоровых изолятов. Продуктивность спорообразования оценивали путем вычисления индекса споруляции при подсчете количества спор в камере Горяева. Биологическую активность исследуемых изолятов по отношению к фитопатогенным грибам изучали методом парных культур в чашках Петри и на предметных стеклах (Сидорова, Тарасов, 1977; Рудаков, 1981; Dennis, Webster, 1971). Для уточнения характеристик основных этапов онтогенеза применяли выращивание на целлофане (Плотникова и др., 1982; Dusseau, 1938) и метод микрокультур (Билай, 1980; Cole,Samson, 1979), а также культивирование на агаровых мазках (Дмитриева, Петрухина, 1973). Для изучения конидиогенеза мацерировали конидиеносцы по М.А.Литвинову (1969). При морфологических исследованиях пользовались красителем Александера (Alexander, 1980) и лактофенолом с анилиновым синим (Прозина, I960; Паушева, 1974; Stevens, 1974). - 25 Возрастное состояние мицелия характеризовали по С.В.Дмитриевой и З.Э.Беккер (1962). С помощью частных реакций выявляли оксидо-редуктазы (суммарно дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназу, цитохро-моксидазу, пероксидазу), белок, соединения с сульфгидрильньми группами. Окрашивали клеточные органеллы и включения, в том числе клеточные стенки, ядра, митохондрии, гранулы волютина и гликогена, глобулы липидов. С этой целью проводили соответствующие цитохимические процедуры (табл. 2). При выявлении оксидоредуктаз контролем служила их тепловая инактивация (Роскин, Левинсон, 1957). В необходимых случаях цитохимические определения вели на фиксированном материале, используя рекомендованные в этих целях составы фиксаторов (Глик, 1950; Прозина, I960; Дженсен, 1965; Луппа, 1980).
. Результаты изучения культурально-морфологической изменчивости штаммов t.viride и t.haeziattom
Микроскопирование в видимом свете и в фазовом контрасте проводили на МШ-І5 с фотоблоком, регистрируя наблюдения на фотопленке марки "Микрат". люминесцентную микроскопию осуществляли на микроскопе серии ЛЮМАМ с использованием рисовального аппарата. Для оптического обеспечения наблюдений морфолого-культуральных свойств исследуемых штаммов и поведения их в парных культурах с фитопатогенными грибами служил также стереомикроскоп МБС-2.
В целях уточнения данных цитохимических анализов проводили количественное определение липидов по Фольчу (Folch et al.,1957) и качественное их сравнение методом тонкослойной хроматографии (Ахрем, Кузнецова, 1964; Синютина, 1978) на пластинках "Silufol". Проведя сравнение 15 систем растворителей, выбрали для разделения липидов составы, состоящие из: I) 4 частей изопропилового спирта, 3 частей циклогексана и I части уксусной кислоты; 2) I части ацетона и 9 частей дихлорэтана. Проявляли 10$ спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты.
Соотношение нуклеиновых кислот в процессе развития культур определяли по методике, разработанной старшим научным сотрудником БНИИбакпрепарат И,П,Майоровой на основании известных способов количественного определения ДНК и FHK Бартона и Таггарта(Дмитриева, 1978; Дмитриева, Козлов, 1978). В образце объемом 10 мл отделяли биомассу центрифугированием при 7 000 мин в течение 15 мин. Осадок промывали 10 мл 0,5н НСІ04 и затем дистиллированной водой, центрифугируя как указано выше. Затем осадок переносили в химические пробирки с 5 мл Ін НОІО4 и помещали пробирки в водяную баню при 90+0,5С на 10+0,1 мин. Охлаждали в ледяной воде и фильтровали. Фильтрат использовали для определения РНК по цветной реакции на рибозу и ДНК цветной реакцией на дезоксирибозу. Для определения РНК фильтрат разбавляли в 5 раз Ін НСІо , К I мл разбавленного фильтрата добавляли I мл раствора орцина. Пробирки закрывали стеклянными пробками и помещали в кипящую водяную баню на 30+0,5 мин. Охлаждали в ледяной воде и колориметрировали на ФЭК е в кюветах 0,5 см с фильтром № 8. При определении ДНК к 2 мл фильтрата добавляли 1,5 мл раствора дифениламина, закрывали стеклянными пробками и ставили в кипящую водяную баню на 10+0,1 мин. Охлаждали в ледяной воде и колориметрировали на ФЭК е в кюветах I см с фильтром № 7. Определяли величину отношения FHK/ДНК по отношению оптических плотностей.
Биомассу, развивавшуюся в ходе онтогенеза культур исследуемых штаммов, подвергали безаппаратурному фракционированию, приняв за основу методику, предложенную Н,А,Сизовой и соавторами (1980) для разделения клеток крови. Через равные промежутки времени, составлявшие 3-5 мин,, на образец объемом 2 мл наслаивали по 2 мл растворов сахарозы убывающей концентрации, начиная с 50 величина концентрационного градиента составляла 5%, Контролем служили образцы сред без биомассы. Визуальную регистрацию слоев-фракций докумен - ЗО тировали.рисунком-схемой их взаимного расположения и описанием макроморфологических характеристик, после чего с помощью пастеровской пипетки или иглы шприца проводили препаративное выделение клеток гриба послойно, анализируя впоследствии фракции макроскопически. При необходимости картировали последние по плотности, сравнивая их локализацию с топографией подкрашенных слоев в специально приготовленном стандарте.
Подготовку образцов культур гриба для электронномикроскопи-ческого изучения вели на основании общепринятой схемы процедур (Уикли, 1975; Juniper et al., 1970; Cole, Samson, 1979), экспериментально подобрав методику подготовительных операций, В работе по электронномикроскопическому исследованию принимал участие старший научный сотрудник НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г,Н,Габричевского В,В,Высоцкий. Изучили пригодность для целей нашего исследования ряда фиксаторов, используя водные растворы и растворы в фосфатном буфере (рН=7,4) формалина, перманга-ната калия, глютаральдегида и четырехокиси осмия, а также их сочетаний. Время действия каждого компонента составляло 2, б, 12, 24, 48 и 72 часа. Смыв фиксирующим раствором биомассы гриба с поверхности среды в ряде случаев осуществляли с добавлением 0,01% твина-80» К части образцов, фиксируемых на протяжении первых трех из вышеупомянутых временных интервалов, добавляли 2% ДМСО (Акыш-баева, Колесникова, 1979). В результате была подобрата единая стандартная методика подготовки образцов для электронномикроско-пического исследования, оказавшаяся одинаково надежной для всех имевшихся штаммов и обеспечившая возможность сравнительно-морфологического изучения клеток микромицетов рода Trichoderma, культивируемых в различных условиях, а также подвергнутых обработке в соответствии с технологической схемой получения триходермина (Воронкова и др,, 1981), Результат был достигнут при длительной - ЗІ -- не менее 48 часов - двойной фиксации забуференными растворами 6% глютаральдегида и 1% четырехокиси осмия при +4С, причем добавление ДМСО не ускоряло процесса; применение твина-80 на качество фиксации не влияло. Дегидратацию фиксированных объектов вели серией спиртов и ацетоном. После обезвоживания часть образца отделяли для изучения в растровом электронном микроскопе TSM 50 А, для чего напыляли золотом. Другую часть заключали в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы для просмотра в трансмиссионном электронном микроскопе JEM 100 В делали стеклянными ножами на ультратоме LKB 8 200 А; контрастировали 30% спиртовым раствором уранилацетата и по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Для оптической микроскопии в целях предварительного изучения образца использовали плоские заливки толщиной до I мм с хорошо распределенным материалом. При работе на растровом электронном микроскопе использовали инструментальное увеличение от I 000 до 30 000; на просвечивающем электронном микроскопе - от б.000 до 100.000 раз. При измерениях величин на электроннограммах ультратонких срезов клеток применяли номограмму (Gbadially et al., 1981); измерение площадей фигур на фотографиях проводили при помощи планиметра.
. Результаты изучения культурально-морфологической изменчивости штаммов t.viride и t.haeziattom
Наблюдения за развитием культур штаммов 300 А и Б-ІО T.viride, 01 и ЯЮ T.harzianum при их поверхностном и погруженном выращивании позволили установить, что все исследованные штаммы осуществляли полный онтогенетический цикл на основе общей для них схемы вегетативного и репродуктивного развития (рис» 2), реализуемой в широком диапазоне условий. При этом установлено, что реакция исследованных штаммов на изменения окружающих условий носила одинаковый характер. Начальные этапы цикла развития - до стадии образования ростковых трубок включительно - проходили независимо от экзогенных источников питания и, по-видимому, в условиях-достаточной влажности обеспечивались за счет эндогенных субстратов. Для прохождения дальнейших онтогенетических этапов были необходимы экзогенные источники азота и углерода» Поскольку в их отсутствии развитие культур останавливалось после формирования ростковых трубок, а инициированные споры и проростки быстро теряли жизнеспособность, мы проанализировали распределение ядер в таких проростках» В подавляющем большинстве проросших спор и ростковых трубок, прекративших развитие, через 24 часа после начала инкубации отмечались необратимые дегенеративные изменения ядер, либо ядра обнаружить не удавалось» Это обстоятельство важно учитывать при хранении препарата "триходермин", поскольку при достаточной влажности не исключена возможность инициирования и прорастания составляющих его основу спор гриба, что в отсутствии условий для дальнейшего развития повлечет их быструю гибель»
Одним из наиболее ранних признаков, свидетельствовавших о начале прорастания, было заметное изменение типа и степени фазового контраста, выражавшееся в заметной потере конидиями рефрактильнос-ти» Вслед за этим, а часто и одновременно, отмечалось набухание конидий» При этом их размеры увеличивались до тех пор, пока диаметр не превышал исходный в среднем в 2,5 раза» Набухание заканчивалось появлением небольшого вздутия сбоку споры, которое обозначало место ростковой поры» Отсюда начиналось выдвижение ростковой трубки, которая завершала свое формирование через 7-Ю часов» Необходимо отметить, что по признакам потери рефрактильности и наличию набухания процесс прорастания удавалось зафиксировать через 1,5-4 часа после начала инкубации, т.е» гораздо раньше, чем по наличию проростка.
При прорастании в конидии различались вакуоль и единичные гранулы волютина; было отмечено быстрое исчезновение липидных капель» Деление ядра, по нашим наблюдениям, часто происходило с некоторым запаздыванием по отношению к выдвижению ростковой трубки,в результате чего в последней в течение нескольких часов не выявлялся ядерный материал»
Прорастание конидий происходило как поодиночке, так и в группах, В последнем случае ростковые трубки были направлены радиаль-но от центра группы (рис.3). Как правило, при групповом прорастании каждая спора образовывала лишь I ростковую трубку, тогда как вне группы в ряде случаев наблюдалось образование второго ростка. Его выдвижение всегда происходило не одновременно с первым, а с некоторым запозданием, и,как правило, начиналось в участке, диаметрально противоположном месту первоначальной ростковой поры. При наблюдениях за прорастанием спор в группах мы отмечали непроросшие конидии на стадии, когда ростковые трубки соседних были уже сформированы (рис.4). Прорастание конидий вне группы также было несинхронным. С течением времени процент проросших конидий возрастал, но ход этого процесса был различным. Ввиду неодновременности прорастания конидий мы сочли целесообразным сравнивать энергию их прорастания на основании учета времени, за которое 50% конидий образовывало ростковые трубки (ВПзд). Этот показатель использовали как критерий при сравнении популяций спор. Так, например, при прорастании на средах 5-5а и 19-19а он оказался минимальным для штамма 300 А и составлял в этом случае 10,5 часов, тогда как величина ВП о для штаммов Б-10, 01 и ЯЮ равнялась, соответственно, 12,5; 13 и 16 часам. Однако было замечено, что численные значения указанного показателя ВП зависели от предыдущих воздействий на споры, В частности, у конидий, подвергнутых предварительному высушиванию при 35G, ВП50 - период независимо от штаммовой принадлежности возрастал на 16-18 часов Таким образом, велчина ВП служила также своеобразным показателем глубины внешних воздействий, которым были подвергнуты споры микромицетов рода Trichoderma, и позволяла анализировать их последствия. В результате такого ана - 48 -лиза было, в частности, установлено, что задержка прорастания после высушивания спор связана с репарацией полученных клеткой повреждений и последующим обводнением ее до обычного уровня.
Нормально развивающийся проросток характеризовался густой цитоплазмой с сильной базофилией. В ростковой трубке отмечались высокая интенсивность окраски в реакциях на белок и присутствие нескольких гранул волютина. Клеточная стенка у формирующейся гифы становилась заметной спустя примерно 10 часов после начала прорастания. Это совпадало с концом периода развития, обеспечиваемого за счет эндогенных субстратов.
В ходе дальнейшего развития различия между штаммами проявлялись как в темпе прохождения этапов онтогенеза, так и в интенсивности осуществления каждого из них. Так, при погруженном выращивании на среде 19 штамм Б-10 быстрее остальных переходил к конидио-генезу, тогда как интенсивность последнего была значительно выше у штамма 01. На этапе вегетативного роста наибольшая скорость накопления биомассы отмечена у штамма 300 А.
После того, как ростковая трубка приобретала типичную гифаль-ную морфологию, начиналось разрастание мицелия. Разделение стволов гиф при первых ветвлениях опережало формирование септ. Ветвление носило как дихотомический, так и латеральный характер на гифах всех исследованных штаммов. Разрастание мицелия происходило очень быстро, и уже через 13-17 часов инкубации он был представлен системой гиф разного порядка, состоящих из изодиаметричес-ких клеток. Толщина гиф по мере удаления от центральной оси несколько уменьшалась, достигая у ответвлений 4 порядка приблизительно 60% диаметра главного ствола. Однако различие в толщине гиф разных порядков более отчетливо проявлялось при поверхностном выращивании, будучи часто нивелированным в глубинных культурах. Апикальные концы растущих гиф были заметно расширены и более рефрактильны по сравнению с прилежащими участками (рис, 5). Уже после появления первых перегородок в молодых гифах реакция на присутствие SH- групп становилась положительной, а ее интенсивность была наибольшей вблизи септ, Базофилия разрастающегося мицелия оставалась высокой, не теряла свою интенсивность реакция на белок, которая была особенно четкой вблизи растущих кончиков гиф. Волюти-новые гранулы присутствовали в клетках мицелия в различном количест ве, а ортохроматический характер их окрашивания был выражен в гифах значительно лучше по сравнению с предыдущими стадиями» Выявлялись капли липидных включений различного диаметра, среди которых, судя по характеру окрашивания, было много фосфолипидов, В клетках развивающегося мицелия вблизи апикальных частей гиф регистрировалось наибольшее число ядер (7-П), Конидии долгое время после прорастания сохраняли свой инициальный центр, в котором удавалось различить ядро. Оно представляло собой одно из ядер, которые образовались при первом делении ядра прорастающей споры. Другое ядро, переместившись в ростковую трубку, путем последующих делений обеспечивало рост мицелия, развившегося из ростковой трубки, функционирование инициальной части проросшей конидии, вероятно, было связано с оставшимся в ней ядром, поскольку через 12-18 часов после инокуляции можно было наблюдать его деление в случае появления второго проростка, вслед за чем происходило перемещение дочернего ядра в удлиняющуюся вторую ростковую трубку, В дальнейшем проросшая конидия нередко трансформировалась в клетку хламидо-спорового типа, которая к 20-22 часам инкубации приобретала характерную для последней морфологию (рис.6). Вероятно, оставшееся в ней ядро претерпевало еще несколько делений, поскольку такая спора часто становилась многоядерной. Процесс деления ядра в хламидо-споровых клетках нам зарегистрировать не удалось, однако косвенно
